Обнаружение гиперметилированием промотора острова CpG Е-кадгерина в желудочном сердца adenocarcinoma

Обнаружение гиперметилированием промотора острова CpG Е-кадгерина в желудочном сердца аденокарциномы
Аннотация
Цель
Аномальные гиперметилирование CpG островков, связанных с гены-супрессоры опухолей может привести к транскрипционного молчания в неоплазии. Целью данного исследования было изучение метилирования промотора и экспрессию гена Е-кадгерина в желудочном сердечной аденокарциномы (GCA).
Методы
вложенную MSP подход, метод иммуногистохимии и ОТ-ПЦР были использованы соответственно для изучения статус метилирования острова 5 'CpG Е-кадгерина, его экспрессии белка и экспрессии мРНК в опухолях и соответствующих нормальных тканей.
Результаты
E-кадгерин был метилируется в 63 из 92 (68,5%) образцов опухоли, которые была значительно выше, чем в соответствующих нормальных тканях (P &Лт; 0,001). Метилирования частоты IV опухолевых тканей стадии III и была значительно выше, чем в стадии I и опухолевых тканях II (P = 0,01). статус метилирования плохой дифференциации группы была значительно выше, чем умеренные и бедных умеренных групп дифференциации (P &л; 0,01). Иммунным окрашиванием 51 из 92 опухолей tisssues продемонстрировали неоднородную, положительное иммунное опухолевых тканей (44,6%), существенно отличается от согласованных нормальных тканей (P < 0,001). Положительная иммунное IV опухолевых тканей стадии III и был значительно ниже, чем стадии I и опухолевых тканей II (P < 0,01). Плохая дифференциация группы была также значительно ниже средних и бедных умеренных групп дифференциации (P &л; 0,05). 80 процентов опухолевых тканей с геном Е-кадгерина метилированной показавшие инактивированную экспрессию мРНК.
Выводы
высокий статус метилирования острова 5 'CpG гена Е-кадгерина может быть одним из механизмов в развитии желудочной сердечной аденокарциномы .
Ключевые слова
E-кадгерина метилирование желудка сердца аденокарциномы Введение
Е-кадгерина является М <к югу> г 120000 трансмембранный гликопротеин экспрессируется на эпителиальных клетках и отвечает за гомофильной, Ca 2 + -зависимая межклеточной адгезии, что имеет важное значение для поддержания нормальной архитектуры ткани в эпителиальных тканях [1]. Цитоплазматический домен Е-кадгерина связывается с альфа-, β- и гамма-катенинов, которые в свою очередь, связаны с actins, и это взаимодействие имеет решающее значение для его функции [2]. Межклеточных и клеточно-матричные взаимодействия в решающей степени участвуют в малигнизации и метастазирования [3, 4]. Дефектные адгезии клеток может способствовать потере контактного ингибирования роста и потери адгезии клеток может объяснить способность раковых клеток к пересекать границы нормальной ткани и метастазированию [5]. Важность E-кадгерина в поддержании клеточной адгезии следует, что его дисфункция может играть важную роль в онкогенеза. Потеря экспрессии E-кадгерина происходит в различных опухолях человека и предполагается, что он является важным шагом в прогрессии от образования опухоли к инвазии и метастазированию [6].
В последние годы существует несколько исследований, посвященных важной роли Е-кадгерина в онкогенеза. Было показано, что зародышевой линии мутации гена Е-кадгерина связана с наследственной язвы желудка и колоректального рака [7, 8]. Кроме того, соматические мутации Е-кадгерина также были обнаружены в желудочной карциномы и аллельного потерей E-кадгерина локуса в 16q22.1 было сообщено в различных эпителиальных опухолей, таких как рак молочной железы, яичников, эндометрия и рака предстательной железы [9, 10] , для этого генетических изменений За исключением случаев, эпигенетические изменения включают гиперметилирование 5 'острова CpG в пределах промотора Е-кадгерина также несет ответственность за репрессии транскрипции гена [11]. Известно, что аномальное гиперметилирование CpG островков, ассоциированных с генами-супрессоров опухолей может приводить к молчанию в транскрипционной неоплазии [12]. Действительно, метилирование-ассоциированный глушение E-кадгерина представляет собой наиболее распространенную причину для его инактивации в нескольких видов рака, таких как печень, простаты, молочной железы и пищевода [13-15].
