Das Fehlen von Helicobacter pylori hohe Tetracyclin-resistente 16S rDNA AGA926-928TTC Genotyp in Magenbiopsieproben von Patienten mit Dyspepsie einer Stadt im Inneren von São Paulo, Brazil

Abwesenheit von Helicobacter pylori
hoch Tetracyclin-resistente 16S rDNA AGA926-928TTC Genotyp in Magen-Biopsie Proben von Patienten mit Dyspepsie einer Stadt im Inneren von São Paulo, Brasilien
Zusammenfassung
Hintergrund
Wirksamkeit der Behandlung von Helicobacter pylori
variiert regional und weltweit abnimmt, hauptsächlich als Folge von Antibiotika-resistenten Bakterien. Tetracycline wird in zweiter Linie H. pylori-Eradikation
Regime einbezogen. In Brasilien, ein hohes Maß an Tetracyclin-Resistenz (TetR) hauptsächlich mit AGA926-928TTC 16 S rDNA Nukleotidsubstitutionen verbunden. Als H. pylori
Kultur anspruchsvoll ist, untersuchten wir die primäre Vorkommen von H. pylori mit einem Molekular Ansatz direkt auf Magen-Biopsien von Patienten mit Dyspepsie 16 S rDNA hohem Niveau
TetR Genotyp mit nacheinander an Hospital das Clinicas von Marilia besuchen, Sao Paulo, Brasilien.
Methoden
Magenbiopsieproben von 68 Ulkuskrankheit (PUD) und 327 chronische Gastritis (CG) Patienten mit einer positiven histologischen Diagnose von H. pylori
wurden für TetR 16 S rDNA untersucht Genotyp durch einen molekularen Assays basierend auf Amplifikation eines 16 S-rDNA-545 bp-Fragment durch Polymerase-Kettenreaktion und HinfI
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (PCR /RFLP). Durch diesen Test ergab AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR-Genotyp in einem Restriktionsmuster drei DNA-Fragment (281, 227 und 37 bp) und seine Abwesenheit entstanden zwei DNA-Fragmente (264 und 281 bp) aufgrund einer 16 S-rDNA Hinf I konservierten
Restriktionsstelle.
Ergebnisse
Das 545 bp 16 S rDNA-PCR-Fragment von 90% der Magen-Biopsien von histologischen H. pylori
positiven Patienten verstärkt wurde. HinfI
RFLP ergab Abwesenheit der AGA926-928TTC H. pylori
Genotyp und PCR-Produkte von zwei Patienten zeigten eine Abwesenheit der konservierten 16 S rDNA HinfI
Restriktionsstelle. BLASTN Sequenzanalyse von vier Amplikons (zwei konservierte und zwei mit einem nicht vorhergesagten HinfI
Restriktionsmuster) zeigte eine 99% ige Homologie zu H. pylori
16 S rDNA aus Afrika, Nord- und Südamerika bakterielle Isolate. Eine Nukleotidaustausches der konservierten HinfI
Restriktionsstelle in den beiden PCR-Fragmente mit unpredicted HinfI
RFLP abgeschafft, was zu einer EcoRI
Restriktionsstelle.
Schlussfolgerungen
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA-Gen-Substitutionen wurden in unserer Bevölkerung nicht gefunden. Mehr Forschung ist notwendig, zu untersuchen, ob H. pylori
TetR einen anderen genetischen Hintergrund in unserer Region hat, und wenn die Nukleotidsubstitutionen des unkultivierten H. pylori
16 S rRNA Teilsequenzen haben biologische Bedeutung.
Keywords
Helicobacter pylori
Tetracyclinresistenz Helicobacter pylori
16 S rDNA Nukleinsäure-basierte Diagnose Helicobacter pylori
16 S rDNA-Polymorphismus Hintergrund
Es ist allgemein, dass Helicobacter pylori
akzeptiert wird, ein Gram-negative Bakterium microaerophilic wird mit mehreren Erkrankungen des Verdauungstraktes wie chronische Gastritis, Magen-Darm-und Zwölffingerdarmgeschwüre, Magenkrebs und lymphoproliferative Erkrankungen [1] verbunden ist. Es gibt keine standardisierten Behandlungsschema für H.pylori Infektion
[2] und, wenn das Bakterium in veränderten Magenschleimhaut festgestellt wird, die angegebene Behandlung besteht aus einer dreifachen antibiotischen Therapie einschließlich Metronidazol, Clarithromycin, Amoxicillin, Tinidazol, Tetracyclin und Fluorchinolonen assoziiert mit einem Protonenpumpenhemmer wie Omeprazol, Lansoprazol oder Pantoprazol [3-5], nach Verschreibung von Antibiotika Richtlinien für ärztliche Versorgung vor Ort.
