Upptäckt av promotor hypermethylation av CpG ön E-cadherin i magsäcken hjärt adenocarcinoma

detektering av promotor hypermethylation av CpG ön E-cadherin i magsäcken hjärt adenokarcinom Bild Sammanfattning
Sikta
Onormal hypermetylering av CpG-öar i samband med tumörsuppressorgener kan leda till transkriptionstyst i neoplasi. Syftet med denna studie var att undersöka promotor metylering och uttryck av E-cadherin genen i magsäcken hjärt adenokarcinom (GCA).
Metoder Review, en kapslad MSP tillvägagångssätt var immunohistokemi metod och RT-PCR användes respektive för att undersöka metyleringsstatus av 5'-CpG-ö av E-cadherin, dess proteinexpression och mRNA-expression i tumörer och motsvarande normala vävnader.
Resultat
E-cadherin metylerades i 63 av 92 (68,5%) tumörprov, som var signifikant högre än i motsvarande normala vävnader (P < 0,001). Metylering frekvenser i steg III och IV tumörvävnad var signifikant högre än i fas I och II tumörvävnader (P = 0,01). Metyleringsstatus av dålig differentiering gruppen var signifikant högre än måttlig och dålig-måttlig differentierings grupperna (P < 0,01). Genom immunfärgning 51 av 92 tumör tisssues visade heterogena, positiv immunfärgning av tumörvävnad (44,6%), som väsentligt avviker från matchade normala vävnader (P < 0,001). Positiv immunofärgning av stadium III och IV tumörvävnad var betydligt lägre än steg I och II tumörvävnader (P < 0,01). Dålig differentiering gruppen var också betydligt lägre än måttlig och dålig moderata differentiering grupper (P < 0,05). 80 procent av tumörvävnader med E-cadherin genen metyleras visade inaktiv mRNA-expression.
Slutsatser
Hög metylering status 5 'CpG ön E-cadherin genen kan vara en av mekanismerna i utvecklingen av gastric hjärt adenokarcinom .
Nyckelord
E-cadherin metylering gastric hjärt adenokarcinom Introduktion
E-cadherin är en M r 120.000 transmembranglykoprotein uttrycks på epitelceller och är ansvarig för homofil, Ca 2 + -beroende intercellulär adhesion som är nödvändig för bibehållande av normal vävnadsarkitektur i epitelvävnader [1]. Den cytoplasmatiska domänen av E-cadherin binder till a-, β-, och y-catenins, vilka i sin tur kopplad till actins, och denna interaktion är kritisk för dess funktion [2]. Cell-cell och cell-matrix interaktioner avgörande inblandade i neoplastisk transformation och metastaser [3, 4]. Defekta cellvidhäftning kan bidra till förlust av kontaktinhibition av tillväxt och förlust av cellvidhäftning kan svara för förmågan hos cancerceller att passera normala vävnadsgränser och metastas [5]. Vikten av E-cadherin för att upprätthålla cellvidhäftning innebär att dess dysfunktion kan spela en viktig roll i tumörbildning. Förlust av E-cadherin expression sker i en mängd olika humana tumörer och är en hypotes att vara ett viktigt steg i utvecklingen från tumörbildning till invasion och metastas [6].
Under de senaste åren, finns det flera studier på den kritiska roll E-cadherin i tumörbildning. Det har visats att bakterielinje mutationer av E-cadherin-genen är relaterad till familjär mag- och kolorektal cancer [7, 8]. Vidare somatiska mutationer av E-cadherin hittades också i gastrisk carcinom och allel förlust av E-cadherin-lokuset vid 16q22.1 har rapporterats i olika epiteliala tumörer såsom bröstcancer, äggstockscancer, endometrial, och prostatakarcinom [9, 10] . Med undantag för denna genetiska förändringar, epigenetisk förändring inkluderar hypermetylering av 5 "CpG-ö i promotorn E-cadherin är också ansvarig för transkriptionsundertryckandet av genen [11]. Det är känt att onormal hypermetylering av CpG-öar associerade med tumörsuppressorgener kan leda till transkriptionell tystande i neoplasi [12]. I själva verket, metylering associerade tysta E-cadherin representerar den vanligaste orsaken till dess inaktivering i ett flertal cancerformer, såsom lever, prostata, bröst och matstrupen [13-15].
