Absence de Helicobacter pylori haute tétracycline résistant génotype ADNr 16S AGA926-928TTC dans les échantillons de biopsie gastrique chez des patients dyspeptiques d'une ville à l'intérieur de São Paulo, Brazil

Absence de Helicobacter pylori
haute tétracycline résistant génotype ADNr 16S AGA926-928TTC dans la biopsie gastrique des spécimens provenant de patients dyspeptiques d'une ville à l'intérieur de São Paulo, Abstrait
fond du Brésil
l'efficacité du traitement de l'Helicobacter pylori
varie selon les régions et diminue dans le monde entier, principalement en raison d'une bactérie résistante aux antibiotiques. Tétracycline est généralement inclus dans les schémas d'éradication de H. pylori deuxième ligne. Au Brésil, un haut niveau de résistance à la tétracycline (TetR) est principalement associée à AGA926-928TTC 16 S ADNr substitutions nucléotidiques. Comme H. pylori
culture est fastidieuse, nous avons étudié l'apparition primaire de H. pylori
16 S ADNr haut niveau génotype TetR utilisant une approche moléculaire directement sur biopsies gastriques des patients dyspeptiques présents consécutivement à l'Hôpital das Clinicas de Marilia, São Paulo, Brésil.
Méthodes
biopsies gastriques de 68 ulcère gastroduodénal (UGD) et 327 gastrite chronique (CG) patients avec un diagnostic histologique positif de H. pylori
ont été étudiées pour TetR 16 S ADNr le génotype par un essai basé sur une amplification moléculaire d'un 16 S 545 pb fragment d'ADNr par réaction en chaîne par polymérase et Hinfl de longueur des fragments de restriction du polymorphisme (PCR /RFLP). À travers cet essai, AGA926-928TTC 16 S ADNr TetR génotype donné lieu à un motif de restriction des fragments de trois d'ADN (281, 227 et 37 pb) et son absence est issue de deux fragments d'ADN (264 et 281 pb) en raison d'un S ADNr 16 conservés Hinfl Résultats
site de restriction.
Le fragment 16 S ADNr PCR 545 pb a été amplifié à partir de 90% des biopsies gastriques de H. pylori
patients positifs histologiques. Hinfl de RFLP a révélé l'absence des AGA926-928TTC H. pylori
génotype et produits de PCR de deux patients ont montré l'absence de site de restriction du conservé 16 S ADNr Hinfl. analyse de la séquence de quatre amplicons BLASTN (deux conservées et deux avec Hinfl
motif de restriction unpredicted) a révélé une homologie de 99% à 16 H.pylori
S ADNr d'Afrique, du Nord et en Amérique du Sud isolats bactériens. Conclusions d'une substitution nucléotidique aboli le site de restriction de la Hinfl conservée dans les deux fragments de PCR avec le RFLP de unpredicted Hinfl, résultant dans un EcoRI de site de restriction.
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S ADNr substitutions de gènes sont introuvables dans notre population. Plus de recherche est nécessaire pour étudier si H. pylori
TetR a un fond génétique différent dans notre région et si les substitutions nucléotidiques de l'inculte de H. pylori
16 S ARNr séquences partielles ont une signification biologique.
Mots-clés
diagnostic basé Helicobacter pylori
16 S ADNr acide nucléique
tétracycline résistance Helicobacter pylori Helicobacter pylori
16 S ADNr polymorphisme Contexte
Il est largement admis que Helicobacter pylori
, une bactérie microaérophile Gram négatif , est associée à plusieurs maladies du tractus digestif telles que la gastrite chronique, peptique et ulcère duodénal, un cancer gastrique et troubles lymphoprolifératifs [1]. Il n'y a pas de schéma de traitement standardisé pour une infection par H. pylori s [2] et une fois que la bactérie est détectée dans la muqueuse gastrique altérée, le traitement indiqué est constitué d'un traitement antibiotique triple comprenant le métronidazole, la clarithromycine, l'amoxicilline, le tinidazole, la tétracycline et fluoroquinolones associé avec un inhibiteur de la pompe à protons tels que l'oméprazole, lansoprazole ou pantoprazole [3-5], selon les politiques de prescription d'antibiotiques pour les soins médicaux locaux.
