Afwezigheid van Helicobacter pylori hoge tetracycline resistente 16S rDNA AGA926-928TTC genotype in de maag biopten van dyspeptische patiënten van een stad in het binnenland van São Paulo, Brazil

Afwezigheid van Helicobacter pylori
hoge tetracycline resistente 16S rDNA AGA926-928TTC genotype in de maag biopten van dyspeptische patiënten van een stad in het binnenland van São Paulo, Brazilië vakantie abstracte achtergrond
Behandeling effectiviteit van Helicobacter pylori
varieert regionaal en wereldwijd afneemt, voornamelijk als gevolg van antibioticaresistente bacteriën. Tetracycline wordt over het algemeen opgenomen in tweede lijn H. pylori
uitroeiing regimes. In Brazilië, wordt een hoog niveau van tetracycline resistentie (TetR) vooral geassocieerd met AGA926-928TTC 16 S rDNA nucleotidesubstituties. Als H. pylori
cultuur is veeleisend, onderzochten we de primaire optreden van H. pylori
16 S rDNA hoog niveau TetR genotype met behulp van een moleculaire benadering rechtstreeks op de maag biopten van dyspeptische patiënten bijwonen achtereenvolgens bij het Ziekenhuis das Clinicas van Marilia, São Paulo, Brazilië.
Methods
Gastric biopten van 68 maagzweer (PUD) en 327 chronische gastritis (CG) van de patiënten met een positieve histologische diagnose van H. pylori
werden onderzocht op TetR 16 S rDNA genotype door een moleculaire assay gebaseerd op amplificatie van een 16 S rDNA 545 bp fragment door polymerasekettingreactie en HinfI
restrictiefragmentlengtepolymorfisme (PCR /RFLP). Door deze assay AGA926-928TTC 16 S rDNA TetR genotype resulteerde in drie DNA-fragment restrictiepatroon (281, 227 en 37 bp) en de afwezigheid ontstaan ​​twee DNA-fragmenten (264 bp en 281) door een 16 S rDNA geconserveerd Hinf I
restrictieplaats.
Resultaten Ondernemingen De 545 bp 16 S rDNA PCR-fragment werd geamplificeerd uit 90% van de maag biopten van histologische H. pylori
positieve patiënten. Hinfl
RFLP bleek afwezigheid van de AGA926-928TTC H. pylori
genotype en PCR-producten van twee patiënten toonde afwezigheid van de geconserveerde 16 S rDNA Hinfl
restrictieplaats. BLASTN sequentie analyse van vier amplicons (twee geconserveerde en twee met een onverwachte Hinfl
restrictiepatroon) bleek een 99% homologie met H. pylori
16 S rDNA uit Afrika, Noord- en Zuid-Amerikaanse bacteriële isolaten. Een nucleotide substitutie schafte de geconserveerde Hinfl
restrictieplaats in de twee PCR-fragmenten met onverwachte HinfI
RFLP, waardoor een EcoRI restrictieplaats
.
Conclusies
H. pylori
AGA926- 928TTC 16 S rDNA gen substituties werden niet gevonden in onze bevolking. Meer onderzoek is nodig om te onderzoeken of H. pylori
TetR heeft een andere genetische achtergrond in onze regio en als de nucleotidesubstituties van de onbeschaafde H. pylori
16 S rRNA gedeeltelijke sequenties biologische betekenis.
Trefwoorden
Helicobacter pylori
tetracyclineresistentie Helicobacter pylori
16 S rDNA op nucleïnezuur gebaseerde diagnose Helicobacter pylori
16 S rDNA polymorfisme Achtergrond
Het is algemeen aanvaard dat de Helicobacter pylori
, een Gram negatieve bacterie microaërofiele is geassocieerd met verscheidene spijsverteringskanaal ziekten zoals chronische gastritis, peptische en darmzweren, maagkanker en lymfoproliferatieve aandoeningen [1]. Er is geen gestandaardiseerde behandeling regime voor H. pylori infectie
[2] en zodra de bacterie wordt aangetroffen in gewijzigde maagslijmvlies, de aangewezen behandeling bestaat uit een drievoudige antibiotische behandeling zoals metronidazol, clarithromycine, amoxicilline, tinidazool, tetracycline en fluorchinolonen geassocieerde met een protonpompremmer zoals omeprazol, lansoprazol of pantoprazol [3-5] volgens antibioticavoorschriften voorwaarden van lokale medische zorg.