Gastric hjärt adenokarcinom (GCA), som tidigare var registrerad som matstrupscancer eller magsäckscancer, har diagnostiserats oberoende i mycket de senaste åren, på grund av förbättringen i början av endoskopisk screening och patologisk diagnos. Kina är ett land med hög incidens regioner GCA, speciellt i Taihangbergen i norra Kina. Yttre faktorer, inklusive kost brist, ohälsosamma levnadsvanor, konsumtion av alkohol och tobak, är patogena infektioner i allmänhet anses vara riskfaktorerna för att utveckla GCA i Kina [16-18]. Dock kan endast en delmängd av individer som utsätts för de ovan angivna exogena riskfaktorer skulle utveckla GCA, vilket tyder på att flera genetiska och epigenetiska händelser bidrar till utvecklingen av GCA. Det är nu alltmer erkänt att epigenetisk tysta genuttryck genom promotorn CpG hypermethylation är ett viktigt alternativ mekanism i inaktive tumörsuppressorgener och tumörassocierade gener i cancer [19]. Mutationer av E-cadherin-genen är ovanliga i GCA, alltså, i denna studie, har vi utvärderat rollen av metylering av 5 'CpG-ö av E-cadherin och dess korrelation med reducerad E-cadherin-uttryck i GCA.
Metoder
patienter och prover
tumör- och parade normala vävnadsprover erhölls från 92 patienter. Dessa vävnader var uppdelade i två parallella delar, en del frystes och lagrades vid -80 ° C tills RNA extraherades, den andra delen var formalinfixerade och paraffininbäddade. Fallen var alla inneliggande patienter för kirurgisk behandling i det fjärde Anslutna sjukhuset, Hebei Medical University mellan 2004 och 2006. Histologisk tumör typning utfördes på grundval av utskurna prover i Department of Pathology av samma sjukhus. Alla gastriska hjärt karcinom var adenokarcinom med sina epicenters vid matstrupsövergången, dvs från 1 cm ovan tills 2 cm under förbindelsen mellan änden av den rörformiga matstrupen och början av den saccular mage [20]. Information om TNM stadieindelning fanns från sjukhus inspelningar och patologisk diagnos. Studien godkändes av den etiska kommittén Hebei Cancer Institute och informerat samtycke erhölls från alla rekryterade patienter.
Metylering specifik polymerase chain reaction (MSP) för E-kadherinpromotorn metylering
Iskt DNA från mag hjärt adenokarcinom och angränsande icke-maligna sektioner isolerades från paraffininbäddade vävnads glider genom standardmetoder med användning av en förenklad proteinas K-spjälkning metod. För att undersöka DNA-metyleringsmönster, behandlade vi genomiskt DNA med natriumbisulfit, såsom beskrivits tidigare [21]. I korthet, 2 ^ g DNA denaturerades med 2 M NaOH vid 37 ° C under 10 minuter, följt av inkubering med 3 M natriumbisulfit, pH5,0, vid 50 ° C under 16 timmar. Bisulfit behandlade DNA renades sedan (DNA Cleanup Kit; Promega, Madison, Wisconsin, USA), inkuberades med 3 M NaOH vid rumstemperatur under fem minuter, utfälldes med 10 M ammoniumacetat och 100% etanol, tvättades med 70% etanol, och suspenderades i 20 yl destillerat vatten. Review, en kapslad PCR tillvägagångssätt användes för att bestämma metylering status inom E-cadherin CpG-ö i exon 1 (sekvens -126 bp till 144 bp i förhållande till transkriptionsstart, GenBank tillträdesnummer D49685 ) som tidigare publicerats [15]. I den första omgången av PCR, 100 ng av bisulfit-behandlad DNA amplifieras. De sekvenseringsprimrar var 5'-GTTTA GTTTTGGGGAGGGGTT-3 '(sens) och 5'-ACTAC TACTCCAAAAACCCATAACTAA-3' (antisens), och de cykelbetingelser var en cykel av 95 ° C under 5 min, följt av 30 cykler av 95 ° C i 30 s, 50 ° C