H. Les taux d'éradication de pylori avec un certain nombre d'agents combinés et les régimes sont près de 80% [6, 7], variant d'un pays à l'échelle régionale et dans les pays [8]. Plusieurs facteurs contribuent à ce taux de guérison de H. pylori, y compris l'inefficacité de la pénétration des antibiotiques dans la muqueuse gastrique, l'inactivation de l'antibiotique par la sécrétion acide de l'estomac [9], le manque d'observance du patient [10] et une faible principalement, les cas d'urgence et l'augmentation des souches résistantes aux antibiotiques de H. pylori [11]. Ainsi, la surveillance de la résistance de H. pylori régionale est d'une grande importance pour les stratégies de test et de traitement.
Au Brésil, un pays aux dimensions continentales, la majorité des cliniciens praticiens comprennent la tétracycline dans un second régime de traitement de ligne après l'échec de la trithérapie classique composé de claritromycin, amoxicilline et un inhibiteur de la pompe à protons pendant sept jours pour surmonter H. pylori
infection [12].
H. pylori de la résistance à la tétracycline (TetR) est faible dans la plupart des pays [13-15], à l'inverse, en Amérique latine, selon un petit nombre d'études, il a été montré pour être élevé au Chili [16] et au Brésil [17]. De plus, depuis quelques années, l'incidence de TetR a augmenté [15, 18-21]. En conséquence, compte tenu de l'importance clinique de la résistance primaire H. pylori aux antibiotiques, il devrait être considéré au niveau régional avant d'être inclus dans les régimes d'éradication.
La méthode standard d'or pour la détermination de H. pylori in vitro
susceptibilité à des antibiotiques correspond à l'isolement du micro-organisme en culture. Toutefois, en raison de la croissance lente et les exigences particulières de la culture de H. pylori, cette approche est pas fiable pour une utilisation dans la plupart des laboratoires cliniques de routine, principalement dans les pays en développement. Par conséquent, les tests moléculaires ciblant la résistance associée mutations génétiques directement à partir des échantillons de biopsie ont le potentiel pour une utilisation dans des études à grande échelle [22-25].
Le mécanisme moléculaire de TetR se compose de sa liaison à une région spécifique 16 S ARNr, interagissant stoïquement avec la transférase aminoacyl-ARNt au site A du ribosome. Ce site de liaison a été défini par la résolution atomique dans les ribosomes de Thermus thermophilus
étant formé par deux domaines de la fraction 16 S d'ARNr consistant en hélice 34 et la boucle suivante à l'hélice 31 [26, 27]. Dans H. pylori
isolats, le degré élevé de TetR est principalement due à trois mutations de base, de AGA926-928 à TTC, dans les 16 S ARNr gènes rrnA /B [28, 29]. Des mutations dans un ou deux de ces positions se traduisent par un niveau de TetR [30, 31] faible.
Au Brésil, des études réalisées sur des patients de Bragança Paulista, São Paulo, ont montré que le triple AGA926-928 aux mutations TTC se trouvent dans les isolats de tous les TetR H. pylori [32]. Ainsi, en utilisant une approche moléculaire basée sur une réaction en chaîne par polymérase associée à la longueur des fragments de restriction polymorphisme (PCR-RFLP), nous avons étudié l'incidence primaire de H. pylori
haut niveau TetR directement dans les échantillons de biopsie gastrique obtenus chez des patients dyspeptiques soumis à gastroscopie à l'Hôpital das Clinicas de Marilia, São Paulo, au Brésil, à partir de Janvier 2003 à Juillet 2006.