Желудочный сердца аденокарциномы (GCA), которая ранее была зарегистрирована как рак пищевода или рака желудка, был поставлен диагноз независимо друг от друга в самые последние годы, в связи с улучшением раннего эндоскопического скрининга и патологической диагностики. Китай является страной с высоким уровнем заболеваемости регионов ВКА, особенно в Тайханшань Северного Китая. Экзогенные факторы, включая дефицит питания, нездорового образа жизни привычки, потребления алкоголя и табака, патогенные инфекции, как правило, рассматриваются в качестве факторов риска развития GCA в Китае [16-18]. Тем не менее, только часть лиц, подвергшихся воздействию вышеперечисленных экзогенных факторов риска будет развиваться GCA, предполагая, что множественные генетические и эпигенетические события могут внести свой вклад в прогрессирование ВКА. В настоящее время все чаще признается, что эпигенетические глушение экспрессии генов промоутер CpG гиперметилированием является важным альтернативным механизмом инактивации генов-супрессоров опухолей и опухолевых ассоциированных генов в раковых заболеваний [19]. Мутации гена Е-кадгерина редко встречаются в ВКА, таким образом, в этом исследовании мы оценили роль метилирования острова 5 'CpG Е-кадгерина и его корреляции с пониженной экспрессией E-кадгерина в ВКА.
Методы
Пациенты и образцы
опухоли и парные образцы нормальной ткани были получены из 92 пациентов. Эти ткани были разделены на две параллельные части, одна часть была замораживали и хранили при -80 ° С до тех пор, пока РНК экстрагировали, а другая часть была фиксированных формалином и парафин. Случаи были все стационарных больных для хирургического лечения в четвертой больнице, Дочернее Хэбэй медицинского университета в период между 2004 и 2006 гистологической типизации опухоли проводили на основе резецированных образцов в отделении патологии той же больнице. Все желудочные сердечные раки были аденокарциномы с их эпицентров на желудочно-пищеводного соединения, т.е. от 1 см выше до 2 см ниже стыка между концом трубчатого пищевода и началом саккулярной желудка [20]. Информация о TNM постановки была доступна из больничных записей и патологического диагноза. Исследование было одобрено комитетом по этике Хэбэй института рака путем и было получено информированное согласие от всех принятых на работу субъектов.
Метилирования конкретных полимеразной цепной реакции (ПНС) для Е-кадгерина промотора метилирования ДНК
геномных из желудка сердца аденокарциномы и прилегающих к ним доброкачественная секции был выделен из залитых парафином тканевых горками стандартными методами с использованием упрощенного метода протеиназы к пищеварение. Для того, чтобы исследовать образцы метилирования ДНК, мы обрабатывали геномную ДНК с бисульфит натрия, как описано ранее [21]. Вкратце, 2 мкг ДНК денатурировали с помощью 2 М NaOH при 37 ° С в течение 10 минут с последующей инкубацией с 3 М бисульфита натрия, рН 5,0, при 50 ° С в течение 16 часов. Бисульфит обрабатывали ДНК затем очищали (Cleanup набор ДНК, Promega, Madison, Висконсин, США), инкубировали с 3 М NaOH при комнатной температуре в течение пяти минут, осаждают с помощью 10 М ацетата аммония и 100% этанола, промывают 70% -ным этанолом, и ресуспендировали в 20 мкл дистиллированной воды.