H. pylori-Eradikation Preise
mit einer Reihe von kombinierten Mitteln und Therapien sind in der Nähe 80% [6, 7], variiert von Land zu Land und regional innerhalb der Länder [8]. Mehrere Faktoren tragen zu dieser niedrigen Rate von H. pylori
Heilung einschließlich der Ineffizienz des Antibiotikums Penetration in der Magenschleimhaut, die Inaktivierung des Antibiotikums durch die Säuresekretion des Magens [9], der Mangel an Patientencompliance [10] und vor allem, Notfallkoffer und der Erhöhung der H. pylori
Antibiotika-resistente Stämme [11]. Somit Überwachung regionaler H. pylori
Widerstand von großer Bedeutung für Test- und Behandlungsstrategien ist.
In Brasilien, einem Land mit kontinentalen Dimensionen, sind die Mehrheit der praktizierenden Klinikern Tetracyclin in einer zweiten Linie Behandlungsschema nach dem Versagen der klassische Dreifachtherapie von claritromycin zusammengesetzt, Amoxicillin und einem Protonenpumpenhemmer für sieben Tage zu überwinden H. pylori
Infektion [12].
H. pylori
Resistenz gegen Tetracyclin (TetR) niedrig ist in den meisten Ländern [13-15], umgekehrt, in Lateinamerika, nach einer kleinen Anzahl von Studien hat es sich in Chile [16] und in Brasilien hoch erwiesen [17]. Darüber hinaus einige Jahre die Inzidenz von TetR hat zugenommen [15, 18-21]. Dementsprechend erwägt die klinische Bedeutung der primären H. pylori
Resistenz gegen Antibiotika, sollte es regional betrachtet werden, bevor in Eradikation Regimen einbezogen werden.
Die Goldstandardmethode zur Bestimmung von H. pylori in vitro
Anfälligkeit Antibiotika entspricht der Isolierung des Mikroorganismus von der Kultur. Jedoch wegen des langsamen Wachstums und der besonderen Anforderungen der H. pylori
Kultur, ist dieser Ansatz nicht zuverlässig für die Verwendung in den meisten klinischen Routinelaboratorien, vor allem in den Entwicklungsländern. Daher assoziierten Gen-Targeting molekularen Tests Widerstand direkt Mutationen aus Biopsien haben das Potenzial für den Einsatz in großem Maßstab Studien [22-25].
Der molekulare Mechanismus der TetR besteht aus seiner zu einem bestimmten 16 S rRNA Region Bindung, Interaktion stoisch mit der Aminoacyl-tRNA-Transferase an die A-Stelle des Ribosoms. Diese Bindungsstelle wurde von atomarer Auflösung in Ribosomen von Thermus thermophilus definiert
bestehend aus Helix durch zwei Domänen der 16 S rRNA Fraktion 34 gebildet wird und die Schleife nächsten 31 bis helix [26, 27]. In H. pylori Isolate
ist der hohe Grad an TetR hauptsächlich auf drei Basenmutationen, von AGA926-928 zu TTC, in der 16 S rRNA Gene rRNA /B [28, 29]. Mutationen in einem oder zwei dieser Positionen führen zu einem niedrigen Niveau von TetR [30, 31].
In Brasilien durchgeführten Studien an Patienten von Bragança Paulista, São Paulo, hat gezeigt, dass Triple-AGA926-928 zu TTC Mutationen gefunden werden alle
Isolate TetR H. pylori [32]. So ein Molekular Ansatz basiert auf einer Polymerase-Kettenreaktion im Zusammenhang mit RFLP (PCR-RFLP) Assay wir die primäre Inzidenz von H. pylori untersucht
hohe TetR direkt im Magen-Biopsien von Patienten mit Dyspepsie erhalten eingereicht im Hospital das Clinicas von Marilia, São Paulo, Brasilien, von Januar 2003 bis Juli 2006
Ergebnisse und Diskussion
Magenerkrankung Ergebnis von 1.102 Patienten auf Gastroskopie der Gastroenterologie Ambulanz des Krankenhauses das Clínicas von Marília untersucht die Teilnahme von Endoskopie und Histopathologie. Endoskopische Befund von Magen-Darm-oder Zwölffingerdarmgeschwür Krankheit (PUD) wurden bei 119 Patienten vor. Unterschiedliche Grade der chronischen Gastritis (CG) wurden in 693 Patienten mit histopathologischen beobachtet und andere Veränderungen vor allem auf gastroösophagealen Refluxkrankheit (GERD) und normale Magenschleimhaut entsprechen, wurden in 290 Patienten gefunden. Einige Patienten hatten mehr als eine Änderung, mit der schwersten Pathologie in der Analyse berücksichtigt werden.