H. pylori
eradicatiepercentages met een aantal gecombineerde agenten en regimes zijn dicht bij 80% [6, 7], variërend van land tot land en regionaal binnen landen [8]. Verschillende factoren dragen bij tot dit lage H. pylori
genezing waaronder de inefficiëntie van het antibioticum penetratie in het maagslijmvlies, inactivering van het antibioticum door de zuursecretie van de maag [9], gebrek aan therapietrouw [10] en voornamelijk, noodgevallen en de toename van de H. pylori
antibiotica-resistente stammen [11]. Zo regionale H. pylori
weerstand toezicht is van groot belang voor onderzoek en behandeling van strategieën.
In Brazilië, een land van continentale afmetingen, het grootste deel van het beoefenen van clinici omvatten tetracycline in een tweede lijn behandeling regime na het falen van de klassieke drievoudige therapie bestaat uit claritromycine, amoxicilline en een protonpompremmer gedurende zeven dagen de tijd om H. pylori
-infectie [12] te overwinnen.
H. pylori
resistentie tegen tetracycline (TetR) is laag in de meeste landen [13-15], omgekeerd, in Latijns-Amerika, op basis van een klein aantal studies is aangetoond hoog te zijn in Chili [16] en in Brazilië [17]. Bovendien enkele jaren het optreden van TetR is toegenomen [15, 18-21]. Dienovereenkomstig, gezien het klinische belang van primaire H. pylori
antibioticaresistentie moet worden regionaal alvorens in uitroeiing regimes beschouwd. Ondernemingen De gouden standaard methode voor het bepalen van H. pylori in vitro gevoeligheid voor
antibiotica overeen met de isolatie van het micro-organisme door de cultuur. Vanwege de langzame groei en de bijzondere eisen van H. pylori
cultuur, deze benadering is niet betrouwbaar voor gebruik in de meeste routine klinische laboratoria, voornamelijk in ontwikkelingslanden. Derhalve moleculaire tests gericht op resistentie geassocieerde genmutaties rechtstreeks van biopsie specimens hebben het potentieel voor gebruik in grootschalige studies [22-25]. Ondernemingen De moleculaire mechanisme van TetR uit zijn binding aan een specifiek gebied 16 S rRNA, interactie gelaten met aminoacyl-tRNA transferase aan de A plaats van het ribosoom. Deze bindingsplaats is gedefinieerd atomaire resolutie ribosomen van Thermus thermophilus
gevormd door twee domeinen van het 16 S rRNA fractie bestaande uit helix 34 en de lus naast helix 31 [26, 27]. H. pylori
isolaten, de hoge mate van TetR is dankzij met name drie basemutaties, van AGA926-928 TTC, in het 16 S rRNA genen rRNA /B [28, 29]. Mutaties in één of twee van deze posities resulteert in een lage TetR [30, 31].
In Brazilië studies bij patiënten uit Bragança Paulista, Sao Paulo, bleek dat triple AGA926-928 TTC mutaties in alle TetR H. pylori
isolaten [32]. Dus, door een moleculaire benadering gebaseerd op een polymerasekettingreactie geassocieerd met restrictiefragment lengte polymorfisme (PCR-RFLP) analyse, hebben we de eerste voorkomen van H. pylori
hoog TetR direct gastrische biopten verkregen van dyspeptische patiënten ingediend tot gastroscopie bij het Ziekenhuis das Clinicas van Marilia, São Paulo, Brazilië, van januari 2003 tot juli 2006.
Resultaten en discussie
Gastric ziekte resultaat van 1102 patiënten het bijwonen van de gastro-enterologie polikliniek van het ziekenhuis das Clínicas van Marília werd onderzocht door endoscopie en histopathologie. Endoscopische bevinding van maag- of darmzweren ziekte (PUD) waren aanwezig in 119 patiënten. Verschillende mates van chronische gastritis (CG) waargenomen door histopathologie bij 693 patiënten en andere wijzigingen die overeenkomt meestal met gastro-oesofageale refluxziekte (GERD) en normale maagslijmvlies, gevonden in 290 patiënten. Sommige patiënten hadden meer dan een verandering, met de meest ernstige pathologie wordt overwogen in de analyse.
