Odsustvo Helicobacter pylori visoke tetraciklina otporan 16S rDNA AGA926-928TTC genotip u želučanim uzorka biopsije od dispeptičkih bolesnika grada u unutrašnjosti São Paulo, Brazil

bez prisustva Helicobacter pylori
visoku tetraciklin otporan 16S rDNA AGA926-928TTC genotip u želučanoj biopsiji uzoraka od dispeptičkih pacijenata nekog grada u unutrašnjosti Sao Paulo, Brazil pregled Sažetak
Pozadina
učinkovitost liječenja Helicobacter pylori
varira regionalno i opada u cijelom svijetu, uglavnom kao rezultat otpornih na antibiotike bakterija. Tetraciklin općenito je uključena u drugom redu H. pylori pregled iskorjenjivanja režimima. U Brazilu, visoka razina otpora tetraciklin (Tctr), uglavnom je povezana sa AGA926-928TTC 16 S rDNA nukleotidnih supstitucija. Kao H. pylori pregled kultura je zahtjevan, istražili smo primarna pojava H. pylori
16 S rDNA visoku razinu Tctr genotip pomoću molekularno pristup izravno na želučanih biopsija dispeptičkih pacijenata koji pohađaju uzastopno u bolnici das Clinicas od marilia, Sao Paulo, Brazil.
Metode
želučane uzorka biopsije 68 peptičkog ulkusa (pud) i 327 kronični gastritis (CG) bolesnika s pozitivnom histološkom dijagnozom H. pylori
su pod istragom zbog Tctr 16 s rDNA genotip kroz molekulske eseja koji se osniva na amplifikaciju 16 S rDNA 545 bp fragment je lančanom reakcijom polimeraze i HinfI pregled polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata (PCR /RFLP). Po ovoj analizi, AGA926-928TTC 16 S rDNA Tetr genotip rezultirao tri DNA fragment restrikcijskom uzorak (281, 227 i 37 bp) i njegov nedostatak potječe dva fragmenta DNA (264 i 281 bp) zbog 16 S rDNA konzervirani Hinf I pregled ograničenje stranica. pregled Rezultati
545 bp 16 s rDNA PCR fragment je pojačan s 90% želučanih biopsija iz histoloških H. pylori pregled pozitivnih bolesnika. HinfI pregled RFLP otkrila odsustvo od AGA926-928TTC H. pylori
genotipa i fragmente dva bolesnika pokazala odsutnost od sačuvane 16 S rDNA HinfI pregled ograničenja mjestu. BLASTN analiza sekvenci četiri amplikona (dva konzervirana i dvije s nepredviđenog HinfI
ograničenje uzorak) otkrila homologije 99% na H. pylori
16 S rDNA iz Afrike, Sjeverne i Južne Amerike bakterijskih izolata. Supstitucije nukleotida ukinula konzervirani HinfI pregled restrikcije u dva PCR fragmenti s nepredviđenih HinfI pregled, RFLP, što je rezultiralo u Eco pregled restrikcije. Pregled Zaključci
H. pylori pregled AGA926- 928TTC 16 S rDNA gena zamjene nisu pronađene u našoj populaciji. Više istraživanja je potrebno da se ispita H. pylori pregled Tctr ima drugačiji genetski pozadinu u našoj regiji, a ako nukleotidnih supstitucija na nekulturni H. pylori
16 S rRNA parcijalne imaju biološki značaj.
Ključne riječi
Helicobacter pylori pregled rezistenciju na tetraciklin Helicobacter pylori pregled 16 S rDNA nukleinske kiseline temelji dijagnostika Helicobacter pylori
16 S rDNA polimorfizma Pozadina pregled Opće je prihvaćeno da Helicobacter pylori pregled, gram negativne bakterije microaerophilic , povezana je s nekoliko oboljenja probavnog trakta, kao što su kronični gastritis, želučani i duodenalni ulkus, karcinom želuca i limfoproliferativnih poremećaja [1]. Ne postoji standardizirana Režim tretmana za H. pylori pregled infekcije [2], a jednom je bakterija otkrivena je u izmijenjenom želučane sluznice, navedena liječenje se sastoji od trostrukog antibiotske režim, uključujući metronidazol, klaritromicin, amoksicilin, tinidazola, tetraciklina i fluorokinolona povezan s inhibitorom protonske pumpe kao što su omeprazol, lansoprazol ili pantoprazola [3-5], prema antibiotike politika recept za lokalnu medicinsku skrb.
