Fravær av Helicobacter pylori høy tetracyklin motstandsdyktig 16S rDNA AGA926-928TTC genotype i mage snitt fra dyspepsi pasienter i en by i det indre av São Paulo, Brasil

Fravær av Helicobacter pylori
høy tetracyklin motstandsdyktig 16S rDNA AGA926-928TTC genotype i mage biopsiprøver fra dyspepsi pasienter i en by i det indre av São Paulo, Brasil
Abstract
Bakgrunn
Behandling effektiviteten av Helicobacter pylori
varierer regionalt og avtar over hele verden, hovedsakelig som et resultat av antibiotika resistente bakterier. Tetracycline er vanligvis inkludert i andre linje H. pylori
utrydding regimer. I Brasil er et høyt nivå av tetracyklin resistens (tetra) hovedsakelig knyttet AGA926-928TTC 16 S rDNA nukleotidsubstitusjoner. Som H. pylori
kultur er kresen, vi undersøkte den primære forekomsten av H. pylori
16 S rDNA høyt nivå tetra genotype ved hjelp av en molekylær tilnærming direkte på mage biopsi av dyspepsi pasienter deltar fortløpende på Hospital das Clinicas av Marilia, São Paulo, Brasil.
Metoder
Gastric biopsiprøver av 68 mavesår (PUD) og 327 kronisk gastritt (CG) pasienter med positiv histologisk diagnose av H. pylori
ble undersøkt for tetra 16 S rDNA genotype gjennom en molekylær analyse basert på amplifikasjon av en 16 S rDNA 545 bp-fragmentet av polymerase kjedereaksjon og Hinfl
rflp (PCR /RFLP). Gjennom dette assay, AGA926-928TTC 16 S rDNA tetra genotype resulterte i en tre DNA-fragment restriksjonsmønster (281, 227 og 37 bp) og dens fravær stammer fra to DNA-fragmenter (264 og 281 bp) på grunn av en 16 S rDNA konservert Hinf I
restriksjonssete.
Resultater
545 bp 16 S rDNA PCR fragmentet ble forsterket fra 90% av mage biopsier fra histologiske H. pylori
positive pasienter. Hinfl
RFLP avdekket fravær av AGA926-928TTC H. pylori
genotype og PCR-produkter av to pasienter viste fravær av konservert 16 S rDNA Hinfl
restriksjonssetet. BLASTN sekvensanalyse av fire amplikonene (to konservert og to med en uforutsette Hinfl
restriksjonsmønster) viste en 99% homologi til H. pylori
16 S rDNA fra afrikanske, Nord- og Sør-Amerika bakterielle isolater. En nukleotidsubstitusjon avskaffet konservert Hinfl
restriksjonssete i de to PCR-fragmenter med uforutsette Hinfl
RFLP, noe som resulterer i en EcoRI
restriksjonssete.
Konklusjoner
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA genet erstatninger ble ikke funnet i vår befolkning. Mer forskning er nødvendig for å undersøke om H. pylori
tetra har en annen genetisk bakgrunn i vår region, og hvis de nukleotidsubstitusjoner av ukultur H. pylori
16 S rRNA delvis sekvenser har biologisk betydning.
Nøkkelord
Helicobacter pylori
Tetracycline motstand Helicobacter pylori
16 S rDNA nukleinsyre-basert diagnose Helicobacter pylori
16 S rDNA polymorfisme Bakgrunn
Det er allment akseptert at Helicobacter pylori
, en Gram negative mikroaerofile bakterien , er forbundet med flere fordøyelseskanalen sykdommer som kronisk magekatarr, magesår og duodenalsår, magekreft og lymfoproliferative sykdommer [1]. Det finnes ingen standardisert behandlingsregime for H. pylori
infeksjon [2], og når bakterien påvises i endrede mageslimhinnen, den indikerte behandling består av en trippel antibiotika regime med metronidazol, klaritromycin, amoxicillin, tinidazole, tetracyklin og fluorokinoloner forbundet med en protonpumpehemmer som omeprazol, lansoprazol eller pantoprazol [3-5], ifølge antibiotika reseptbelagte reglene for lokal medisinsk behandling.
H. pylori
eradikasjonsrate med et antall kombinerte midler og regimer er nær 80% [6, 7], varierende fra land til land og regionalt innen land [8]. Flere faktorer bidrar til denne lave frekvensen av H. pylori
helbredelse herunder ineffektiviteten av antibiotikumet penetrasjon i mageslimhinnen, inaktivering av antibiotikumet av syresekresjon i magen [9], mangel på pasientens etterlevelse [10] og hovedsak, nødstilfeller og økning i H. pylori
antibiotikaresistente stammer [11]. Dermed er regional H. pylori
motstand overvåking av stor betydning for test- og behandlingsstrategier.