Nachweis von H. pylori
wurde aus Biopsien von Histologie direkt durchgeführt, der Goldstandard H. pylori
diagnostischen Test eingesetzt wird, in unserer klinischen Routine, die zusammen mit histopathologischen Analyse verwendet für H. pylori-Eradikation
zu entscheiden. Von 119 PUD, 693 CG und 290 GERD-Proben, 76, 359 und 2 waren jeweils positiv für H. pylori und Videos Histologie.
Einmal in der Magenschleimhaut festgestellt, eine klassische H. pylori-Eradikation
triple Regime ist in unserer Gastroenterologie Gesundheitsversorgung Kliniken vorgeschrieben. Als erste Wahl Therapie Therapie H. pylori
auszurotten ausfällt, Tetracyclin eine zweite Linie Regime enthält, ist die am meisten angegeben. H. pylori
Antibiotikum TetR variiert regional, sehr gering ist in Europa und Nordamerika [2, 33, 34]. Doch in Asien [15, 19, 35] und Lateinamerika, darunter Brasilien [16, 32], einer hohen Rate von H. pylori
TetR gefunden wurde. Somit wird, um die Wahl von H. pylori zu verbessern
assoziierten Krankheit Therapie, vor allem im Falle von Behandlungsversagens untersuchten wir die regionalen hohe H. pylori
TetR ein Molekular Ansatz basiert auf PCR und RFLP direkt aus dem gleichen für die schnelle Urease-Test verwendet Magen-Biopsie. Nur Biopsieproben von den Patienten mit positiven H. pylori und Videos Histologie Diagnose wurden eingeschlossen. Ein 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR-Fragment wurde von 89,5% (68/76) und 91,1% (327/359) der Magen-Biopsien von PUD und CG-Patienten erhalten wurden. Da beide Tests auf einem einzelnen und verschiedenen Magen-Biopsie durchgeführt wurden und H. pylori-Infektion
eine Brenncharakteristik der Infektion präsentiert [36] wird mehrere Biopsien zu verbessern Empfindlichkeit dieses Verfahrens wird empfohlen.
Sequenziell um die wichtigsten verwandten Punktmutationen, AGA TTC an den Positionen 926, 927 und 928 der H. pylori
16 S rDNA mit einem hohen Maß an TetR und einer einzigartigen Genotyp charakterisiert in der brasilianischen TetR H. pylori assoziiert zu erkennen
isoliert [32], die 545 bp 16 S rDNA-PCR-Fragment wurde mit HinfI
beschränkt. In diese 16 S rDNA Amplikon
H. pylori ist es eine konservierte HinfI
Restriktionsstelle, die eine interne Kontrolle der Enzymspaltung liefert, was zu einem Fragment zwei Restriktionsmuster DNA, wenn die dreifache AGA926-928TTC Nukleotidsubstitution ist abwesend. Von 395 PCR-Proben stellte 393 die zwei DNA-Fragment Restriktionsmuster und zwei PCR-Produkte von einem PUD (Hp16S563Mar) Patienten erhalten und ein CG (Hp16S587bp) Patienten wurden nicht von HinfI
verdaut. Die hohe Tetracyclin-resistente AGA926-928TTC Genotyp abhängig von H. pylori
16 S rDNA in unserer Bevölkerung nicht vorhanden war. Diese Ergebnisse können Anzeichen sein von H. pylori
hohe TetR Abwesenheit oder dass in unserer Region anderen 16 S rDNA Nukleotidsubstitutionen oder verschiedene genetische Faktoren sind in Tetrazyklin-Resistenz beteiligt sind, wie in anderen Studien gefunden [21]. Mehr Forschung diese Hypothesen zu bestätigen oder auszuschließen, durchgeführt werden muss.
