Отсутствие хеликобактерной высокой устойчивостью к тетрациклину 16S рДНК AGA926-928TTC генотип в желудочном биопсии от пациентов с диспепсией города в интерьере Сан-Паулу, Бразилия

Отсутствие хеликобактерной
высокой устойчивостью к тетрациклину 16S рДНК AGA926-928TTC генотип в желудочной биопсии от пациентов с диспепсией города в интерьере Сан-Паулу, Бразилия
Аннотация
Справочная информация
Эффективность лечения хеликобактерной
изменяется на региональном и снижается во всем мире, главным образом в результате устойчивых к антибиотикам бактерий. Тетрациклин, как правило, входит в вторая линия H. Pylori
режимов ликвидации. В Бразилии высокий уровень устойчивости к тетрациклину (TetR) в основном связан с AGA926-928TTC 16 S рДНК нуклеотидных замен. Как антихеликобактерную
культура привередливые, мы исследовали первичное возникновение хеликобактерной
16 S рДНК высокого уровня тетр генотип, используя молекулярный подход непосредственно на желудочных биопсий пациентов с диспепсией, принимающих участие последовательно в больнице Дас Clinicas из Марилия, Сан-Паулу, Бразилия.
Методы
желудочных биоптатов 68 язвенной болезни (PUD) и 327 хронический гастрит (CG) больных с положительным гистологической диагностики хеликобактерной
были исследованы на TetR 16 S рДНК генотип через молекулярный анализа, основанного на амплификации фрагмента 545 п.о. 16 S рДНК с помощью полимеразной цепной реакции и HinfI
полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР /ПДРФ). С помощью этого анализа, AGA926-928TTC 16 S рРНК TetR генотип привело к трем ДНК рестрикционной фрагмента (281, 227 и 37 п.н.) и его отсутствие произошло два фрагмента ДНК (264 и 281 п.н.) из-за 16 S рРНК законсервированы Hinf I
сайт рестрикции
. Результаты
545 п.н. 16 S рРНК ПЦР фрагмент амплифицировали из 90% желудочных биопсий из гистологических H. Pylori
положительных пациентов. HinfI
ПДРФ показало отсутствие AGA926-928TTC H. Pylori
генотипа и продуктов ПЦР двух пациентов показали отсутствие сохраняющийся 16 S рДНК HinfI
сайта рестрикции. BLASTN анализ последовательности из четырех ампликонов (два законсервированы и два с непредвиденной HinfI
рестрикционной) выявили 99% гомологии с к H. Pylori
16 S рДНК из Африки, Северной и Южной Америки бактериальных изолятов. Нуклеотидных замен отменила законсервированы HinfI
сайт рестрикции в двух ПЦР-фрагментов с непредсказуемых HinfI
ПДРФ, в результате EcoRI
сайта рестрикции.
Выводы
H. Pylori
AGA926- 928TTC 16 S рДНК генов замен не были найдены в нашей популяции. Необходимы дополнительные исследования, чтобы исследовать, если H. Pylori
TetR имеет другой генетический фон в нашем регионе, и если нуклеотидные замещения некультурных хеликобактерной
16 S рРНК частичные последовательности имеют биологическое значение.
Ключевые слова
хеликобактерной
устойчивость к тетрациклину хеликобактерной
16 S рДНК нуклеиновых кислот на основе диагностики хеликобактер пилори
16 S рДНК полиморфизма Фон
широко распространено мнение, что хеликобактер пилори
, на грамотрицательные бактерии микроаэрофильной , связано с несколькими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, таких как хронический гастрит, язву желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка и лимфопролиферативных расстройств [1]. Там нет стандартизированного режим лечения H.pylori
инфекции [2], и как только бактерия обнаружена в измененном слизистой оболочке желудка, указанное лечение состоит из тройного режима антибиотиками, включая метронидазол, кларитромицин, амоксициллин, тинидазол, тетрациклин и фторхинолоны связанного с ингибитором протонного насоса, такие как омепразол, лансопразол или пантопразол [3-5], в соответствии с политикой, отпускаемых по рецепту антибиотиков для местного медицинского обслуживания.
H. Pylori
эрадикации с рядом комбинированных препаратов и схем близки к 80% [6, 7], варьируется от страны к стране и на региональном уровне в странах [8]. Несколько факторов способствуют этой низкой скорости H. Pylori