I Brasil, et land av kontinentale dimensjoner, flertallet av praktiserende klinikere inkluderer tetracyklin i en annen linje behandlingsregime etter svikt i klassisk trippelregime bestående av claritromycin, amoxicillin og en protonpumpehemmer i sju dager for å overvinne H. pylori
infeksjon [12].
H. pylori
resistens overfor tetracyklin (tetR) er lav i de fleste land [13-15] omvendt, i Latin-Amerika, i henhold til et lite antall studier har det vist seg å være høy i Chile [16] og i Brasil [17]. Dessuten, i noen år forekomsten av tetra har vært økende [15, 18-21]. Følgelig, tatt i betraktning den kliniske viktigheten av primær H. pylori
resistens mot antibiotika, bør det tas i betraktning regionalt før de blir inkludert i utrydding regimer.
Gullstandardmetoden for bestemmelse av H. pylori in vitro
følsomhet overfor antibiotika svarer til isolering av mikroorganismen av kulturen. Men på grunn av den langsomme vekst og de spesielle kravene til H.pylori
kultur, er denne metode ikke er pålitelig for anvendelse i de fleste rutinemessige kliniske laboratorier, i hovedsak i utviklingsland. Derfor molekylære tester rettet mot resistens forbundet genmutasjoner direkte fra biopsiprøver har potensial for bruk i store studier [22-25].
Molekylære mekanismen av tetra består av binding til en bestemt 16 S rRNA-regionen, i samspill stoisk med aminoacyl-tRNA transferase til et område av ribosomet. Dette bindingssete er blitt definert ved atom-oppløsning i ribosomer av Thermus thermophilus
er dannet av to domener av 16 S-rRNA fraksjon bestående av spiralen 34 og løkken ved siden av helix 31 [26, 27]. I H. pylori
isolater, er den høye grad av tetra hovedsakelig på grunn av tre basis mutasjoner, fra AGA926-928 til TTC, i de 16 S-rRNA-gener rRNA /B [28, 29]. Mutasjoner i en eller to av disse stillingene resultere i et lavt nivå av tetra [30, 31].
I Brasil studier utført på pasienter fra Bragança Paulista, São Paulo, viste at trippel AGA926-928 til TTC mutasjoner er funnet i alle tetra H. pylori
isolater [32]. Således, ved å bruke en molekylær tilnærming basert på en polymerase-kjedereaksjon forbundet med rflp (PCR-RFLP) -analyse, undersøkte vi den primære forekomst av H. pylori
høyt nivå Tetr direkte i mavebiopsiprøver oppnådd fra pasienter dyspeptiske innsendte til gastroskopi på Hospital das Clinicas av Marilia, São Paulo, Brasil, fra januar 2003 til juli 2006.
Resultater og diskusjon
Gastric sykdom utfallet av 1102 pasienter deltar på gastroenterologi poliklinikken Hospital das Clínicas av Marília ble undersøkt ved endoskopi og histopatologi. Endoskopisk funn av peptisk eller duodenalsår sykdom (PUD) var til stede i 119 pasienter. Forskjellige grader av kronisk gastritt (CG) ble observert ved histopatologi i 693 pasienter og andre endringer som svarer for det meste til gastroøsofageal reflukssykdom (GERD) og normal gastrisk mucosa, ble funnet i 290 pasienter. Noen pasienter presenterte mer enn en endring, med de mest alvorlige sykdomslære blir vurdert i analysen.
Påvisning av H. pylori
ble utført direkte fra biopsiprøver av histologi, gullstandarden H. pylori
diagnostisk test ansatt i vår kliniske rutine som sammen med histopatologiske analyse brukes til å bestemme for H. pylori
eradikasjonsbehandling. Av 119 PUD, 693 CG og 290 GERD prøver, 76, 359 og 2, henholdsvis, var positive for H. pylori
av histologi.
Når oppdaget i mageslimhinnen, en klassisk H. pylori
utrydding trippel diett er foreskrevet i våre gastroenterologi helseklinikker. Når førstevalg diett terapi ikke klarer å utrydde H. pylori
, er en annen linje diett som inneholder tetracyklin mest indikert. H. pylori
antibiotika tetra varierer regionalt, blir svært lav i Europa og Nord-Amerika [2, 33, 34]. Men i Asia [15, 19, 35] og Latin-Amerika, inkludert Brasil [16, 32], en høy grad av H. pylori
tetra har blitt funnet. Derfor, for å forbedre valg av H. pylori
assosiert sykdom terapi, hovedsakelig i tilfelle av første utrydding svikt, undersøkte vi det regionale høyt nivå av H. pylori
tetra ved hjelp av en molekyl tilnærming basert på PCR og RFLP direkte fra den samme gastrisk biopsi anvendes for hurtig urease test. Bare biopsiprøver fra pasienter med positiv H. pylori
diagnose ved histologi ble inkludert. En 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR fragmentet ble hentet fra 89,5% (68/76) og 91,1% (327/359) av mage biopsier fra PUD og CG pasienter. Som begge tester ble utført på en enkelt og forskjellig gastrisk biopsi og H. pylori-infeksjon
presenterer en fokal karakteristisk for infeksjon [36], for å forbedre følsomheten av denne metoden blir multiple biopsi sampling anbefalt.