вложенную ПЦР подход был использован для определения статуса метилирования в рамках E-кадгерина CpG острова в экзоне 1 (последовательность -126 б.п. до +144 б.п. относительно начала транскрипции, GenBank инвентарный номер D49685 ), которые были опубликованы ранее [15]. В первом раунде ПЦР амплифицировали 100 нг бисульфит обработанной ДНК. Секвенирования праймеров 5'-GTTTA GTTTTGGGGAGGGGTT-3 '(смысловой) и 5'-ACTAC TACTCCAAAAACCCATAACTAA-3' (антисмысловой), и условия были езда на велосипеде один цикл 95 ° С в течение 5 мин, затем 30 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 50 ​​° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 30 с, а окончательное удлинение при 72 ° С в течение 5 мин. Размер продукта после этой начальной реакции ПЦР 270 пар оснований. Для второго раунда ПЦР, этот продукт разводили 1: 50 в воде, и были использованы 2 мкл разведения для MSP. Вложенные последовательности праймеров для Е-кадгерина для метилированного реакции были 5'-TG TAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC-3 '(смысловой) и 5'-CGAATACGATCGAATCGAACCG-3' (антисмысловой), и последовательности праймеров для неметилированной реакции были 5'-TGGTTGTAGTTATGTATTTATT TTTAGTGGTGTT-3 '(смысловой) и 5'-ACACCAAATA CAATCAAATCAAACCAAA-3' (антисмысловой). Параметры ПЦР были перечислены выше, за исключением того, что температуры отжига для получения метилированных и неметилированных реакции были 64 ° С и 62 ° С соответственно. Размеры продукта метилированных и неметилированных реакций были 112 и 120 б.п., соответственно. Клеток рака молочной железы линии МВ-MDA-231, который демонстрирует метилирования и глушителей Е-кадгерина и реагента заготовок были использованы в качестве положительного и отрицательного контролей.
Иммуногистохимического окрашивания для Е-кадгерина
выражение Е-кадгерина определялось иммунным используя комплексный метод иммунопероксидазой авидинбиотиновом, которая была выполнена на параллельных секциях гистопатологических из секции опухоли в парафин и спаренный нормальную ткань. Эндогенный пероксидазы блокировали 3% перекиси водорода в течение 10 мин с последующим извлечением СВЧ-антигена в течение девяти минут при 98 ° С в 10 мМ натрий-цитратном буфере (рН 6,0) и инкубировали в 2% нормальной лошадиной сывороткой, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание. Слайды последовательно инкубировали с первичным моноклональными, мышиное анти-Е-кадгерина антителом (разведение 1: 100 в фосфатном буферном растворе, Санта-Круса, SC-8426) в течение ночи при температуре 4 ° С, биотинилированные вторичные антитела, в течение 30 мин при 37 ° С и ABC реагент в течение 45 мин при температуре 37 ° С. 0,5% 3,3'-диаминобензидин (Sigma, Сент-Луис, Миссури), был использован в качестве хромоген. Для отрицательного контроля, первичное антитело было заменено IgG мыши. Слайды с нормальной слизистой оболочки желудка, использовали в качестве положительного контроля.
Измерение экспрессии мРНК Е-кадгерина
РНК экстрагировали из тканей замороженных секций по стандартным методикам с использованием тризола (Invitrogen, США). кДНК синтезировали с использованием Advantage RT-PCR для-набора (Clontech, Palo Alto, CA) с олиго (дТ) затравки, как это рекомендовано в протоколе при условии. Ген GAPDH, использовали в качестве контроля. Грунтовка последовательности Е-кадгерина были 5 ° ‰ -CGACCCAACC CAAGAATCTA-3 ° ‰ (смысловой) и 5 ​​° ‰ -AATGGCAG GAATTTGCAATC-3 ° ‰ (антисмысловой), праймер последовательность GAPDH были 5 ° ‰ -GGGAAACTGTGGCGT GAT-3 ° ‰ (смысл) и 5 ​​° ‰ -GTGGTCGTTGAGGG СААТ-3 ° ‰ (антисмысловой), размер продукта были 202 п.н. и 342 п.н., соответственно. Продукты ПЦР разделяли на 2% агарозном геле и интенсивности сигналов были определены количественно с помощью системы компьютерной обработки изображений. Уровни транскриптов генов были определены количественно как отношение интенсивности Е-кадгерина сигнала к интенсивности бета-актина. Инактивированная выражение был забит, когда экспрессия гена Е-кадгерина в образце опухоли была &л; 25% от его экспрессии в соответствующей нормальной выборке.
Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием пакета программ SPSS10.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). точный критерий Фишера и критерий хи-квадрат были использованы для оценки статистической значимости различий и сравнить категориальные ассоциации. Два односторонних критерия были использованы для определения значения, а значение Р менее 0,05 считались статистически значимыми для всех тестов статистики.
Результаты
субъектных характеристик
Как показано в таблице 1, 92 больных GCA были получены в это исследование, в том числе 73 мужчин и 19 женщина, возраст колебался от 38 ~ 76, средний возраст 56,9. Все случаи были разделены на 4 опухоли-узла-метастаз (TNM) стадии в соответствии со стандартом UICC, 8 стадии I (8,7%), 32 II стадии (34,8%), 38 стадии III (41,3%), 14 Степень IV (15,2%). В соответствии с патологическими фазами, случаи были разделены на 3 группы, 42 (45,7%) умеренной группы, 34 (36,9%) бедных умеренной группы и 16 (17,4%) бедных group.Table 1 Клинические и патологические характеристики пациенты GCA
Группы

п (%)

Секс
Мужской
73 (79,3)
Женский
19 (20,7 )
Средний возраст в годах (SD)
56,9 (8,86)
TNM стадии
I
8 (8.7)
II
32 (34,8)
III
38 (41,3)
IV
14 (15,2)
Патологический дифференциация опухоли
умеренной
42 (45,7)
бедных умеренной
34 (36,9) <бр> бедных
16 (17,4)
анализ метилирования гена E-кадгерина
анализ метилирования была успешно проведена во всех опухоли и парных образцах нормальной ткани (рисунок 1). Для 10% проб, анализ метилирования был повторен для контроля качества. В 63 (68,5%) из 92 GCA опухолей Е-кадгерин метилирование было обнаружено, в то время как только в 10 (10,9%) спаренных нормальных тканей была обнаружена Е-кадгерин метилирование. Частота Е-кадгерина метилирования опухолевых тканей была значительно выше, чем спаренных нормальных тканей (P &ЛТ; 0,001). Когда расслаиваются на стадии TNM, частота гена Е-кадгерина метилирования больных ОКС со стадией IV (78,8%) были значительно выше, чем у больных ОКС со стадией I и стадией II (55%) (c2 = 5,96 стадии III и, P = 0,01 ). При расслаивается патологических стадий, E-кадгерина метилирования гена частоты умеренной, плохой умеренной и бедной группе были 52,4%, 73,5% и 100%, частота E-кадгерина метилирования гена бедной группы значительно выше, чем в умеренной и бедными -moderate группы (χ2 = 8,92, p = 0,003) (таблица 2). Рисунок 1 метилирования Анализ Е-кадгерина в ткани опухоли (Т) и соответствующей нормальной ткани (N). U: указывает на наличие неметилированных генов; м: указывает на наличие метилированных генов. Случаи 1 и 2: опухоль-специфический метилирование; Случай 3: опухоль полностью метилированный, в то время как соответствующая нормальная ткань имеет очень слабую полосу, демонстрирующее метилирование; Случай 4: обе опухоли и соответствующей нормальной ткани неметилированным
Таблица 2 E-кадгерина метилирование и иммуногистохимического окрашивания характеристики больных ОКС
<. Col> Группа

статус метилирования

P

Иммуногистохимическое окрашивание

P

M
U
- <бр> +
TNM стадии
I 4
4 страница 2 6
II
18
14
13
9
III
29
9
26
12
IV
12 страница 2 0.015a
10 4
0.002a
Патологический дифференциация опухоли
умеренная
22
20
20 страница 2 из бедной среднетяжелой
25
9
18
16
бедных
16
0
0.003b
13 страница 3 0.022b
Р значения стадии III и IV больных против стадии I и больных II, B значение P бедных дифференциации группы против умеренного и низкого умеренные группы
иммунное Е-кадгерина гена