исцеления в том числе неэффективностью проникновения антибиотика в слизистой оболочке желудка, инактивация антибиотика путем кислотной секреции желудка [9], отсутствие соблюдения пациентом [10] и главным образом, аварийные случаи и увеличение устойчивых к антибиотикам H. Pylori
штаммов [11]. Таким образом, региональные H. Pylori
наблюдение сопротивления имеет большое значение для тестирования и лечения стратегий.
В Бразилии, стране континентальных размеров, большинство практикующих врачей включают тетрациклин во второй схеме лечения линии после выхода из строя классическая тройная схема состоит из кларитромицин, амоксициллин и ингибитор протонной помпы в течение семи дней, чтобы преодолеть H. Pylori
инфекции [12].
H. пилори
устойчивость к тетрациклину (тетр) низка в большинстве стран [13-15], и наоборот, в Латинской Америке, в соответствии с небольшим числом исследований, было показано, что высокий в Чили [16] и в Бразилии [17]. Кроме того, в течение нескольких лет заболеваемость тетр увеличивается [15, 18-21]. Соответственно, с учетом клинической важности первичной H. Pylori
устойчивости к антибиотикам, его следует рассматривать на региональном уровне, прежде чем включены в режимы ликвидации.
Стандартный метод золота для определения H. Pylori в пробирке
восприимчивости к антибиотики соответствует выделения микроорганизма культурой. Тем не менее, из-за медленного роста и конкретных требований антихеликобактерной
культуры, этот подход не является надежным для использования в большинстве обычных клинических лабораториях, главным образом в развивающихся странах. Следовательно, молекулярные тесты, нацеленные на сопротивление генные мутации, связанные непосредственно с биоптатах имеют потенциал для использования в крупномасштабных исследованиях [22-25].
Молекулярный механизм TetR состоит из его связывания с конкретным 16 S рРНК, взаимодействующих стоически с трансферазы аминоацил-тРНК на участке площадью рибосомы. Этот сайт связывания был определен атомным разрешением в рибосом Thermus thermophilus
образована двумя доменами фракции 16 S рРНК, состоящей из спирали 34 и петлю рядом с спираль 31 [26, 27]. В H. Pylori
изолятов, высокая степень тетр в основном за счет трех основных мутаций, от AGA926-928 к ТТС, в 16 S рРНК генов рРНК /B [28, 29]. Мутации в одном или двух из этих позиций приводит к низкому уровню тетр [30, 31].
В Бразилии, исследования, проведенные на больных Браганса Паулиста, Сан-Паулу, показал, что тройная AGA926-928 к TTC мутации обнаружены в все TetR H. Pylori
изолятов [32]. Таким образом, используя молекулярный подход, основанный на полимеразной цепной реакции, связанной с полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) анализа, мы исследовали основную частоту антихеликобактерной
высокий уровень тетр непосредственно в желудочной биопсии, полученных от пациентов с диспепсией, представленных чтобы гастроскопия в больнице дас Clinicas из Марилия, Сан-Паулу, Бразилия, с января 2003 по июль 2006 года
Результаты и обсуждение
Желудочный исхода заболевания 1102 пациентов, принимающих участие в гастроэнтерологии амбулаторную клинику больницы дас Clinicas из Marília исследовался эндоскопии и гистология. Эндоскопические нахождение язвенной или язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (PUD) присутствовали у 119 пациентов. Различные степени хронического гастрита (ХГ) наблюдались гистопатологией в 693 пациентов, и другие изменения, соответствующие главным образом к гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) и нормальной слизистой оболочки желудка, были обнаружены у 290 пациентов. Некоторые пациенты представили более одного изменения, с наиболее тяжелой патологией рассматривается в анализе.
Выявление хеликобактерной
проводили непосредственно из биопсии гистологически, стандарт H. Pylori золото
диагностический тест занятых в нашей повседневной клинической практике, которая вместе с гистопатологического анализа используется для принятия решения для H. Pylori
эрадикационной терапии. Из 119 ЯБДПК, 693 CG и 290 образцов ГЭРБ, 76, 359 и 2, соответственно, были положительными на H. Pylori
гистологически.