Sekvensielt, i rekkefølge for å detektere de store tilhørende punktmutasjoner, AGA TTC til ved stillingene 926, 927 og 928 av H. pylori
16 S rDNA forbundet med et høyt nivå av Tetr, og en unik genotype karakterisert ved brasiliansk tetra H. pylori
isolerer [32], den 545 bp 16 S rDNA PCR-fragmentet ble begrenset med Hinfl
. I denne H. pylori
16 S rDNA-amplikon det er et konservert Hinfl
restriksjonssete, noe som gir en intern kontroll av enzymoppslutning, noe som resulterer i en to-DNA-fragment restriksjonsmønster, når trippel AGA926-928TTC nukleotidsubstitusjon er fraværende. Av 395 PCR prøvene, 393 presenterte de to DNA fragment restriksjonsmønster og to PCR-produkter som kommer fra en PUD (Hp16S563Mar) pasient og en CG (Hp16S587bp) Pasienten ble ikke fordøyd av Hinfl
. Den høye tetracyklin motstandsdyktig AGA926-928TTC genotype avhengig av H. pylori
16 S rDNA var ikke til stede i vår befolkning. Disse resultatene kan være en indikasjon på H. pylori
høyt nivå tetra fravær eller som i vår region andre 16 S rDNA nukleotidsubstitusjoner eller ulike genetiske faktorer er involvert i tetracyklin resistens, som funnet av andre studier [21]. Mer forskning må være gjennomført for å bekrefte eller utelukke disse hypotesene.
For å bekrefte spesifisiteten av 545 bp H. pylori
16 S rDNA PCR produktene forsterket fra mage biopsier, de 545 bp PCR-fragmenter hentet fra to H. pylori
positive PUD pasienter som benyttes som kontroller i PCR-reaksjoner (Hp16S248Mar og Hp16S644Mar), og de 545 bp PCR-fragmenter med uforutsette Hinfl
restriksjonsmønster heter Hp16S563Mar og Hp16S587bp, ble sekvensert og analysert ved hjelp av enkle, BLASTN søk [ ,,,0],37]. Alle fire sekvenser presenteres 99% homologi til 16 S rDNA fra Vest og Sør-Afrika, Sør- og Nord-Amerika H.pylori
isolater. Punktmutasjonene som finnes i hver analyserte PCR-sekvensen sammenlignet med H. pylori
16 S rDNA referansesekvenser som presenterer høyere homologi til de oppnådde amplikonene er oppsummert i tabell 1. Avvikling av Hinfl
restriksjonssetet av Hp16S563 og 587Mar resulterte fra et bytte nukleotid i posisjon 958, med opprinnelse i en EcoRI
restriksjonssete. Således ble de nukleotidsubstitusjoner i disse 16 S 545 bp PCR-fragmenter bekreftet ved EcoRI
restriksjonsanalyse (data ikke vist). Den biologiske betydningen av nukleotidsubstitusjoner funnet i våre 16 S ukultur H. pylori
PCR fragmenter trenger å bli undersøkt. Tabell 1 Sammenligning av Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA nukleotid polymorfismer blant referanser og ukultur bakterien stammer
H. pyloristrain +
16 S rDNA nucleotide posisjoner #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
A
GAATCC
En
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
A
GAATCC
A
T
T
T
G
Puno /Peru
AGA
A
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
A
T
T
C
A
Hp16S644Mar
AGA
A
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
A
GAATTC
A
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
A
GAATTC
G
C
T
C
G
# basert på H. pylori
referanse belastning 26995; + Deponeringsnummer av H. pylori
sekvens stammer for SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar og Hp16S567Mar er henholdsvis: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 og Genbank. JQ315413]
Konklusjoner
høyt nivå tetra H. pylori
genotype avhengig AGA926-929TTC 16 S rDNA genet erstatninger ble ikke funnet i vår befolkning. Mer forskning er nødvendig for å undersøke om H. pylori
høy hastighet tetra er fraværende, eller hvis det er forbundet med en annen bakterie genetisk bakgrunn i vår region. Også den biologiske betydningen av uforutsette nukleotidsubstitusjoner i Marilia ukultur H. pylori
16 S rDNA delsekvens trenger videre etterforskning.
Metoder
Pasienter
1102 voksne pasienter bosatt i Marilia by, São Paulo stat, ble Brasil, i alderen 19 til 91 år, som hadde fortløpende gjennomgått esophagogastroduodenoscopy (EGD) for øvre magesmerter eller dyspepsi symptomer fra januar 2003 til juli 2006 i en gastroenterologi poliklinikk på sykehuset das Clínicas av Marília Medical School, innrullert i denne studie.