under 30 s, 72 ° C under 30 s, och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min. Storleken av produkten efter denna initiala PCR-reaktion var 270 bp. För den andra omgången av PCR, var denna produkt utspäddes 1: 50 i vatten, och 2 | il av utspädningen användes för MSP. Kapslade primersekvenser för E-cadherin för den metylerade reaktionen var 5'-TG TAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC-3 '(sens) och 5'-CGAATACGATCGAATCGAACCG-3' (antisens), och primersekvenser för ometylerade reaktionen var 5'-TGGTTGTAGTTATGTATTTATT TTTAGTGGTGTT-3 '(sens) och 5'-ACACCAAATA CAATCAAATCAAACCAAA-3' (antisens). PCR-parametrarna var enligt ovan, med undantag av att de glödgningstemperaturer för de metylerade och ometylerade reaktionerna var 64 ° C och 62 ° C, respektive. Produkt storleken på de metylerade och ometylerade reaktionerna var 112 och 120 bp, respektive. Den bröstcancercellinje MB-MDA-231, vilket visar metylering och tystande av E-cadherin och reagensblankprov användes som positiva och negativa kontroller.
Immunhistokemisk färgning för E-cadherin
E-cadherin expression bestämdes genom immunofärgning genom att använda avidin-biotin komplex immunoperoxidas metod, som genomfördes på parallella histopatologiska sektioner från paraffininbäddade tumörsektion och parade normal vävnad. Endogen peroxidasaktivitet blockerades med 3% väteperoxid under 10 minuter, följt av mikro antigenåtervinning under nio minuter vid 98 ° C i 10 mM natriumcitratbuffert (pH 6,0) och inkuberades i 2% normalt hästserum för att minimera icke-specifik bindning. Objektglasen sekventiellt inkuberades med primära monoklonala, mus-anti-E-cadherin-antikropp (1: 100 spädning i fosfatbuffrad saltlösning, Santa Cruz, sc-8426) över natten vid 4 ° C, biotinylerad sekundär antikropp under 30 min vid 37 ° C och ABC-reagens under 45 minuter vid 37 ° C. 0,5% 3,3'-Diaminobenzidine (Sigma, St Louis, MO) användes som kromagen. För en negativ kontroll, var den primära antikroppen ersattes med mus-IgG. Diabilder med normal magslemhinna användes som en positiv kontroll.
Mätning av mRNA-expression av E-cadherin
RNA extraherades från frysta avsnitt vävnader genom standardmetoder med användning av Trizol (Invitrogen, USA). cDNA syntetiserades med användning av Advantage RT-for-PCR-kit (Clontech, Palo Alto, CA) med oligo (dT) priming som rekommenderas i protokollet tillhandahålls. GAPDH-genen användes som en kontroll. Primersekvenser av E-cadherin var 5 ° ‰ -CGACCCAACC CAAGAATCTA-3 ° ‰ (känsla) och 5 ° ‰ -AATGGCAG GAATTTGCAATC-3 ° ‰ (antisens), primer sekvens av GAPDH var 5 ° ‰ -GGGAAACTGTGGCGT GAT-3 ° ‰ (känsla) och 5 ° ‰ -GTGGTCGTTGAGGG CAAT-3 ° ‰ (antisens), produktstorlek var 202 bp och 342 bp, respektive. PCR-produkter löstes på 2% agarosgeler och signalintensitet kvantifierades med hjälp av en dator bildsystem. Nivåerna av gentranskript kvantifierades som förhållandet mellan intensiteten av E-cadherin-signalen mot intensiteten för β-aktin. Inaktiv expression poängsattes när uttryck av en E-cadherin-genen i tumörprovet var < 25% av dess uttryck i motsvarande normala provet.
Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med användning av SPSS10.0 programpaket (SPSS Company, Chicago, Illinois, USA). Fishers exakta test och Chi-square test användes för att utvärdera statistisk signifikans av skillnader och jämföra kategoriska associationer. Två-sidiga test användes för att bestämma betydelsen, och p-värden mindre än 0,05 betraktades som statistiskt signifikant för alla statistiktester.