Um die Spezifität des 545 bp H. pylori von Magen-Biopsien, die 545 bp PCR-Fragmente amplifiziert
16 S rDNA-PCR-Produkte zu bestätigen, erhalten aus zwei H. pylori
positive PUD-Patienten als Kontrollen in PCR-Reaktionen verwendet (Hp16S248Mar und Hp16S644Mar) und die 545 bp PCR-Fragmente mit unpredicted HinfI
Restriktionsmuster genannt Hp16S563Mar und Hp16S587bp wurden durch basische BLASTN Suche sequenziert und analysiert [ ,,,0],37]. Alle vier Sequenzen präsentiert 99% Homologie zu der 16 S rDNA aus West- und Süd-Afrika, Süd-und Nordamerika H.pylori
Isolate. Die Punktmutationen in jeder gefunden analysierten PCR-Sequenz im Vergleich zu den 16 S rDNA-Referenzsequenzen
H. pylori höhere Homologie zu den erhaltenen Amplicons präsentiert in der Tabelle zusammengefasst 1. Abschaffung des HinfI
Restriktionsstelle von Hp16S563 und 587Mar geführt von einer Nukleotid-Substitution an Position 958, mit Ursprung in einem EcoRI
Restriktionsstelle. So (Daten nicht gezeigt) die Nukleotidsubstitutionen in diesen 16 S 545 bp-PCR-Fragmente, die durch EcoRI
Restriktionsanalyse bestätigt wurden. Die biologische Bedeutung von Nukleotidsubstitutionen in unserem 16 S gefunden uncultured H. pylori
PCR benötigt Fragmente untersucht werden. Tabelle 1 Vergleich von Helicobacter-pylori-545 bp 16 S rDNA-Nukleotid-Polymorphismen unter Referenzen und unkultivierten Bakterien-Stämme
H. pyloristrain +
16 S rDNA Nucleotidpositionen #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
A
GAATCC
A
T
T
T
G
Puno /Peru
AGA
A
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
A
T
T
C
A
Hp16S644Mar
AGA
A
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
A
GAATTC
A
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
A
GAATTC
G
C
T
C
G
# basierend auf H. pylori
Referenz Stamm 26995; + Zugangsnummern der H. pylori-Stämme
Sequenz für SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar und Hp16S567Mar sind jeweils: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 und Genbank. JQ315413]
Schlussfolgerungen
das hohe Niveau TetR H. pylori
Genotyp abhängig von AGA926-929TTC 16 S rDNA-Gen Substitutionen wurde in unserer Bevölkerung. Mehr Forschung ist notwendig, zu untersuchen, ob H. pylori
hohe Rate TetR abwesend ist oder wenn es mit einer anderen bakteriellen genetischen Hintergrund in unserer Region verbunden ist. Auch die biologische Bedeutung der unpredicted Nukleotidsubstitutionen des Marilia unkultivierten H. pylori
16 S rDNA Teilsequenz weitere Untersuchungen benötigt.
Methoden
Patienten
1102 erwachsenen Patienten mit Wohnsitz in Marilia Stadt, São Paulo State, Brasilien, im Alter von 19 bis 91 Jahren, die für Oberbauchschmerzen oder Magenbeschwerden von Januar 2003 bis Juli 2006 im gastroenterologischen Ambulanz des Krankenhauses das Clínicas von Marília Medical School, wurden in diese nacheinander unterzogen Ösophagogastroduodenoskopie (EGD) hatte eingeschrieben Studie.
Endoskopie, Biopsien
Die EGD von fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) oder Video-Endoskop (GIF-100), die beide von Olympus durchgeführt wurde. Magen oder Zwölffingerdarmgeschwür Diagnose wurde durch Endoskopie und zwei Fragmente des Antrums wurden gesammelt auszuführen, um die schnelle Urease und histopathologische Tests definiert. Die Biopsie für die schnelle Urease-Test verwendet wurde weiter auf die DNA-Extraktion vorgelegt. Das verwendete Protokoll ist in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki und wurde von der Ethikkommission in Human Research von Marilia Medical School, unter der Nummer 388/01.
Histologie
Ein antral Probe wurde in Formol Lösung auf 10% genehmigt und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden Giemsa für H. pylori
Auswertung gefärbt und wurden mit Hematoxilin und Eosin für die Beurteilung von histopathologischen Veränderungen [38].
DNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion
Polymerase-Kettenreaktion und Restriktionsanalyse eingerichtet wurden gefärbt mit die gleiche Biopsie für die schnelle Urease-Test verwendet. Dies wurde mit dem Einsatz der GFx DNA-Extraktions-Kits von Amersham /Pharmacia Biotech erworben DNA-Extraktion vorgelegt, nach den Anweisungen des Herstellers. Die DNA wurde in Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung des Invitrogem geringer Masse Leiter quantifiziert und 50-100ηg wurden in den PCR-Reaktionen mit dem Primersatz Hp16Sr1 (Sense)) verwendet: 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5'-TGG CAC CTC TTC GCA GTA TT 3 ', die ein konserviertes Fragment von 545 bp amplifizieren zur H. pylori entspricht
16 S rRNA-Gens zwischen den Nucleotidpositionen 700 bis 1245 (Numerierung gemäß dem rRNA-Gen von H. pylori
Stamm 26695), modifiziert nach [32]. Bei allen PCR-Reaktionen wurden eine negative und eine positive Kontrolle verwendet, um entsprechend jeweils steriles Wasser und zwei verschiedene H. pylori Urease-positive
Magenbiopsien von PUD-Patienten. PCR-Bedingungen waren 94 ° C 5 ', gefolgt von 40 Zyklen von 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' und ein Zyklus bei 72 ° C 7 ', mit einem Gesamtvolumen von 25 ul, enthaltend 1x PCR Puffer, 200 uM dNTPs, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1 uM Oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA Polymerase Platinum Brasilien (Invitrogen), 2,5% DMSO, DNA 50ηg. Die PCR-Produkte wurden in 1,5% Agarosegelen mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert unter UV-Licht aufgelöst.
Beschränkung und Sequenzanalyse
Die 16 S rDNA 545 bp Amplifikate mittels PCR aus Biopsien erhalten wurden mit HinfI verdaut
I (Biolab - New England) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die vorhersehbare Restriktionsmuster für Tetracyclin anfällig H. pylori-Stämme
entspricht zwei Fragmente von 264 und 281 bp und für H. pylori
Stämme mit hohen Tetrazyklin-Resistenz entspricht drei Fragmente von 281, 227 und 37 bp. Die Produkte der Restriktionsanalyse wurden in 8% Acrylamid-Gelen mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert unter UV-Licht aufgelöst. 16 S rRNA 545 bp PCR-Produkte aus den beiden H. pylori
positive Kontrolle Magen-Biopsien (Hp16S248Mar und 644Mar) und die beiden Amplifikate präsentiert unerwartete Hinf
I-Restriktionsmuster (Hp16S563Mar und Hp16S587bp) wurden Sequenzierung mit DyeTM Terminator eingereicht v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit und eine ABI-3100-Maschine von Applied Biosystem erworben haben, nach den Anweisungen des Herstellers. Nucleotid-Sequenzbestimmung wurde in zweifacher Ausfertigung und vergleichende Analyse wurde durch basische Nukleotid BLAST Ausrichtung durchgeführt [37]
Autor Beiträge
RBS und CMA die molekularen Studien durchgeführt und trug zur Erfassung und Auswertung von Daten. MAS entwickelt, um die Experimente, trugen zur Datenanalyse und das Manuskript verfasst. Alle Autoren lesen und das endgültige Manuskript genehmigt
Hinweise
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit
Abkürzungen
PUD:..
Ulkuskrankheit

CG:
Chronische Gastritis
GERD:
Refluxösophagitis
PCR:
Polymerase-Kettenreaktion
RFLP:
RFLP
TetR:
Tetracyclinresistenz
.
Erklärungen
Acknowledgments
Wir danken Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros für ihre Versorgung zu allen Patienten in die Studie aufgenommen und an Dr. David Howe für seinen Beitrag in der Ausgabe von das Manuskript Sprache. Diese Arbeit wurde von der Fundação de Amparo ein Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Research Grant 2006 /01223-0 unterstützt; Fellowship CMA 2005 /04087-7.
Interessenkonflikt kaufen Wir haben keine zu erklären.

• Genomische Veränderungen und molekularen Subtypen von Magenkrebs bei Asiaten
• Interobserver- und Intraobserver- Vereinbarung für Magenschleimhaut atrophy