После обнаружения в слизистой оболочке желудка, классическая H. Pylori
искоренение тройной режим назначают в наших клиниках гастроэнтерологии здравоохранения. При первом режим выбора терапии не удается искоренить H. Pylori
, второй режим строка, содержащая тетрациклин является наиболее указано. H. Pylori
антибиотик TetR изменяется на региональном уровне, будучи очень низкими в Европе и Северной Америке [2, 33, 34]. Тем не менее, в Азии [15, 19, 35] и в Латинской Америке, включая Бразилию [16, 32], высокой скорости H. Pylori
тетр был найден. Таким образом, для того, чтобы улучшить выбор антихеликобактерной
сопутствующее заболевание терапии, главным образом в случае отказа первого эрадикации, мы исследовали региональный высокий уровень антихеликобактерной
тетр с использованием молекулярного подход, основанный на ПЦР и ПДРФ непосредственно из той же биопсии желудка, используемого для быстрого уреазного теста. были включены только образцы биопсии от пациентов с положительными H. Pylori
диагноза гистологии. 545 п.н. H. Pylori
16SrDNA ПЦР-фрагмент получали с 89,5% (68/76) и 91,1% (327/359) желудочных биопсий из PUD и CG пациентов, соответственно. Как были выполнены оба теста на одном и другом биопсии желудка и антихеликобактерную
инфекция представляет фокальную характеристику инфекции [36], с целью повышения чувствительности этого метода, отбор проб множественный биопсия рекомендуется.
Последовательно, в порядке для выявления основных связанных точечных мутаций, AGA к ТТС в положениях 926, 927 и 928 из этой H. Pylori
16 S рДНК, связанных с высоким уровнем тетр и уникальным генотипом характеризуется в бразильском TetR хеликобактерной
изолирует [32] 545 п.н. 16 S рРНК ПЦР-фрагмент был ограничен с HinfI
. В этом H. Pylori
16 S рДНК ампликонов есть консервативный HinfI
сайт рестрикции, который обеспечивает внутренний контроль ферментов пищеварения, в результате чего два ДНК рестрикционной фрагмент, когда тройка AGA926-928TTC нуклеотидная замена нет на месте. Из 395 образцов ПЦР, 393 представила две ДНК-фрагмент рестрикционную и две ПЦР-продукты, полученные из PUD (Hp16S563Mar) пациента и (Hp16S587bp) пациента CG не усвоенного HinfI
. Высокой устойчивостью к тетрациклину AGA926-928TTC генотипа зависит от H. пилори
16 S рДНК не присутствовал в нашей популяции. Эти результаты могут свидетельствовать о хеликобактерной
высокого уровня TetR отсутствие или, что в нашем регионе другие 16 S рДНК нуклеотидные замены или различные генетические факторы, которые участвуют в тетрациклиновой резистентности, как было обнаружено в других исследованиях [21]. Больше исследования должно быть проведено, чтобы подтвердить или исключить эти гипотезы.
Для того чтобы подтвердить специфичность H. 545 п.н. пилори
16 продуктов S рДНК амплифицировали с помощью ПЦР из желудка биопсии, 545 п.о. PCR фрагменты, полученные из два антихеликобактерную
положительных пациентов PUD используемые в качестве контроля в ПЦР-реакциях (Hp16S248Mar и Hp16S644Mar), и 545 п.о.-ПЦР-фрагменты с непредвиденное HinfI рестрикционной
именем Hp16S563Mar и Hp16S587bp, секвенировали и анализировали с помощью простого поиска BLASTN [ ,,,0],37]. Все четыре последовательности представлены 99% гомологии с 16 S рРНК из Западной и Южной Африки, Южной и Северной Америки h.pylori
изолятов. Точечные мутации, найденные в каждой анализируемой последовательности ПЦР по сравнению с H. Pylori
16 эталонных последовательностей S рДНК представляющих более высокую степень гомологии с полученными ампликонов приведены в таблице 1. Упразднение HinfI
сайта рестрикции из Hp16S563 и 587Mar привели из нуклеотидных замен в положении 958, происходящий в одном из
EcoRI сайт рестрикции. Таким образом, нуклеотидные замены в этих 16 S 545 п.о. PCR фрагменты были подтверждены EcoRI
рестрикционного анализа (данные не показаны). Биологическое значение нуклеотидных замен в наших 16 S некультурных H. Pylori
ПЦР-фрагменты должны быть исследованы. Таблица 1 Сравнение хеликобактерной 545 п.н. 16 S рДНК нуклеотидных полиморфизмов среди ссылок и некультурных штаммов бактерий
H. pyloristrain +