Résultats et discussion
gastrique issue de la maladie de 1102 patients fréquentant la clinique gastro-entérologie ambulatoire de l'Hôpital das Clínicas de Marília a été étudiée par endoscopie et l'histopathologie. constatation endoscopique de la maladie de l'ulcère peptique ou duodénal (PUD) étaient présents chez 119 patients. Différents degrés de gastrite chronique (CG) ont été observées par histopathologie dans 693 patients et d'autres modifications correspondant principalement à la maladie de reflux gastro-oesophagien (RGO) et de la muqueuse gastrique normale, ont été trouvés dans 290 patients. Certains patients ont présenté plus d'une modification, à la pathologie la plus grave étant pris en compte dans l'analyse de. La détection de H. pylori
a été effectuée directement à partir des échantillons de biopsie par histologie, la norme d'or H. pylori test de diagnostic
employé dans notre routine clinique qui, avec l'analyse histopathologique est utilisé pour décider H. pylori de la thérapie d'éradication. De 119 PUD, 693 CG et 290 échantillons de RGO, 76, 359 et 2, respectivement, étaient positifs pour H. pylori
par histologie.
Une fois détecté dans la muqueuse gastrique, un H. pylori classique
éradication triple le régime est prescrit dans nos cliniques de soins de santé de la gastro-entérologie. Lors de la première thérapie de choix régime ne parvient pas à éradiquer H. pylori
, une seconde ligne de traitement contenant de la tetracycline est le plus indiqué. H. pylori d'antibiotiques TetR varie selon les régions, étant très faible en Europe et en Amérique du Nord [2, 33, 34]. Toutefois, en Asie [15, 19, 35] et en Amérique latine, dont le Brésil [16, 32], un taux élevé de H. pylori
TetR a été trouvé. la thérapie de la maladie Ainsi, afin d'améliorer le choix de H. pylori Associées, principalement en cas de premier échec d'éradication, nous avons étudié le haut niveau régional de H. pylori
TetR en utilisant une approche moléculaire basée sur la PCR et RFLP directement à partir de la même biopsie gastrique utilisé pour le test rapide à l'uréase. Seuls les échantillons de biopsie des patients avec le diagnostic positif H. pylori par histologie ont été inclus. A H. 545 pb fragment pylori
16SrDNA PCR a été obtenu à partir de 89,5% (68/76) et 91,1% (327/359) des biopsies gastriques de patients PUD et CG, respectivement. Comme les deux tests ont été effectués sur une biopsie gastrique unique et différent et H. pylori
infection présente une caractéristique focale de l'infection [36], pour améliorer la sensibilité de cette méthode, la biopsie d'échantillonnage multiple est recommandé. Es Séquentiellement, afin pour détecter les principales mutations ponctuelles liées, AGA TTC au niveau des positions 926, 927 et 928 de la bactérie H. pylori de 16 S ADNr associés à un niveau élevé de TetR et un génotype unique, caractérisé en ce TetR brésilien H. pylori
isole [32], le fragment d'ADNr 16 S PCR 545 pb a été restreint avec Hinfl
. Dans 16 l'ADNr S amplicon de cette H.pylori il existe un site de restriction Hinfl
conservée, qui fournit un contrôle interne de la digestion enzymatique, conduisant à un motif de restriction des fragments d'ADN de deux, lorsque la substitution nucléotidique triplet est AGA926-928TTC absent. Sur 395 échantillons de PCR, 393 ont présenté le schéma de restriction des fragments de deux ADN et deux produits de PCR obtenus à partir d'un PUD (Hp16S563Mar) patient et un CG (Hp16S587bp) des patients ne sont pas digérés par Hinfl
. La haute tétracycline résistant à AGA926-928TTC génotype dépendant de H. pylori
16 S ADNr n'a pas été présent dans notre population. Ces résultats peuvent être le signe de H. pylori
haut niveau TetR absence ou que dans notre région autres 16 S ADNr substitutions nucléotidiques ou des facteurs génétiques différents sont impliqués dans la résistance à la tétracycline, que l'on trouve dans d'autres études [21]. Plus de recherche doit être effectuée pour confirmer ou exclure ces hypothèses.
