Odsotnost Helicobacter pylori visoko tetraciklinski odporna 16S rDNA AGA926-928TTC genotip v želodčnih biopsijo iz dispeptičnimi bolnikih mesta v notranjosti Sao Paulo, Brazilija

Odsotnost Helicobacter pylori
visoko tetraciklinski odporna 16S rDNA AGA926-928TTC genotip v želodčnih biopsijo iz dispeptičnimi bolnikih mesta v notranjosti Sao Paulo, Brazilija
Abstract
Ozadje
uspešnosti zdravljenja Helicobacter pylori
razlikuje po regijah in po vsem svetu zmanjšuje, predvsem zaradi antibiotike odporno bakterijo. Tetraciklin je na splošno vključena v drugi vrstici H. pylori
shemah za izkoreninjenje. V Braziliji, je visoka stopnja odpornosti tetraciklin (Tetr) v glavnem povezana z AGA926-928TTC 16 S rDNA nukleotidnih zamenjav. Kot H. pylori
kulture je zahteven, smo raziskovali primarni pojav H. pylori
16 S rDNA visoki ravni Tetr genotip z uporabo molekularno pristop neposredno na želodcu biopsije v dispeptičnimi bolnikov, ki obiskujejo zaporedoma na Hospital das Clinicas v Marilia, São Paulo, Brazil.
Metode
želodca biopsijo osebke 68 peptičnega (PUD) in 327 bolnikih kronična gastritis (CG) s pozitivnim histološko diagnozo H. pylori
bile preiskane za Tetr 16 s rDNA genotip z molekulsko testu, ki temelji na pomnoževanje 16 s rekombinantno 545 bp fragment, ki ga polimerazno verižno reakcijo in Hinfl
dolžine restrikcijskih fragmentov polimorfizma (PCR /RFLP). Skozi ta testu AGA926-928TTC 16 S rDNA Tetr genotip povzročilo fragment omejitev vzorca treh DNK (281, 227 in 37 bp) in njena odsotnost je nastala dva fragmenti DNA (264 in 281 bp) je zaradi 16 S rDNA ohranjena Hinf I
omejitev stran.
Rezultati
545 bp 16 s rDNA PCR fragment smo pomnožili z 90% na želodcu biopsije iz histoloških H. pylori
pozitivnih bolnikih. Hinfl
RFLP pokazala odsotnost od AGA926-928TTC H. pylori
genotipov in PCR produktov dveh bolnikih, ki so pokazali, da ni ohranjena 16 S rDNA Hinfl
omejitev mestu. BLASTN analiza zaporedje štirih pomnožkov (dva ohranjena in dva z nepredvidenih Hinfl
omejitev vzorca) je pokazala 99% homologijo s H. pylori
16 S rDNA iz afriških, Severne in Južne Amerike bakterijskih izolatov. Nadomestitve nukleotidov odpravijo ohranjena Hinfl
restrikcijsko mesto v obeh PCR fragmentov z nepredvidenimi Hinfl
RFLP, kar EcoRI
omejitev mestu.
Sklepi
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA genov substitucije ni bilo mogoče najti v naši populaciji. je potrebnih več raziskav, da razišče, če je H. pylori
Tetr drugačno genetsko ozadje v naši regiji in če nukleotidov substitucije nekulturnih H. pylori
16 S rRNA delna zaporedja imajo biološki pomen.
Ključne besede
Helicobacter pylori
tetraciklin odpornost proti bakteriji Helicobacter pylori
16 s rDNA nukleinske kisline, ki temelji diagnoza Helicobacter pylori
16 s rDNA polimorfizma Ozadje
se je splošno sprejeto, da Helicobacter pylori
, na gram negativne mikroaerofilnih bakterije je povezana s številnimi boleznimi prebavnega trakta, kot sta kronični gastritis, peptični in dvanajstniku, raka želodca in Limfoproliferativna [1]. Ni standardizirana režim zdravljenja za H. pylori
okužbe [2] in ko je bakterija odkrita v spremenjeni želodčne sluznice, je navedeni zdravljenje sestoji iz režima trojno antibiotike, vključno z metronidazolom, klaritromicin, amoksicilin, tinidazola, tetraciklini in fluorokinolonov povezano z zaviralcem protonske črpalke kot so omeprazol, lansoprazol ali pantoprazol [3-5], v skladu z antibiotičnim politike recept za lokalne zdravstvene oskrbe.
H. pylori
stopnje eradikacije z več kombiniranimi zdravili in režimi, so skoraj 80% [6, 7], ki se razlikujejo od države do države in regionalno znotraj držav [8]. Številni dejavniki prispevajo k temu nizko stopnjo H. pylori