Resultat
Subject egenskaper
Såsom visas i tabell 1, var 92 GCA patienter som erhölls i denna forskning, inklusive 73 manliga och 19 kvinnliga, varierade ålder från 38 ~ 76, medelålder 56,9. Samtliga fall klassificerades i fyra tumör nod-metastas (TNM) stadier enligt UICC standard, 8, steg I (8,7%), 32 i steg II (34,8%), 38 av stadium III (41,3%), 14 av steg IV (15,2%). Enligt de patologiska faserna ades fall delas in i 3 grupper, 42 (45,7%) av måttlig grupp, 34 (36,9%) av dålig måttlig grupp och 16 (17,4%) av dålig group.Table 1 Kliniska och patologiska egenskaper hos GCA patienter
Grupper
n (%)
Sex
Man
73 (79,3) katalog Kvinna
19 (20,7 ) katalog medelåldern i år (SD) Review 56,9 (8,86) Review TNM stadium
jag
8 (8,7) Review II
32 (34,8) Review III
38 (41,3) Review IV
14 (15,2) Review Patologisk differentiering av tumör
måttlig
42 (45,7) Review dålig måttlig
34 (36,9)
dålig
16 (17,4) Review metylering analys av E-cadherin genen
metylering analys genomfördes framgångsrikt i alla tumörer och parade normala vävnadsprover (Figur 1). För 10% av proven, var metyleringsanalys upprepas för kvalitetskontroll. I 63 (68,5%) av 92 GCA tumörer E-cadherin metylering upptäcktes, medan endast i 10 (10,9%) av parade normala vävnader E-cadherin metylering upptäcktes. Frekvensen av E-cadherin metylering av tumörvävnader var betydligt högre än parade normala vävnader (P < 0,001). När skiktad för TNM steg, frekvens av E-cadherin genen metylering av GCA patienter med stadium III och steg IV (78,8%) var betydligt högre än GCA patienter med steg I och steg II (55%) (χ2 = 5,96, p = 0,01 ). När stratifierat för patologiska stadier, de E-cadherin genen metylering frekvenser av måttlig, dålig måttlig och dålig grupp var 52,4%, 73,5% och 100%, frekvensen av E-cadherin genen metylering av dålig grupp betydligt högre än i måttlig och dålig -moderate grupper (χ2 = 8,92, P = 0,003) (tabell 2). Figur 1 metylering analys av E-cadherin i tumörvävnad (T) och motsvarande normal vävnad (N). u: indikerar närvaron av ometylerade gener; m: indikerar närvaron av metylerade gener. Fall 1 och 2: tumörspecifik metylering; Fall 3: tumören är fullt metylerade, medan motsvarande normal vävnad har en mycket svagt band som visar metylering; Fall 4: både tumör och motsvarande normal vävnad ometylerade
Tabell 2 E-cadherin metylering och immunhistokemiska färgningsegenskaperna hos GCA patienter
<. col> Group
metylering status
P
Immunohistokemisk färgning
P
M
U Omdömen -
+
TNM stadium
jag
4 4
2 Review 6 II
18
14
13
9
III
29
9
26
12
IV
12 2
0.015a
10 4
0.002a
patologisk differentiering av tumör
måttlig
22
20
20 2
dålig måttlig
25
9
18 16
dålig
16
0
0.003b
13 3
0.022b
ett P-värde av steg III och IV patienter mot stadium i och II patienter b P-värde av dålig differentiering grupp mot måttliga och dålig-måttlig grupper
Immunfärgning färgning~~POS=HEADCOMP av E-cadherin-genen
Såsom visas i tabell 2, färgningen var heterogena i 51 tumörvävnader, tumörceller med minskad membranös E-cadherin-färgning blandades med tumörceller visar en stark membranfärgning (Figur 2). Frekvens av proteinuttryck var 44,6% i tumörvävnad, medan parade normala vävnadsprover alla visade diffus stark membran E-cadherin färgning. Frekvens av proteinuttryck var signifikant olika mellan tumör och parade normala vävnader (P < 0,001). När skiktad för TNM steg, frekvens av E-cadherin genen proteinuttryck i steg III och IV tumörvävnader (30,8%) var signifikant lägre än i fas I och II tumörvävnader (62,5%) (χ2 = 9,21, p = 0,002) . Frekvens av E-cadherin genen proteinuttryck av dålig grupp betydligt lägre än i måttlig och fattiga måttlig grupper (χ2 = 5,23, p = 0,022). Figur 2 E-cadherin immunostain i GCA vävnad. A: positiv färgning (normal vävnad). B:. Negativ färgning (GCA vävnad) Review mRNA uttryck för E-cadherin genen