H. pylori pregled iskorjenjivanja stope s brojnim kombiniranim agenata i režimima su blizu 80% [6, 7], koji varira od zemlje do zemlje i regionalno unutar zemalja [8]. Nekoliko čimbenika pridonose tom niskom stopom H. pylori pregled ozdravljenje uključujući neučinkovitosti antibiotika penetracije u sluznici želuca, inaktivaciju antibiotika od strane lučenje kiseline u želucu [9], nedostatak poštivanja pacijenta [10] i uglavnom, hitne slučajeve i povećanje H. pylori pregled antibiotike rezistentnih sojeva [11]. Dakle, regionalni H. pylori pregled, nadzor otpor je od velike važnosti za testiranje i tretman strategije.
U Brazilu, zemlji kontinentalnih dimenzija, većina praktičara kliničara uključiti tetraciklin u drugom režimu linija liječenja nakon neuspjeha od klasična trostruki režim sastoji se od claritromycin, amoksicilina i inhibitora protonske pumpe za sedam dana u prevladavanju H. pylori pregled infekcija [12].
H. pylori pregled, otpornost na tetraciklin (Tctr) je niska u većini zemalja [13-15], s druge strane, u Latinskoj Americi, prema malom broju istraživanja, pokazalo se da se visoko u Čileu [16], a u Brazilu [17]. Osim toga, za nekoliko godina učestalost Tctr je u porastu [15, 18-21]. Prema tome, s obzirom na kliničke važnosti primarnog H. pylori pregled, otpornost na antibiotike, to treba uzeti u obzir regionalno prije uvrštenja u iskorjenjivanja režimima.
Zlatni standard metoda za određivanje H. pylori in vitro
podložnost antibiotici odgovara izolaciju mikroorganizama pomoću kulture. Međutim, zbog sporog rasta i posebnim zahtjevima H. ​​pylori pregled, kulture, takav pristup nije pouzdan za uporabu u većini rutinskih kliničkih laboratorija, prvenstveno u zemljama u razvoju. Stoga molekularna ispitivanja ciljanja otpornosti koje su povezane mutacije gena izravno iz uzorka biopsije imaju potencijal za uporabu u velikim studijama razmjera [22-25].
Molekularni mehanizam Tetr sastoji od vezanja na određeni 16 S rRNA području, interakcije stoički s aminoacil-tRNA-transferaze na A mjesto ribosoma. Ovaj vezanja je definirana atomskom rezolucije u ribosoma od Thermus thermophilus pregled koji se sastoje od dva područja 16 S rRNA frakcije koja se sastoji od spirale 34 i petlje do Helix 31 [26, 27]. U H. pylori pregled izolata, visok stupanj Tctr je uglavnom zbog tri bazne mutacija, od AGA926-928 na TTC, u 16 S rRNA gena rRNA /B [28, 29]. Mutacije u jedan ili dva od tih pozicija rezultira niskom razinom Tctr [30, 31].
U Brazilu, istraživanja provedena na pacijentima iz Bragança Paulista, Sao Paulo, pokazalo je da triple AGA926-928 da TTC mutacije se mogu naći u sve Tctr H. pylori pregled izolati [32]. Prema tome, korištenjem molekulske pristupa temeljenog na lančanom reakcijom polimeraze koja je povezana s polimorfizma duljine restrikcijskih fragmenata (RFLP PCR) testu ispitivana primarni učestalost H.pylori
visoku Tetr izravno u želučanim uzoraka biopsije dobiven od dispeptičkih pacijenata podnesene da gastroskopija u bolnici das Clinicas od marilia, São Paulo, Brazil, od siječnja 2003. do srpnja 2006. | Rezultati i rasprava
ishod želučani bolesti od 1102 pacijenata koji pohađaju gastroenterologija ambulanti u bolnici das Clínicas od marilia je istragom endoskopija i patološka histologija. Endoskopska nalaz peptičkog ili duodenalni ulkus bolest (pud) bili su prisutni u 119 pacijenata. Različiti stupnjevi kronični gastritis (CG) uočene su histopatologijom u 693 bolesnika i ostale promjene koje odgovaraju uglavnom na gastroezofagealni refluks (GERD) i normalne sluznice želuca, pronađeni su u 290 bolesnika. Neki pacijenti predstavili više od jedne izmjene, s najtežom vrstom patologije se uzeti u obzir u analizi. Pregled Otkrivanje H. pylori pregled je izvedena izravno iz uzorka biopsije po histologiju, zlatni standard H. pylori pregled dijagnostički test zaposleni u našoj kliničkoj rutini, koji zajedno sa patohistološku analizu se koristi da se odluči za H. pylori pregled uspješnosti terapije. Od 119 pud, 693 CG i 290 Gerd uzoraka, 76, 359 i 2, odnosno, bili su pozitivni na H. pylori
prema histologiju.