ran, vključno neučinkovitost antibiotika penetracije v želodčni sluznici, inaktivaciji antibiotika s strani izločanja želodčne kisline v želodcu [9], pomanjkanje skladnosti pacientov [10] in v glavnem, zadeve v sili in povečanje H. pylori
antibiotikom odpornih sevov [11]. Tako regionalnih H. pylori
nadzor odpornost je velikega pomena za strategije preskušanja in zdravljenja.
V Braziliji, državi, v kontinentalnih razsežnosti, večina prakticirajo zdravniki vključujejo tetraciklin v drugi režim zdravljenja linija po izpadu klasični trojni režim sestavi klaritromicina, amoksicilin in zaviralcem protonske črpalke sedem dni premagovanje H. pylori
okužbo [12].
H. pylori
odpornost na tetraciklin (Tetr) je v večini držav [13-15] nizka, nasprotno, v Latinski Ameriki, glede na majhno število raziskav je bilo dokazano, da je visoko v Čilu [16] in v Braziliji [17]. Poleg tega je že nekaj let narašča pojavnost Tetr [15, 18-21]. Zato je glede na klinično pomembnost primarnega H. pylori
odpornosti na antibiotike, je treba upoštevati, regionalno, preden se vključijo v shemah za izkoreninjenje.
Standardno metodo zlato za določitev H. pylori in vitro
dovzetnosti za antibiotiki ustreza izolacije mikroorganizma v kulturi. Vendar pa je zaradi počasne rasti in posebne zahteve H. pylori
kulture, ta pristop ni zanesljiva za uporabo v večini rutinskih kliničnih laboratorijih, predvsem v državah v razvoju. Zato je molekularni testi ciljajo povezanih z odpornostjo mutacije genov direktno iz biopsijo osebkov imajo potencial za uporabo v velikih raziskavah obsega [22-25].
Molekulsko mehanizem za Tetr sestoji iz vezavo na specifični 16 S rRNA regiji interakcijo stoically z aminoacil-tRNA transferazo na A strani ribosoma. To vezavno mesto je opredeljeno z atomsko ločljivostjo na ribosome v Thermus thermophilus
, ki nastanejo z dvema področij frakcije 16 S rRNA, ki sestoji iz vijačnice 34 in zanke ob vijačnice 31 [26, 27]. V H. pylori
izolatov, visoka stopnja Tetr je predvsem posledica treh osnovnih mutacij, od AGA926-928 za TTC, v 16 S rRNA genov rRNK /B [28, 29]. Mutacije v enem ali dveh od teh položajev za posledico nizko stopnjo Tetr [30, 31].
V Braziliji, so študije na bolnikih z Bragança Paulista, Sao Paulo, je pokazala, da so trojno AGA926-928 za TTC mutacij najdemo v vse Tetr H. pylori
izolatov [32]. Tako z uporabo molekularno pristop, ki temelji na verižni reakciji s polimerazo v povezan z dolžino restrikcijskih fragmentov polimorfizem (PCR-RFLP) testu smo raziskovali primarni pojavnost H. pylori
visoko stopnjo Tetr neposredno v želodčnih biopsijo primerkov dobljenih od pacientov dispeptičnimi predloženih na gastroskopijo na Hospital das Clinicas v Marilia, São Paulo, Brazilija, od januarja 2003 do julija 2006.
Rezultati in razprava
izid bolezni želodca od 1102 bolnikov, ki obiskujejo gastroenterologija ambulanto je v bolnišnici das Clínicas od marília je preiskoval endoskopijo in histopatologija. Endoskopsko ugotovitev peptične ali dvanajstnika, razjede bolezni (PUD) so bili prisotni pri 119 bolnikih. Različne stopnje kroničnega gastritisa (CG) so jih histopatologijo opazili pri 693 bolnikih, in druge spremembe, ki ustrezajo predvsem za gastroezofagealno refluksno bolezen (GERB) in normalno želodčne sluznice, so našli v 290 bolnikov. Nekateri bolniki predstavili več kot le ena sprememba, pri čemer je najbolj hudo patologijo upoštevati pri analizi.
Dokaz H. pylori
je bila izvedena neposredno iz biopsijo s histologijo, standard H. zlato pylori
diagnostični test zaposleni v naši klinični rutino, ki je skupaj s histopatološko analizo, ki se uporablja za odločitev za H. pylori
zdravljenja za izkoreninjenje. Od 119 PUD, 693 CG in 290 GERB vzorcev, 76, 359 in 2, oziroma, je bilo pozitivnih na H. pylori
s histologijo.
Ko zazna želodčne sluznice, klasična H. pylori