Как показано в таблице 2, окрашивание было неоднородным в 51 опухолевых тканей, опухолевые клетки с пониженным мембранозной Е-кадгерин окрашивание смешивались с опухолевыми клетками обнаруживающий сильное мембранозной окрашивание (рисунок 2). Частота экспрессии белка в опухолевых тканях 44,6%, в то время как парные образцы нормальной ткани все продемонстрировали диффундировать сильную мембранозной Е-кадгерин окрашивание. Частота экспрессии белка значительно отличалась между опухолью и парными нормальными тканями (P < 0,001). Когда расслаиваются на стадии TNM, частота E-кадгерина экспрессии гена белка IV опухолевых тканей (30,8%) стадии III и был значительно ниже, чем на стадии I и тканях II опухоли (62,5%) (χ2 = 9,21, P = 0,002) , Частота экспрессии гена белка Е-кадгерина бедной группы значительно ниже, чем в средних и бедных групп умеренной (c2 = 5,23, P = 0,022). Рисунок 2 Е-кадгерин immunostain в GCA ткани. A: положительное окрашивание (нормальная ткань). B:. Отрицательное окрашивание (GCA ткани) выражение
мРНК для Е-кадгерин гена
Уровни транскриптов были определены в 32 отобранных образцах замороженных GCA с помощью анализа RT-PCR (рисунок 3). 32 образцов GCA в том числе 2 ступени I, 2 II стадии, 8 стадии III и 8 этапа IV случаев, в которых опухоль была метилированный и 12 случаев (2 стадии I, 4 этапов II, 4 этапа III и 2 стадии IV) с неметилированной гена Е-кадгерина. Фрагмент длиной 202 пар оснований из транскрипта гена Е-кадгерина был сгенерирован, с GAPDH фрагментом длиной 342 п.н. транскрипта в качестве контроля. 16 (1 из II ступени, 7 ступени III и 8 ступени IV) случаях (80%), инактивированной экспрессии мРНК наблюдались в 20 образцах опухолей с геном Е-кадгерина метилированный, а другой 4 (2 стадии I, 1 из этап II, 1 этап III) случаях показали положительное выражение. 12 образцов опухоли с геном Е-кадгерина неметилированной все показали положительную экспрессию гена Е-кадгерина. Рисунок 3 Анализ мРНК Е-кадгерина в опухолевых тканях. 1: 100 пар оснований ДНК-маркер 2,4,5,6,9: положительная экспрессия мРНК 3,7,8:.
Отрицательная экспрессия мРНК Обсуждение
Китай является страной с высоким уровнем заболеваемости раком желудочно-кишечного тракта, которые в том числе пищевода рак, рак желудка и желудка сердца аденокарциномы (GCA). GCA, который ранее был зарегистрирован как рак пищевода или рака желудка, был поставлен диагноз независимо друг от друга в самые последние годы, в связи с улучшением раннего эндоскопического скрининга и патологической диагностики. Было предложено несколько эпидемиологических данных о том, что заболеваемость GCA растет в последние годы. Некоторые исследования показали, что механизм и клинический симптом ВКА отличается от рака желудка, но похоже на рак пищевода. Точный механизм возникновения GCA остается неясным, на данный момент. Принято считать, что наследственный фактор, который раздражает возникновение опухоли в том числе два механизма, генетики и механизм эпигенетических. Генетические аномалии прото-онкогенов и генов-супрессоров опухолей являются известные изменения, которые часто участвуют в патогенезе рака. Тем не менее, Эпигенетическое инактивация некоторых генов-супрессоров опухолей аберрантной метилирования промотора часто наблюдается в некоторых видов рака и может играть ключевую роль в онкогенеза. В то время как генетические аномалии связаны с изменениями в последовательности ДНК, эпигенетические события могут привести к изменениям в экспрессии генов, которые происходят без изменений в последовательности ДНК. Если гены-супрессоры опухолей, которые влияют, как правило, приводит к транскрипционной глушителей и, следовательно, инактивации этого гена. Затем она может придавать преимущества роста этих клеток, которые способствуют развитию рака [22].