Detectie van H. pylori
is rechtstreeks afkomstig uit biopsie uitgevoerd door histologie, de gouden standaard H. pylori
diagnostische test die werkzaam zijn in onze klinische routine die samen met histopathologische analyse wordt gebruikt om te beslissen voor H. pylori
eradicatie. Van 119 PUD, 693 CG en 290 GERD samples, 76, 359 en 2, respectievelijk, waren positief voor H. pylori
door histologie.
Eenmaal ontdekt in maagslijmvlies, een klassieke H. pylori
uitroeiing triple regime is voorgeschreven in onze gastro-enterologie gezondheidszorg klinieken. Bij de eerste keus regime therapie niet in slaagt om H. pylori
uit te roeien, een tweede lijn regime met tetracycline is het meest aangegeven. H. pylori
antibiotica TetR varieert regionaal, die zeer laag in Europa en Noord-Amerika [2, 33, 34]. Echter, in Azië [15, 19, 35] en Latijns-Amerika, waaronder Brazilië [16, 32], een hoog percentage van de H. pylori
TetR is gevonden. Dus, om de keuze van H. pylori verbeteren
geassocieerde ziekte therapie, vooral in geval van een eerste uitroeiing falen, hebben we de regionale hoge H. pylori
TetR met een moleculaire benadering op basis van PCR en RFLP rechtstreeks via het maag biopsie gebruikt voor snelle ureasetest. Alleen biopsie monsters van de patiënten met een positieve H. pylori
diagnose door histologie werden opgenomen. Een 545 bp H. pylori
16SrDNA PCR-fragment werd verkregen van 89,5% (68/76) en 91,1% (327/359) van de maag biopten van PUD en CG patiënten. Aangezien beide tests werden uitgevoerd op één en ander gastrische biopsie en H. pylori infectie
presenteert een centraal kenmerk van infectie [36], de gevoeligheid van deze werkwijze te verbeteren, wordt meervoudige biopsie bemonstering aanbevolen.
Opeenvolgend, teneinde de grote bijbehorende puntmutaties te detecteren, AGA TTC op posities 926, 927 en 928 van de H. pylori
16 S rDNA geassocieerd met een hoog TetR en een uniek genotype kenmerk Braziliaanse TetR H. pylori
isoleert [32], de 545 bp 16 S rDNA PCR-fragment werd geknipt met Hinfl
. In deze H. pylori
16 S rDNA amplicon er een geconserveerd Hinfl
restrictieplaats, die een interne controle enzymdigestie bepaalt, resulterend in een twee DNA fragment restrictiepatroon, als de drievoudige AGA926-928TTC nucleotide substitutie afwezig. Van 395 PCR samples, 393 presenteerde de twee DNA-fragment restrictie patroon en twee PCR-producten verkregen uit een PUD (Hp16S563Mar) patiënt en een CG (Hp16S587bp) patiënten werden niet verteerd door Hinfl
. De hoge tetracycline resistente AGA926-928TTC genotype afhankelijk van H. pylori
16 S rDNA niet in onze bevolking was. Deze resultaten kunnen een indicatie van H. pylori
hoog niveau TetR afwezigheid of dat in onze regio andere 16 S rDNA nucleotidesubstituties of andere genetische factoren betrokken zijn bij tetracycline resistentie, zoals gevonden door andere studies [21] zijn. Meer onderzoek moet worden uitgevoerd om te bevestigen of uit te sluiten deze hypothesen.