izkoreninjenje triple režim je predpisana v naših ambulantah gastroenterologija zdravstvenega varstva. Ko je prva izbira režim zdravljenja ne izkoreninjenje H. pylori
, druga vrstica režim, ki vsebujejo tetraciklin je najbolj primerni. H. pylori
antibiotik Tetr razlikuje po regijah, pri čemer je v Evropi in Severni Ameriki [2, 33, 34] zelo nizka. Vendar pa je v Aziji [15, 19, 35] in Latinski Ameriki, vključno z Brazilijo [16, 32], visoko stopnjo H. pylori
Tetr je bilo ugotovljeno. Tako, da bi izboljšali izbiro H. pylori PODJETJA
povezana zdravljenje bolezni, predvsem v primeru prvega neuspešno, smo raziskovali regionalno visoko stopnjo H. pylori
Tetr pomočjo molekulsko pristop, ki temelji na PCR in RFLP direktno iz istega želodčni biopsijo uporablja za hitri test sečnine. so bili vključeni le biopsije vzorce bolnikov s pozitivnim H. pylori
diagnozo, ki ga histologijo. 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR fragment smo dobili od 89,5% (68/76) in 91,1% (327/359) želodca biopsije iz PUD in CG bolnikov. Kot sta bila oba preskusi na enem in drugačnega želodca biopsijo in H. pylori
okužba predstavlja osrednja značilnost okužbe [36], da se izboljša občutljivost te metode, je večkratno vzorčenje biopsija priporočljivo.
Zaporedno, da bi za odkrivanje glavnih tem povezane točkovnih mutacij, AGA za TTC na položajih, 926, 927 in 928 na strani H. pylori
16. s rDNA, povezanih z visoko stopnjo Tetr in edinstveno genotipa, označen s brazilski Tetr H. pylori
izolatov [32] je 545 bp 16 s rDNA PCR fragment je bil omejen z Hinfl
. V tem H. pylori
16. S rekombinantno AMPLICON je ohranjena Hinfl
omejitveno mesto, ki določa notranjo kontrolo encimske prebave, ki izhaja v dveh DNA fragment omejitvi katerih vzorec, ko je trojni AGA926-928TTC nukleotidna substitucija odsoten. 395 PCR vzorcev, 393 predstavil dva DNA fragment restrikcijski vzorec in dve PCR izdelkov, pridobljenih iz PUD (Hp16S563Mar) bolnika in CG (Hp16S587bp) bolniku niso prebavi jih Hinfl
. visoko tetraciklin odporna AGA926-928TTC Genotip odvisna od H. pylori
16 S rDNA ni bil prisoten v naši populaciji. Ti rezultati so lahko znak H. pylori
visoki ravni Tetr odsotnosti ali da v naši regiji so drugi 16 S rDNA nukleotidnih zamenjav ali različnih genetskih dejavnikov, vključenih v tetraciklin odpornosti, kot tudi druge študije [21] je pokazala. Več raziskav, da je treba opraviti za potrditev ali izključitev te hipoteze.
Da se potrdi specifičnost 545 bp H. pylori
16 S rDNA PCR izdelkov ojačane iz želodca biopsije, je 545 bp PCR fragmentov, pridobljen iz dva H. pylori
bolnikov pozitivne PUD uporabljajo kot nadzora v PCR reakcije (Hp16S248Mar in Hp16S644Mar) in 545 bp PCR fragmentov z nepredviden Hinfl
omejitev vzorca imenom Hp16S563Mar in Hp16S587bp je bilo zaporedje in analizirali z osnovnim iskanjem BLASTN [ ,,,0],37]. Vse štiri sekvence predstavila 99% homologijo s 16 S rDNA iz zahoda in Južne Afrike, Južne in Severne ameriška H. pylori
izolatov. Mutacije točka najdemo v vsaki analizirali PCR zaporedje primerjavi s H. pylori
16 S rDNA referenčnih sekvenc, ki predstavljajo višjo homologijo dobljenih pomnožkov so povzeti v preglednici 1. Ukinitev tega Hinfl
omejitev mestu Hp16S563 in 587Mar povzročilo iz nukleotidov substitucijo na položaju 958, ki izvirajo iz EcoRI
omejitev mestu. Tako smo nukleotidna substitucije v teh 16 S 545 bt PCR fragmentov potrjena z EcoRI
restrikcijski analizi (podatki niso prikazani). Treba je raziskati biološki pomen nukleotidnih substitucij na voljo v naših 16 S nekulturnih H. pylori
PCR fragmentov. Tabela 1 Primerjava Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA nukleotidnih polimorfizmov med referencami in nekulturnih sevov bakterije
H. pyloristrain +
16 S rDNA nukleotidov pozicije #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA

GAATCC

T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA

GAATCC
A
T
T
C
G
EU544200USA
AGA

GAATCC

T
T
T
G
Puno /Peru
AGA

GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC

T
T
C

Hp16S644Mar
AGA

GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA

GAATTC

T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA

GAATTC
G
C
T
C
G
# temelji na H. pylori
reference sev 26995; + Številke pristopa H. pylori
zaporedja sevov za SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar in Hp16S567Mar so, in sicer: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 in Genbank. JQ315413]
sklepe
visoki ravni Tetr H. pylori
genotipa odvisne od AGA926-929TTC 16 S rDNA genov zamenjave ni bilo mogoče najti v naši populaciji. je potrebnih več raziskav, da razišče, ali je H. pylori
visoka stopnja Tetr odsoten ali če je povezana z drugim bakterijske genetsko ozadje v naši regiji. Tudi, biološki pomen od nepričakovanih nukleotidnih zamenjav v Marilia nekulturnih H. pylori
16 S rDNA delno zaporedje potrebuje nadaljnje preiskave.
Metode
Bolniki
1102 odraslih bolnikih s stalnim prebivališčem v Marilia mestu, São Paulo država, Brazilija, starih od 19 do 91 let, ki je imel zaporedno opravljeno esophagogastroduodenoscopy (EGD) za zgornji bolečine v trebuhu ali dispeptičnimi simptomi od januarja 2003 do julija 2006, ob gastroenterologija ambulanti je v bolnišnici das Clínicas od marília Medical School, so bili vključeni v to študija.
endoskopija, biopsija
EGD je bil dosežen s fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) ali video-endoskop (GIF-100), oba iz Olympus. Razjeda želodca ali dvanajstnika diagnoza je bila opredeljena z endoskopijo in dva fragmenti antruma so bili zbrani za izvedbo hitrega ureaze in histopatološke preiskave. Držalo se uporablja za preskus hitro ureaze je nadalje trdila, da ekstrakcijo DNK. Protokol uporabiti, je v dogovoru z Helsinške deklaracije in ga je odobrila etični odbor v humani raziskave iz Marilia Medical School, pod referenčno številko 388/01.
Histologija
One antralnih vzorcu je bila določena v raztopini s formalinom na 10% in vdelali v parafin. Oddelki so Giemsa obarvamo za H. pylori
ocenjevanja in smo obarvali z hematoxilin in eozinom za odmero histopatološke spremembe [38].
Ekstrakcijo DNK in verižno reakcijo s polimerazo
verižno reakcijo s polimerazo in restrikcijski analizi so bile ustanovljene z enako biopsija uporabljena za preskus hitre ureaze. To je bila predložena ekstrakcijo DNK z zaposlovanjem ekstrakcijo kompleta GFX DNK, kupljen pri Amersham /Pharmacia Biotech, po navodilih proizvajalca. DNA smo količinsko v agaroznem gelu z nizko Invitrogem množično lestev in 50-100ηg bile uporabljene v reakcijah PCR z začetnimi oligonukleotidi določenem Hp16Sr1 (smisel)): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', ki razširjajo ohranjena fragment 545 bp, ki ustreza H. pylori