Afin de confirmer la spécificité du H. 545 pb pylori
16 produits S ADNr PCR amplifiés à partir de biopsies gastriques, les fragments de 545 pb de PCR obtenus à partir deux pylori
patients PUD positifs H. utilisés comme témoins dans les réactions de PCR (Hp16S248Mar et Hp16S644Mar), et les fragments de PCR 545 pb avec Hinfl unpredicted motif
de restriction nommé Hp16S563Mar et Hp16S587bp, ont été séquencés et analysés par la recherche fondamentale BLASTN [ ,,,0],37]. Les quatre séquences présentées 99% d'homologie avec la 16 S ADNr à partir des isolats de H. pylori en Amérique du Nord Ouest et Afrique du Sud, du Sud et. Les mutations ponctuelles se trouvent dans chaque séquence analysée par PCR par rapport aux 16 séquences de référence S de l'ADNr de H. pylori présentent une homologie plus élevée pour les amplicons obtenus sont résumés dans le tableau 1. L'abolition du Hinfl du site de restriction 587Mar Hp16S563 et entraîné à partir d'une substitution de nucléotide en position 958, originaires d'un EcoRI de site de restriction. Ainsi, les substitutions de nucleotides dans ces fragments de PCR 16 S 545 pb ont été confirmées par l'analyse de restriction de Eco RI (données non présentées). La signification biologique des substitutions nucléotidiques trouvées dans nos 16 S pylori
fragments PCR incultes H. doit être étudiée. Tableau 1 Comparaison des Helicobacter pylori 545 pb 16 S ADNr polymorphismes nucléotidiques entre les références et les souches de bactéries non cultivées
H. pyloristrain +
16 positions nucléotidiques S ADNr #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA
A
GAATCC
A
T
T
C
G
EU544200USA
AGA
A
GAATCC
A
T
T
T
G
Puno /Pérou
AGA
A
GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC
A
T
T
C
A
Hp16S644Mar
AGA
A
GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA
A
GAATTC
A
T
T
T
G
Hp16S587Mar
AGA
A
GAATTC
G
C
T
C
G
# basée sur la référence de H. pylori souche 26995; + Numéros d'accession de la séquence du H. pylori souches pour SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Pérou, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar et Hp16S567Mar sont, respectivement: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 et Genbank:. JQ315413]
Conclusions
Le haut niveau TetR H. pylori
génotype dépendant de AGA926-929TTC 16 S ADNr substitutions du gène n'a pas été trouvé dans notre population. Plus de recherche est nécessaire pour vérifier si H. pylori de taux élevé TetR est absent ou si elle est associée à un fond génétique bactérienne différente dans notre région. En outre, la signification biologique des substitutions nucléotidiques imprévues du Marilia Uncultured H. pylori
16 séquence partielle S ADNr a besoin d'une enquête plus approfondie.
Méthodes
1102 patients adultes résidant
patients dans la ville Marilia, São Paulo État, le Brésil, âgés de 19 à 91 ans, qui avait esophagogastroduodenoscopy consécutivement subi (EGD) pour la douleur abdominale supérieure ou symptômes dyspeptiques de Janvier 2003 à Juillet 2006 à la clinique gastro-entérologie ambulatoire de l'Hôpital das Clínicas de l'école médicale Marília, ont été inscrits dans cette Endoscopie de l'étude., biopsies
Le EGD a été accomplie par fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) ou vidéo-endoscope (GIF-100) à la fois de l'Olympe. Gastrique ou duodénal diagnostic d'ulcère a été défini par l'endoscopie et deux fragments du sinus maxillaire ont été collectés pour effectuer l'uréase rapide et des tests histopathologiques. La biopsie utilisée pour le test rapide à l'uréase a encore été soumis à l'extraction d'ADN. Le protocole utilisé est en accord avec la Déclaration d'Helsinki et a été approuvé par le Comité d'éthique en recherche chez l'humain de l'école de médecine Marilia, sous le numéro de référence 388/01.
Histologie
Un spécimen antraux a été fixé dans une solution de formol à 10% et noyés dans de la paraffine. Les sections ont été colorées pour Giemsa H. pylori
évaluation et ont été colorées avec l'hématoxyline et de l'éosine pour l'évaluation des modifications histopathologiques [38].