Nakon što je otkriven u sluznici želuca, klasična H. pylori pregled iskorjenjivanje triple režim je propisano u našim klinikama gastroenterologija zdravstvene zaštite. Kada je prvi izbor režim terapija ne iskorijeniti H. pylori
, drugi red režim sadrži tetraciklin je najviše naznačeno. H. pylori pregled antibiotik Tctr varira regionalno, što je vrlo niska u Europi i Sjevernoj Americi [2, 33, 34]. Međutim, u Aziji [15, 19, 35] i Latinskoj Americi, uključujući Brazil [16, 32], visokom stopom H. pylori
Tctr je pronađen. Stoga, kako bi se poboljšala izbor H. pylori
povezana terapija bolesti, prvenstveno u slučaju prvog iskorjenjivanja neuspjeha, istražili smo regionalnu visok stupanj H. pylori
Tctr pomoću molekularno pristup koji se temelji na PCR i RFLP od istog želuca biopsije koristi za brzo ispitivanje ureaze. uključene su samo uzorci biopsije iz bolesnika s pozitivnim H. pylori pregled, dijagnozu histologiju. 545 bp H. pylori pregled 16SrDNA PCR fragment je dobiven od 89,5% (68/76) i 91,1% (327/359) želučanih biopsija iz pud i CG pacijenata, respektivno. Kako su oba ispitivanja provedena na pojedinačnom i drugu želuca biopsija i H. pylori infekcije pregled predstavlja žarišnu karakteristiku infekcije [36], kako bi se poboljšala osjetljivost ove metode, multiple uzorkovanja biopsija se preporučuje. Pregled uzastopno kako otkriti glavne povezane točkaste mutacije, AGA u TTC na položajima 926, 927 i 928 od Helicobacter pylori pregled 16 s rDNA povezanih s visokom razinom Tetr i jedinstveni genotip naznačen Brazilian Tetr H. pylori
izolira [32] je 545 bp 16 s rDNA PCR fragment je ograničen s HinfI Netlogu. U ovom H.pylori pregled 16 S rDNA amplikona postoji očuvan HinfI pregled restrikcijsko mjesto, što pruža unutarnju kontrolu enzimima, što rezultira u dvije DNA fragment restrikcijskom uzorak kada trostruka AGA926-928TTC supstitucije je odsutan. 395 PCR uzoraka, 393 predstavio dva fragmenta DNA, obrazac restrikcije i dva PCR produkte dobivene iz pud (Hp16S563Mar) pacijenta i CG (Hp16S587bp) pacijent ne probavljaju HinfI Netlogu. Visoka tetraciklin otporan AGA926-928TTC genotip ovisna o H. pylori
16 S rDNA nije bio prisutan u našoj populaciji. Ovi rezultati mogu biti indikativni H. pylori
visokoj razini Tctr odsutnosti ili da u našoj regiji su ostali 16 S rDNA nukleotida zamjene ili različiti genetski faktori koji su uključeni u tetraciklin otpora, kako se javlja s drugim znanstvenim istraživanjima [21]. Više istraživanja je da se provodi kako bi se potvrditi ili isključiti ove hipoteze.