nivåer av transkript bestämdes i 32 utvalda frysta GCA prover genom RT-PCR-analys (Figur 3). De 32 GCA prover inklusive två steg I, 2 i steg II, 8 i steg III och 8 i steg IV fall där tumören var metylerade och 12 fall (2 steg I, 4 steg II, fyra av stadium III och två av stadium IV) med ometylerade E-cadherin genen. Ett 202 bp stort fragment av E-cadherin-gentranskript genererades, med en 342 bp GAPDH-fragment av transkriptet som en kontroll. 16 (1 av steg II, 7 i steg III och 8 i stadium IV) fall (80%) av inaktiverat mRNA-expression observerades i 20 tumörprover med E-cadherin genen metyleras, de övriga 4 (2 steg I, en av etapp II, en av stadium III) fall visade positivt uttryck. 12 tumörprover med E-cadherin genen ometylerade visade alla positivt uttryck för E-cadherin genen. Figur 3 mRNA-analys av E-cadherin i tumörvävnader. 1: 100 bp DNA-markör 2,4,5,6,9: positiv mRNA uttryck 3,7,8. Diskussion
Kina negativ mRNA uttryck
är ett land med hög förekomst av mag-tarmkanalen cancer som bland annat matstrupen carcinoma, magsäckscancer och magsäckshjärt adenokarcinom (GCA). GCA, som tidigare var registrerad som matstrupscancer eller magsäckscancer, har diagnostiserats oberoende i mycket de senaste åren, på grund av förbättringen i början av endoskopisk screening och patologisk diagnos. Det har föreslagits av flera epidemiologiska data att incidensen av GCA ökar på senare år. Viss forskning har visat att mekanismen och kliniska symtom på GCA skiljer sig från magcancer, men liknar matstrupscancer. Den exakta mekanismen för förekomsten av GCA är oklart för tillfället. Det är allmänt accepterat att den ärftliga faktor som irriterande förekomsten av tumör inklusive två mekanism, genetik och epigenetik mekanism. Genetiska avvikelser i proto-onkogener och tumörsuppressorgener är väl kända förändringar som ofta är inblandade i cancer patogenes. Dock är Epigenetisk inaktivering av vissa tumörsuppressorgener genom avvikande promotor metylering ofta observerats i flera cancerformer och kan spela en central roll i tumörbildning. Även genetiska avvikelser i samband med förändringar i DNA-sekvensen kan epigenetiska händelser leder till förändringar i genuttryck som sker utan förändringar i DNA-sekvensen. Om tumörsuppressorgener påverkas, resulterar det vanligtvis i transkriptionell ljuddämpning och följaktligen inaktivering av den genen. Det kan då ge tillväxtfördelar till dessa celler som gynnar utvecklingen av cancer [22].
Som medlem av celladhesion molekyl, E-cadherin spelar en viktig roll för att upprätthålla cellvidhäftning och dess dysfunktion kan resultera i tumorigenesis.6 Den biologiska konsekvenserna av dess dysfunktion inkluderar avbrott i intercellulär adhesion och nedskrivning av ß-catenin-medierad trans [23]. Hittills har dock de regulatoriska mekanismer som ansvarar för förändrade halter av E-cadherin proteiner i GCA har inte klarlagts. Det har rapporterats att hypermetylering av E-cadherin var associerade med gastrisk cancer och esofagusadenokarcinom [21, 24]. Det finns dock ingen annan rapport om förhållandet mellan Ecadherin metylering och tumörbildning av GCA. I denna studie visade vi att hypermetylering av 5'-CpG-ö av E-cadherin-promotorn uppstod ofta i GCA vävnader (68,5%) och att denna metylering förändring var associerad med minskad expression av E-cadherin-proteinet. Våra data antydde att epigenetisk ljuddämpning av E-cadherin-promotorn via hypermetylering kan vara en av den kritiska mekanism för inaktivering av denna gen i GCA. Geners uttryck associeras med hypermetylering förmedlas av metyl-bindande proteiner som binder till metylerade cytosiner och rekrytera ett komplex av proteiner som undertrycker transkription, inklusive histondeacetylaser [25].