Extraction d'ADN et Polymerase chain reaction
réaction en chaîne de la polymérase et de l'analyse de restriction ont été mis en place avec la même biopsie utilisée pour le test rapide à l'uréase. Cela a été soumis à l'extraction d'ADN avec l'emploi du kit d'extraction d'ADN GFx acheté chez Amersham /Pharmacia Biotech, suivant les instructions du fabricant. L'ADN a été quantifié en électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant la faible échelle de masse Invitrogem et 50-100ηg ont été utilisés dans les réactions PCR avec le jeu d'amorces Hp16Sr1 (sens),): 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisens): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', qui amplifient un fragment conservé de 545 pb correspondant au H. pylori
16 gène S ARNr entre les positions nucléotidiques 700 et 1245 (numérotés selon le gène rrnA de H. pylori
souche 26695), modifié à partir de [32]. Dans toutes les réactions PCR négatif et un contrôle positif ont été utilisés correspondant à, respectivement, de l'eau stérile et deux uréase H. pylori différents
biopsies gastriques positifs provenant de patients PUD. état de PCR était de 94 ° C, 5 ', suivi par 40 cycles de 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' et d'un cycle à 72 ° C 7 ', avec un volume total de 25 ul contenant 1 x PCR tampon, 200 uM dNTP, mM MgCl 2.0 2, 1 pM oligoHp16Sr1, 1 pM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA Polymerase Platinum Brésil (Invitrogen), 2,5% de DMSO, 50ηg ADN. Les produits de PCR ont été résolus dans 1,5% de gels d'agarose colorés au bromure d'éthidium et photographié sous lumière UV.
De restriction et une analyse de séquençage
Les 16 amplicons ADNr S 545 pb obtenu par PCR à partir d'échantillons de biopsie ont été digérés avec Hinfl
I (Biolab - New England) selon les instructions du fabricant. Le motif de restriction prévisible pour la tétracycline souches
H. pylori sensibles correspond à deux fragments de 264 et 281 pb et pour H. pylori
souches à haute résistance à la tétracycline correspond à trois fragments de 281, 227 et 37 pb. Les produits de l'analyse de restriction ont été résolus dans 8% des gels d'acrylamide, colorés avec du bromure d'éthidium et photographié sous lumière UV. 16 S ARNr 545 amplicons pb PCR des deux pylori
biopsies H. de contrôle positif gastriques (Hp16S248Mar et 644Mar) et les deux amplicons présentant inattendues hinf
motifs de restriction I (Hp16S563Mar et Hp16S587bp) ont été soumis à un séquençage avec DyeTM Terminator v3.0 séquençage du cycle kit de réaction Ready et une machine ABI-3100 acheté chez Applied Biosystems, selon les instructions du fabricant. détermination de la séquence nucléotidique a été réalisée en double exemplaire et une analyse comparative a été réalisée par un alignement nucleotide BLAST de base [37] Les contributions de l'auteur
RBS et CMA effectué les études moléculaires et ont contribué à l'acquisition et l'interprétation des données. MAS a conçu les expériences, a contribué à l'analyse des données et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final
Remarques
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida a contribué également à ce travail
abréviations
PUD:..
Ulcère gastroduodénal

CG:
gastrite chronique
RGO:
maladie de reflux gastro-œsophagien
PCR:
Polymerase chain reaction
RFLP:
Restriction fragment Length Polymorphism
TetR: résistance à la tétracycline
.
Déclarations de REMERCIEMENTS
Nous sommes reconnaissants au Dr Adriana Augusta Pimenta de Barros pour ses soins à tous les patients inclus dans l'étude et le Dr David Howe pour sa contribution dans l'édition du la langue de manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo un Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), subvention de recherche 2006 /01223-0; Bourse CMA 2005 /04087-7.
Intérêts concurrents
Nous ne disposons pas tout à déclarer.

• altérations génomiques et sous-types moléculaires des cancers gastriques chez les Asiatiques
• Interobservateurs et intraobservateur accord pour la muqueuse gastrique atrophie