Da bi potvrdili specifičnost H. 545 bp pylori pregled 16 S rDNA PCR produkti umnoženi iz želučanog biopsija, a 545 bp fragmenti dobiveni iz dva H.pylori
pozitivnih pacijenata prednja šapa koriste se kao kontrola u PCR reakcijama (Hp16S248Mar i Hp16S644Mar), te 545 bp fragmenti s nepredviđen HinfI pregled restrikcijske uzorak nazvan Hp16S563Mar i Hp16S587bp a, su sekvencirani i analizirani pomoću osnovne pretrage BLASTN [ ,,,0],37]. Sva četiri sekvence prezentirani 99% homologije s 16 S rDNA iz zapadne i južne Afrike, Južne i Sjeverne Amerike H. pylori pregled izolata. U točkaste mutacije pronađene u svaki analizirani PCR sekvenca u usporedbi s H. pylori pregled 16 S rDNA referentne sekvence predstavljaju veći homologije s dobivenim amplikonima sažeto su prikazani u tablici 1. ukidanje HinfI pregled ograničenja mjestu Hp16S563 i 587Mar rezultiralo od nukleotida supstitucije na položaju 958, podrijetlom iz Eco pregled ograničenja mjestu. Tako, nukleotidni supstitucije u tim 16 S 545 bp PCR fragmenata potvrđeni su pomoću EcoRI pregled restrikcijskom analizom (podaci nisu prikazani). Biološki značaj nukleotidnih supstitucija pronaći u našim 16 S nekulturni H. pylori
fragmenti treba istražiti. Tablica 1. Usporedba Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA polimorfizama među referencama i nekulturni sojeva bakterija pregled H. pyloristrain +
16 S rDNA nukleotida pozicije #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07 pregled AGA pregled pregled GAATCC pregled pregled T pregled T pregled C
G pregled 2017WestAfrica pregled AGA pregled pregled GAATCC
A pregled T pregled T pregled C
G pregled EU544200USA pregled AGA pregled pregled GAATCC pregled pregled T pregled T pregled T pregled G pregled Puno /Peru pregled AGA pregled pregled GAATCC pregled G pregled C
T pregled C
G pregled Hp16S248Mar pregled AGA pregled G pregled GAATCC pregled pregled T pregled T pregled C pregled pregled Hp16S644Mar pregled AGA pregled pregled GAATCC pregled A
T pregled G pregled C
G pregled Hp16S563Mar pregled AGA pregled pregled GAATTC pregled pregled T pregled T pregled T pregled G pregled Hp16S587Mar pregled AGA pregled pregled GAATTC pregled G pregled C
T pregled C
G pregled # temelji na H. pylori pregled referenci soj 26995; + Brojevi pristupanja H. pylori pregled slijeda sojevi za SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar i Hp16S567Mar su, redom: [Genbank: CP002336.1 GenBank: CP002571.1 GenBank: EU544200.1 GenBank: CP002982.1 GenBank: JQ315410 GenBank: JQ315411 GenBank: JQ315412 i GenBank. JQ315413]
Zaključci
visokoj razini Tctr H. pylori pregled genotipom ovisnih o AGA926-929TTC 16 S rDNA gena zamjene nije pronađen u našoj populaciji. Više istraživanja je potrebno da se ispita H. pylori pregled, visoka stopa Tctr je odsutan ili je povezan s nekim drugim bakterijskim genetsku pozadinu u našoj regiji. Također, biološki značaj nepredviđenih nukleotidnih supstitucija u marilia nekulturni H. pylori
16 S rDNA djelomične sekvence potrebno dodatno istražiti.
Metode
pacijenti
1102 odraslih bolesnika s prebivalištem u marilia gradu, Sao Paulo država Brazil, u dobi od 19 do 91 godina, koji je uzastopno podvrgli ezofagogastroduodenoskopija (EGD) za gornji bolovi u trbuhu ili dispeptičkih simptoma od siječnja 2003. do srpnja 2006. godine na gastroenterologija ambulanti bolnice das Clínicas Marília Medicinskog fakulteta, sudjelovalo je u to studija. pregled, endoskopija, biopsija