16 S рДНК нуклеотидные позиции #

926-928

947

954-959

981

988

1092

1093

1097

SouthAfrica07
AGA

GAATCC

T
T
C
G
2017WestAfrica
AGA

GAATCC
а
T
T
C
G
EU544200USA
AGA

GAATCC

T
T
T
G
Пуно /Перу
AGA

GAATCC
G
C
T
C
G
Hp16S248Mar
AGA
G
GAATCC

T
T
C

Hp16S644Mar
AGA

GAATCC
A
T
G
C
G
Hp16S563Mar
AGA

GAATTC

T
T T

G
Hp16S587Mar
AGA

GAATTC
G
C
T
C
G
# на основе H. Pylori
ссылки штамм 26995; + Число присоединяющихся последовательности в H. Pylori
штаммов для SouthAfrica07, 2017WestAfrica, EU544200USA, Пуно /Перу, Hp16S248Mar, Hp16S644mar, Hp16S563Mar и Hp16S567Mar являются соответственно: [Genbank: CP002336.1, Genbank: CP002571.1, Genbank: EU544200.1, Genbank: CP002982.1, Genbank: JQ315410, Genbank: JQ315411, Genbank: JQ315412 и Genbank:. JQ315413]
Выводы
высокий уровень TetR H. Pylori
генотипа зависимые от AGA926-929TTC 16 S рДНК ген замен не был найден в нашей популяции. Необходимы дополнительные исследования для изучения, если H. Pylori
высокий уровень TetR отсутствует или если оно связано с другим бактериальным генетического фона в нашем регионе. Кроме того, биологическое значение непредсказуемых замен нуклеотидов в Марилия некультурных H. Pylori
16 S рДНК частичная последовательность нуждается в дальнейшем исследовании.
Методы
пациентов
1102 взрослых пациентов житель в городе Марилия, Сан-Паулу Государство, Бразилия, в возрасте от 19 до 91 лет, которые были последовательно прошли необходимую эзофагогастродуоденоскопию (EGD) для верхней боли в животе или симптомы диспепсии с января 2003 года по июль 2006 года в гастроэнтерологии амбулатории больницы дас Clinicas из Marília медицинской школы, были включены в эту
исследование. эндоскопия, биопсия
EGD была выполнена с помощью fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) или видео-эндоскоп (GIF-100) и от Olympus. Язвы желудка или двенадцатиперстной диагноз Язва была определена эндоскопии и были собраны два фрагмента антральном для выполнения быстрого уреазы и гистологической тесты. Биопсия используется для быстрого уреазного теста был дополнительно представлен экстракции ДНК. Протокол, используемый в согласии с Хельсинской декларацией и было одобрено Комитетом по этике в области исследований человека из Marilia медицинской школы путем, под номером ссылки 388/01.
Гистологии
Один антральных образца фиксировали в растворе формальдегида на 10% и заливали в парафин. Срезы окрашивали Гимза для H. оценки пилори
и окрашивали гематоксилином и эозином для оценки гистологических изменений [38].
Экстракции ДНК и полимеразной цепной реакции
полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа были созданы с та же биопсия используется для быстрого уреазного теста. Это было представлено экстракции ДНК с занятостью набора для экстракции ДНК GFX, приобретенной у Amersham /Pharmacia Biotech, следуя инструкциям изготовителя. ДНК количественно оценивали в электрофореза в агарозном геле с использованием малой массы лестницы Invitrogem и 50-100ηg использовали в реакции ПЦР с использованием набора праймеров Hp16Sr1 (смысл),): 5 'ААС АТТ АКТ GAC GCT GAT Т. 3'; Hp16S r2 (антисмысловой): 5 'TGG CTC CAC TTC GCA GTA TT 3', который усиливает законсервированный фрагмент 545 пар оснований, соответствующий H. Pylori