Met het oog op de specificiteit van de 545 bp H. pylori
16 S rDNA PCR-producten uitgebreid vanuit de maag biopten te bevestigen, de 545 bp PCR-fragmenten verkregen uit twee H. pylori
positieve PUD patiënten gebruikt als controles in PCR-reacties (Hp16S248Mar en Hp16S644Mar), en de 545 bp PCR-fragmenten met onverwachte Hinfl
restrictiepatroon vernoemd Hp16S563Mar en Hp16S587bp, werden gesequenced en geanalyseerd door basic BLASTN zoeken [ ,,,0],37]. Alle vier sequenties gepresenteerd 99% homologie met de 16 S rDNA uit West- en Zuid-Afrika, Zuid-en Noord-Amerikaanse H. pylori
isolaten. De puntmutaties in elke PCR geanalyseerde sequentie vergeleken met de H. pylori
16 S rDNA referentiesequenties presenteren hogere homologie met de verkregen amplicons worden samengevat in Tabel 1. Afschaffing van de Hinfl
restrictieplaats van Hp16S563 en 587Mar resulteerde uit een nucleotide substitutie op positie 958, van oorsprong uit een EcoRI
restrictieplaats. Dus de nucleotide substituties in deze S 16 545 bp PCR fragmenten werden bevestigd door EcoRI
restrictie analyse (gegevens niet getoond). De biologische betekenis van nucleotidesubstituties vinden in onze 16 S uncultured H. pylori
PCR-fragmenten moet worden onderzocht. Tabel 1 Vergelijking van de Helicobacter pylori 545 bp 16 S rDNA nucleotide polymorphisms onder referenties en onbeschaafde bacterie stammen
H. pyloristrain +
16 S rDNA nucleotide posities #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA Hotels A
GAATCC Hotels A
T Shirts T Shirts C
G
2017WestAfrica
AGA Hotels A
GAATCC
Een
T Shirts T Shirts C
G
EU544200USA
AGA Hotels A
GAATCC Hotels A
T Shirts T Shirts T Shirts G
Puno /Peru
AGA Hotels A
GAATCC
G
C
T Shirts C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC Hotels A
T Shirts T Shirts C Hotels A
Hp16S644Mar
AGA Hotels A
GAATCC Hotels A
T Shirts G
C
G
Hp16S563Mar
AGA Hotels A
GAATTC Hotels A
T Shirts T Shirts T Shirts G
Hp16S587Mar
AGA Hotels A
GAATTC
G
C
T Shirts C
G
# gebaseerd op H. pylori
verwijzing stam 26.995; + Toetreding nummers van de H. pylori
reeks stammen voor SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Puno /Peru, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar en Hp16S567Mar zijn respectievelijk: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 en Genbank. JQ315413]
Conclusies
Het hoge niveau TetR H. pylori
genotype afhankelijk AGA926-929TTC 16 S rDNA gen vervangingen werd niet gevonden in onze bevolking. Meer onderzoek is nodig om te onderzoeken of H. pylori
hoge TetR afwezig is of wanneer het wordt geassocieerd met een verschillende bacteriële genetische achtergrond in onze regio. Ook de biologische betekenis van de onvoorziene nucleotidesubstituties van de Marilia onbeschaafde H. pylori
16 S rDNA partiële sequentie moet verder onderzoek.
Methods
Patiënten
1102 volwassen patiënten die wonen in de stad Marilia, São Paulo State, Brazilië, de leeftijd van 19-91 jaar, die achtereenvolgens ondergaan gastroscopie (EGD) voor pijn in de bovenbuik of dyspeptische symptomen van januari 2003 had tot en met juli 2006 op gastro-enterologie polikliniek van het ziekenhuis das Clínicas van Marília Medical School, werden geïncludeerd in deze studie.
endoscopie, biopsies Ondernemingen De EGD werd bereikt door fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) of video-endoscoop (GIF-100), beide van Olympus. Maag- of duodenale zweer diagnose werd bepaald door endoscopie en twee fragmenten van het antrum werden verzameld om de snelle urease en histopathologische tests. De biopsie voor de snelle ureasetest werd verder onderworpen aan DNA extractie. Het protocol dat wordt gebruikt is in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de Ethische Commissie in Human Research van Marilia Medical School, onder nummer 388/01.
Histologie
Een antral exemplaar werd gefixeerd in formol oplossing bij 10% en ingebed in paraffine. Secties werden Giemsa gekleurd voor H. pylori
evaluatie en werden gekleurd met hematoxiline en eosine voor de beoordeling van histopathologische veranderingen [38].