I vår studie fann vi att i de flesta av fallen vi undersökte, E-cadherin metylering var tumörspecifika. emellertid 10 fall där metylering förändringen var närvarande i både tumör och parade normala vävnader från samma patient. Tanke på hur känslig kapslade MSP är det möjligt att normala-framträdande prover innehöll en sällsynt cancercell som var påvisas med histomorphology. På grund av begränsningen av provet, vi inte studera metylering av E-cadherin i normala Cardias vävnader. Men normal esofagealvävnad inte visar avvikande E-cadherin metylering i vissa studier [21] och i tidigare studier undersöker E-cadherin metylering i olika tumörtyper, normala vävnader från benmärg, bröst, sköldkörtel, och munslemhinna var ometylerade [ ,,,0],14, 26]. Dessa data tydde starkt på att E-kadherinpromotorn metylering är en avvikande händelse. Det faktum att vi bara upptäckt metylering i parade normala vävnader från patienter där motsvarande tumören också metylerade överensstämmer med hypotesen att cancern hos dessa individer uppstod från ett metylerat klonföregångare. I en studie av neoplastisk progression i Barretts esofagus var hypermetylering av tumörsuppressorgen p16 detekterades i patologiskt normal uppträder prover som erhållits från en patient som senare utvecklade dysplasi [27]. Därför kan epigenetisk inaktivering av tumörsuppressorgener vara ett tidigt inslag i tumörgenes.
Våra resultat visade att proteinuttryck av Ecadherin i tumörvävnader signifikant lägre än det i parade normala vävnader, emellertid immunohistokemisk färgning visade också normala membranös färgning av E -cadherin i vissa tumörprover med E-cadherin metylering. Det finns flera möjliga orsaker till händelserna. Först, Detta var förmodligen på grund av det faktum att immunhistokemisk färgning var inte lika känsliga som PCR, i att upptäcka underpopulationer av celler med genen metylering och följaktligen nedreglering av E-cadherin. För det andra, kan tumörvävnad mingla vissa normala vävnader och kan visade normala membran färgning av E-cadherin. För det tredje, gen heterogen metylering eller en allel metylering kan vara en viktig orsak. I våra studier fann vi att metylering status av tumörvävnad som båda visade positiva proteinuttryck och hypermethylation var ofullständiga Ecadherin metylering. Dessutom har det visat sig att DNA-metylering som undertryckte genuttryck främst i transkriptionsnivå och tätheten av CpG-ö metylering var relaterad till den undertryckta graden av transkription [28]. Dicky promotorn kan fullständigt undertryckas av lägre densitet metylering, emellertid, när promotorn har förbättrats genom enhanser, funktion av transkription kommer att hämtas. I vår studie fann vi också positiva mRNA-expression i vissa tumörprover med E-cadherin genen metylerade. Det beror delvis på det faktum att omfattningen av promotor metylering var insufficent att undertrycka E-cadherin transkription. I alla föreslog Vår studie att epigenetiska tysta E-cadherin promotorn via hypermethylation kan vara en av mekanismen för inaktivering av E-cadherin i GCA.
Förklaringar
Tack
Vi tackar patienter och kontrollindivider för att delta i denna studie.
finansierats med bidrag från den stora särskiljande ämnen grunden för Hebei-provinsen.

• Kliniska betydelsen av uPA-systemet i magsäckscancer med peritoneal metastas
• Epstein-Barr-virus-specifik metylering av mänskliga gener i gastric cancerceller