16 S rRNK gena med nukleotidov pozicionira 700 in 1245 (oštevilčene glede na rRNA gena H. pylori
sev 26695), spremenjene z [32]. V vseh reakcijah PCR je bilo negativno in pozitivno kontrolo uporablja ustreza, oziroma sterilno vodo in dvema različnima sečnine H. pylori
pozitivne želodca biopsij pri bolnikih PUD. PCR pogoj je bil 94 ° C, 5 'čemur sledi 40 ciklov 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' in en cikel pri 72 ° C 7 ', s skupnim volumnom 25 ul, ki vsebuje 1x PCR buffer, 200 uM dNTP-jev, 2,0 mM MgCl 2, 1 jjM oligoHp16Sr1, 1 jjM oligo Hp16Sr2, 1.25 U Taq DNA polimerazo Platinum Brazilija (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNK. PCR produkt je bilo rešenih v 1,5% agaroznem gelu, obarvanih z etidijevim bromidom in fotografirali pod UV svetlobo.
Omejitev in analiza zaporedja
The 16 S rDNA 545 bt pomnožkov, dobljenih s PCR z biopsijo so razgradili z Hinf
I (Biolab - New England) v skladu z navodili proizvajalca. Predvidljivo omejitev vzorec za tetraciklinskih dovzetne H. pylori
sevov ustreza dvema fragmenti 264 in 281 bp in H. pylori
sevov z visoko odpornostjo na tetraciklin ustreza trije drobci 281, 227 in 37 bp. Izdelki iz restrikcijski analizi je bilo rešeno v 8% akrilamida geli, obarvanega z etidijevim bromidom in fotografirali pod UV svetlobo. 16 S rRNA 545 bp PCR amplikoni iz dveh H. pylori
pozitivne kontrole želodca biopsije (Hp16S248Mar in 644Mar) in obeh pomnožkov predstavljajo nepričakovane Hinf
omejitvah I vzorcev (Hp16S563Mar in Hp16S587bp) so bili predloženi s kronološkim zaporedjem z DyeTM Terminator v3.0 cikla zaporedja Ready Reaction kit in ABI-3100 stroj kupili od uporabno biosistemske, v skladu z navodili proizvajalca. Določitev nukleotidno zaporedje, ki je bila izvedena v dveh izvodih in primerjalne analize je opravil osnovne nukleotidov BLAST poravnavo [37] prispevki
avtorjeva
RBS in CMA izvajajo molekularnih študij in prispevala k pridobivanju in interpretaciji podatkov.; MAS zasnovan poskusov, prispevala k analizi podatkov in pripravila rokopis. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis
ugotavlja
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida prav tako prispevali k temu delu
Kratice
PUD..
Peptični
razjeda bolezen
CG:
Kronični gastritis
GERB:
gastroezofagealna refluksna bolezen
PCR:
verižno reakcijo s polimerazo
RFLP:
polimorfizmom dolžin restrikcijskih fragmentov
Tetr:
tetraciklin odpornost
.
IZJAVE
Priznanja
hvaležni smo dr Adriana Augusta Pimenta de Barros za njeno oskrbo na vseh bolnikov, vključenih v študijo, in dr David Howe za njegov prispevek pri izdaji rokopis jezik. To delo je podprl Fundação de Amparo Pesquisa storiti Estado de Sao Paulo (FAPESP), Research Grant 2006 /01223-0; Fellowship CMA 2005 /04087-7.
Nasprotujočimi si interesi
nimamo koli, naj ugotovi.

• Genomske spremembe in molekularne podvrste želodčnih raka v Asians
• Interobserver in intraobserver dogovor za želodčne sluznice atrofijo