DNA-extractie en polymerase kettingreactie
polymerase kettingreactie en restrictie-analyse werden opgezet met dezelfde biopsie voor de snelle ureasetest. Dit werd aan DNA-extractie ingediend met de tewerkstelling van de GFX DNA-extractie kit gekocht van Amersham /Pharmacia Biotech, volgens de instructies van de fabrikant. DNA werd gekwantificeerd in agarose gelelektroforese met de Invitrogem lage massa ladder 50-100ηg werden gebruikt in de PCR-reacties met de vastgestelde Hp16Sr1 (sense)) primer: 5 'AAC ATT ACT GAC GCT GAT TG 3'; Hp16S r2 (antisense): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', die een geconserveerd fragment van 545 bp overeenkomende met de H. pylori versterken
16 S rRNA gen tussen nucleotideposities 700 en 1245 (genummerd volgens de rRNA-gen van H. pylori
stam 26.695), gewijzigd ten opzichte van [32]. In alle PCR-reacties een negatieve als een positieve controle gebruikt die overeenkomt met respectievelijk steriel water en twee verschillende H. pylori urease positieve
gastrische biopten van patiënten PUD. PCR conditie was 94 ° C 5 'gevolgd door 40 cycli van 94 ° C 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' en één cyclus bij 72 ° C 7 ', met een totaal volume van 25 ul bevattende 1 x PCR buffer, 200 uM dNTPs, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM oligoHp16Sr1, 1 uM oligo Hp16Sr2, 1,25 U Taq DNA Polymerase Platinum Brazilië (Invitrogen), 2,5% DMSO, 50ηg DNA. De PCR producten werden gescheiden op 1,5% agarosegelen gekleurd met ethidiumbromide en gefotografeerd onder UV-licht.
Beperkingen en sequentieanalyse
16 S rDNA 545 bp amplicons verkregen door PCR uit biopsie specimens werden gedigereerd met Hinf
I (Biolab - New England) volgens de instructies van de fabrikant. De voorspelbare beperking patroon voor tetracycline gevoelig H. pylori
stammen komt overeen met twee fragmenten van 264 en 281 bp en voor H. pylori
stammen met een hoge tetracycline weerstand komt overeen met drie fragmenten van 281, 227 en 37 bp. De producten van restrictie-analyse werden opgelost in 8% acrylamide gels, gekleurd met ethidiumbromide en gefotografeerd onder UV-licht. 16 S rRNA 545 bp PCR amplicons van twee H. pylori
positieve controle maagbiopten (Hp16S248Mar en 644Mar) en de twee amplicons presenteren onverwachte Hinf
restrictie patronen (Hp16S563Mar en Hp16S587bp) werden aan sequentiebepaling ingediend DyeTM Terminator v3.0 cyclus Sequencing Ready Reaction kit en een ABI-3100 machine gekocht bij Applied Biosystem, volgens de instructies van de fabrikant. Nucleotide sequentiebepaling werd uitgevoerd in duplo en vergelijkende analyse werd uitgevoerd door basic nucleotide BLAST uitlijning [37] uitgevoerd bijdragen
Auteur's
RBS en CMA voerde de moleculaire studies en heeft bijgedragen aan de verwerving en interpretatie van de gegevens.; MAS ontwierp de experimenten, hebben bijgedragen aan data-analyse en de opstellers van het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript
Notes
Rodrigo Buzinaro Suzuki, Cristiane Maria Almeida eveneens bijgedragen aan dit werk
Afkortingen
PUD:..
Maagzweer ziekte

CG:
Chronische gastritis
GERD:
gastro-oesofageale refluxziekte
PCR:
Polymerase kettingreactie
RFLP:
restrictiefragmentlengtepolymorfisme
TetR:
tetracyclineresistentie
.
verklaringen
Dankwoord
We zijn dankbaar voor Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros voor haar zorg aan alle patiënten opgenomen in de studie en Dr. David Howe voor zijn bijdrage in de editie van het manuscript taal. Dit werk werd ondersteund door de Fundação de Amparo een Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Research Grant 2006 /01223-0; Fellowship CMA 2005 /04087-7.
Competing belangen
We hebben geen te verklaren.

• Genomische veranderingen en moleculaire subtypes van maagkanker in Asians
• Interobserver en intraobserver overeenkomst maagslijmvlies atrophy