EGD je postignuto fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) ili video-endoskop (GIF-100), oba iz Olympusa. Želučani ili duodenalni ulkus dijagnoza je definiran endoskopije i dva ulomka iz antruma su prikupljeni za obavljanje brzi ureaza i patohistološke pretrage. Biopsija se koristi za brzi test ureaze dalje je podnesen ekstrakcije DNA. Protokol se koristi u dogovoru s Helsinškom deklaracijom i odobren od strane Etičkog povjerenstva u Human Research iz marilia Medicinskog fakulteta, pod brojem 388/01. Pregled Histologija pregled One antralnim uzorka bio je fiksiran u formolu otopini na 10% i uklopljene u parafin. Sekcije su Giemsa obojene H. pylori pregled evaluacije i obojeni su hemalaunom i eozinom za procjenu histopatološke promjene [38]. Pregled, lančana reakcija polimerazom ekstrakcija DNA i pregled lančana reakcija polimeraze i restrikcijske analize postavljeni su s isto biopsija se koristi za brzi test ureaze. To je podnesen ekstrakcije DNA s zapošljavanju GFX DNA ekstrakcije komplet kupljen od Amersham /Pharmacia Biotech, prema uputama proizvođača. DNA se kvantificira u agaroza gel elektroforeze upotrebom Invitrogem niske masa ljestvama i 50-100ηg su korišteni u reakcijama PCR s prajmera Hp16Sr1 (smislena),): 5 'AAC ATT GAC ACT GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5 'TGG CAC CTC TTC GCA GTA TT-3', koji pojačavaju konzerviranim fragment 545 bp koji odgovaraju H.pylori
16 S rRNA gena između nukleotidnim položajima 700 i 1245 (numerirani prema rRNA gena H. pylori pregled soj 26695), izmijenjena [32]. U svim reakcijama PCR negativni i pozitivni kontrolni korišteni odgovara, respektivno, sterilne vode i dva različita ureaza H. pylori
pozitivne želučanih Biopsije prednja šapa pacijenata. PCR uvjeti je 94 ° C 5 'zatim 40 ciklusa od 94 ° C, 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' i jedan ciklus na 72 ° C 7 ', u ukupnom volumenu od 25 ul koji sadrži 1x PCR pufer, 200 uM dNTP, 2,0 mM MgClz 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1 uM oligo Hp16Sr2, 1.25 U Taq DNA polimeraze Platinum Brazil (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. PCR produkti su razdvojeni na 1.5% agaroznom gelu, obojani s etidij bromidom, fotografirani pod UV svjetlom. Pregled restrikcijskim sekvenciranje analiza pregled 16 S rDNA 545 bp amplikona dobivenog pomoću PCR iz uzoraka biopsije su razgrađeni Hinf
I (biolab - New England) u skladu s uputama proizvođača. Predvidljiv obrazac restrikcije za tetraciklin osjetljivih H. pylori pregled sojeva odgovara dva fragmenta od 264 i 281 bp i za H. pylori pregled sojevi s visokom otpornošću na tetraciklin odgovara na tri fragmenata 281, 227 i 37 bp. Proizvodi restrikcijske analize su riješena u 8% akrilamidnim gelovima, obojeni etidij bromida i fotografirani pod UV svjetlom. 16 S rRNA 545 bp PCR umnošci iz dva H. pylori
pozitivna kontrola želučane biopsije (Hp16S248Mar i 644Mar) i dva produkta koji prezentiraju neočekivane Hinf pregled sam restrikcije (Hp16S563Mar i Hp16S587bp) su dostavljeni sekvenciranje s DyeTM Terminatora v3.0 ciklus sekvenciranje Ready Reaction kit i ABI-3100 stroj kupljen od Applied biosustava, u skladu s uputama proizvođača. Određivanje slijeda nukleotida provedene u duplikatu i komparativne analize provedena je osnovni nukleotida BLAST poravnanje [37] pregled Autorske doprinosi pregled RBS i CMA provode molekularne studije i doprinijeli stjecanju i tumačenje podataka. MAS dizajniran pokuse, doprinijeli analizi podataka i izradio rukopis. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis pregled Bilješke pregled Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida doprinijeli jednako na ovom poslu pregled Kratice pregled pud.. Pregled, peptički ulkus pregled
CG: pregled, kronični gastritis
GERB: pregled Gastroezofagealna refluksna bolest
PCR: Lančana reakcija polimerazom pregled
RFLP: pregled Ograničenje polimorfizam duljine fragment
Tctr: pregled rezistenciju na tetraciklin pregled.
deklaracijama
Zahvale
zahvalni smo dr Adriana Augusta Pimenta de Barros za nju skrbi za sve pacijente uključene u studiju i Dr. David Howe za njegov doprinos u izdanju rukopis jezik. Ovaj rad je podržan od strane Fundação de Amparo Pesquisa učiniti Estado de Sao Paulo (FAPESP), potpore za istraživanje 2006 /01223-0; Zajedništvo CMA 2005 /04087-7.
Suprotstavljenih interesa pregled nemamo bilo da se proglasi. Pregled

• Genomske promjene i molekularnih podtipova želučanog karcinoma u Asians
• Među promatračima i intraobserver ugovor za želučane sluznice atrofije