Endoskopi, biopsier
EGD ble oppnådd ved fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) eller video-endoskop (GIF-100) begge fra Olympus. Gastrisk eller duodenal ulcus diagnose ble definert ved endoskopi og to fragmenter av antrum ble oppsamlet for å utføre den hurtige urease og histopatologiske prøver. Biopsi anvendes for hurtig urease testen ble videresendt DNA-ekstraksjon. Protokollen som brukes er i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Etisk Komité i Human Forskning fra Marilia Medical School, med referanse nummer 388/01.
Histologi
One antrum prøven ble løst i formol løsning på 10% og dyppet i parafin. Seksjoner ble Giemsa farget for H. pylori
evaluering og ble farget med hematoksylin og eosin for vurdering av histopatologiske forandringer [38].
DNA-ekstraksjon og Polymerase kjedereaksjon
Polymerase kjedereaksjon og restriksjonsanalyse ble satt opp med den samme biopsi som brukes for rask urease test. Dette ble sendt til DNA-ekstraksjon med ansettelse av gfx DNA-ekstraksjon kit kjøpt fra Amersham /Pharmacia Biotech, etter produsentens anvisninger. DNA ble kvantifisert i agarosegel-elektroforese ved bruk av Invitrogem liten masse stige og 50-100ηg ble brukt i PCR-reaksjonene med primersett Hp16Sr1 (sense),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', som forsterker en konservert fragment på 545 bp som tilsvarer den H.pylori
16 S rRNA-genet mellom nukleotidposisjoner 700 og 1245 (nummerert ifølge rRNA-genet av H. pylori
belastning 26695), modifisert fra [32]. I alle PCR-reaksjonene en negativ og en positiv kontroll ble anvendt svarende til henholdsvis sterilt vann og to forskjellige urease H. pylori
positive gastriske biopsier fra pasienter PUD. PCR tilstand var 94 ° C 5 'etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' og en syklus ved 72 ° C 7 ', med et totalvolum på 25 ul som inneholdt 1 x PCR buffer, 200 uM dNTP, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1 uM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA polymerase platina Brasil (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. PCR-produktene ble løst i 1,5% agarosegeler farget med etidiumbromid og fotografert under UV-lys.
Restriksjons og sekvensanalyse
De 16 S rDNA 545 bp amplikonene oppnådd ved PCR fra biopsiprøver ble fordøyd med Hinf
i (biolab - New England) i henhold til produsentens instruksjoner. Den forutsigbare restriksjonsmønster for tetracyklin mottakelige H. pylori
stammer tilsvarer to fragmenter av 264 og 281 bp og for H. pylori
stammer med høy tetracyklin resistens tilsvarer tre fragmenter av 281, 227 og 37 bp. Produktene av restriksjonsanalyse ble løst i 8% akrylamidgeler, farget med etidiumbromid og fotografert under UV-lys. 16 S rRNA 545 bp PCR amplikonene fra de to H. pylori
positiv kontroll mage biopsier (Hp16S248Mar og 644Mar) og de to amplikonene presentere uventede Hinf
jeg restriksjonsmønstre (Hp16S563Mar og Hp16S587bp) ble sendt til sekvensering med DyeTM Terminator v3.0 syklus Sekvense Klar Reaction kit og en ABI-3100 maskin kjøpt fra Applied Biosystems, i henhold til produsentens instruksjoner. Nucleotidsekvensbestemmelse ble utført i duplikat og komparativ analyse ble utført av grunnleggende nucleotide BLAST justering [37]
Kunstner bidrag
RBS og CMA utført de molekylære studier og bidratt til innsamling og tolkning av data.; MAS designet forsøkene bidro til dataanalyse og utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet
Merknader
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida bidratt likt til dette arbeidet
Forkortelser
PUD..
Mavesår

CG:
Kronisk gastritt
GERD:
gastroøsofageal reflukssykdom
PCR:
Polymerase kjedereaksjon
RFLP:
rflp
tetra:
Tetracycline motstand
.
Erklæringer
Takk
Vi er takknemlige til Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros for hennes omsorg til alle pasienter inkludert i studien og Dr. David Howe for hans bidrag i den utgaven av manuskriptet språk. Dette arbeidet ble støttet av Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), stipend 2006 /01223-0; Fellowship CMA 2005 /04087-7.
Konkurrerende interesser
Vi har noe å fortolle.

• Genomiske forandringer og molekylære undergrupper av mage kreft i asiater
• Interobserver og intraobserver avtale om mageslimhinnen atrophy