16 гена S рРНК между нуклеотидов 700 и 1245 (пронумерованные в соответствии с рРНК гена хеликобактерной
штамма 26695), модифицированный из [32]. Во всех реакциях ПЦР отрицательный и положительный контроль были использованы, соответствующие, соответственно, стерильная вода и два различных уреазы H. Pylori
положительные биопсии желудка у пациентов PUD. ПЦР состояние было 94 ° С 5 ', а затем 40 циклов при 94 ° С в 1' /55 ° C 1 '/72 ° C 1' и один цикл при 72 ° С 7 ', с общим объемом 25 мкл, содержащей 1х ПЦР буфер, 200 мкМ дНТФ, 2,0 мМ MgCl <суб> 2, 1 мкМ oligoHp16Sr1, 1 мкМ олиго Hp16Sr2, 1,25 U Taq ДНК полимераза Платиновый Бразилия (Invitrogen), 2,5% ДМСО, 50ηg ДНК. Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете.
Ограничение и анализ последовательности
16-S рДНК ампликонов 545 п.о., полученные с помощью ПЦР из образцов биопсии были переварены Hinf
I (БиоЛАБ - Новая Англия) в соответствии с инструкциями изготовителя. Предсказуемы шаблон ограничения для тетрациклину штаммов, восприимчивых H. Pylori
соответствует двум фрагментам 264 и 281 пар оснований и для H. Pylori
штаммов с высокой устойчивостью к тетрациклину соответствует трем фрагментам 281, 227 и 37 пар оснований. Продуктами анализа были расщеплены в 8% полиакриламидных гелях, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете. 16 S рРНК 545 п.о. PCR ампликонов из двух H. Pylori
позитивный контроль желудочных биопсий (Hp16S248Mar и 644Mar) и двух ампликонов представляющих неожиданные Hinf
паттерны рестрикции I (Hp16S563Mar и Hp16S587bp) были представлены секвенирования с DyeTM Терминатор v3.0 цикл Секвенирование Готовый комплект реакции и ABI-3100 машина приобрести у фирмы Applied Biosystems в соответствии с инструкциями изготовителя. Определение нуклеотидных последовательностей проводили в двух экземплярах и сравнительный анализ был проведен основной выравнивании нуклеотид BLAST [37] Вклад
автора
RBS и CMA, проведенные молекулярные исследования и способствовали приобретению и интерпретации данных. MAS разработаны эксперименты, способствовали анализу данных и подготовил рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи
Примечания
Родриго Buzinaro Suzuki, Кристиане Мария Алмейда способствовали в равной степени к этой работе
Сокращения
PUD:..
Язвенная болезнь

CG:
Хронический гастрит

ГЭРБ:
Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь

ПЦР:
полимеразной цепной реакции

ПДРФ:
длины рестрикционных фрагментов полиморфизм

TetR:
Тетрациклин сопротивление
.

декларациях
Подтверждения
Мы благодарны доктору Adriana Augusta Pimenta де Баррос для ее ухода на всех пациентов, включенных в исследование, и д-р Дэвид Хау за его вклад в издание язык рукописи. Эта работа была поддержана Fundação де Ампаро Pesquisa сделать Estado-де-Сан-Паулу (FAPESP), Научно-исследовательский грант 2006 /01223-0; Товарищество CMA 2005 /04087-7.
Конкурирующие интересы
У нас нет какой-либо объявлять.

Исследования

Исследования

Other Languages