В качестве члена клеточной адгезии молекулярного, E-кадгерина, играют важную роль в поддержании клеточной адгезии и ее дисфункция может привести к tumorigenesis.6 Биологическую последствия его дисфункции включают нарушение межклеточной адгезии и ухудшение бета-катенин-опосредованной трансактивации [23]. На сегодняшний день, однако, регуляторные механизмы, ответственные за измененными уровнями E-кадгерина белков в GCA не были выяснены. Сообщалось, что гиперметилирование Е-кадгерина были связаны с раком желудка и аденокарциномы пищевода [21, 24]. Тем не менее, нет никакого другого отчета об отношениях между Ecadherin метилирования и онкогенеза из ВКА. В этом исследовании мы показали, что гиперметилирование острова 5 'CpG промотора E-кадгерина часто происходило в тканях GCA (68,5%), и что это изменение метилирование было связано со снижением экспрессии E-кадгерина белка. Наши данные свидетельствуют о том, что эпигенетическое глушение промотора Е-кадгерина через гиперметилировании может быть одним из важнейших механизма инактивации этого гена в GCA. Молчанием генов, связанный с гиперметилированием опосредуется метильных-связывающих белков, которые связываются с метилированных цитозина и вербуют комплекс белков, подавляющих транскрипцию, в том числе гистондезацетилаз [25].
В нашем исследовании мы обнаружили, что в большинстве случаев мы исследовали, E-кадгерина метилирование опухоль специфичны. Тем не менее, 10 случаев, в которых изменение метилирование присутствовала в обоих опухоли и в паре нормальных тканей от того же самого пациента. Учитывая чувствительность вложенного МПВ, то возможно, что нормальный вид образцы содержали редкие клетки рака, который не был обнаружен с помощью histomorphology. Из-за ограниченности образца, мы не изучали метилирование Е-кадгерина в нормальных тканях кардии. Тем не менее, нормальная ткань пищевода не показали отклоняющееся E-кадгерина метилирования в некоторых исследованиях [21] и в предыдущих исследованиях, посвященных E-кадгерина метилирование в различных типах опухолей, нормальные ткани из костного мозга, молочной железы, щитовидной железы и слизистой оболочки полости рта были неметилированным [ ,,,0],14, 26]. Эти данные убедительно показывают, что Е-кадгерин промотор метилирование является аберрантное событием. Тот факт, что мы только обнаружено метилирование в парных нормальных тканей у пациентов, у которых соответствующая опухоль была также метилированных согласуется с гипотезой о том, что рак у этих людей возникло из денатурированного клонального предшественника. В исследовании опухолевой прогрессии в пищевод Барретта, Гиперметилирование гена р16-супрессора опухоли была обнаружена в патологически нормальный вид образцов, полученных от пациента, который позже развитой дисплазии [27]. Таким образом, эпигенетические инактивации генов-супрессоров опухолей может быть ранним признаком онкогенеза.
Наши результаты показали, что экспрессия белка Ecadherin в опухолевых тканях значительно ниже, чем в парных нормальных тканях, однако, иммуногистохимического окрашивания также показали нормальное мембранозной окрашивание E -cadherin в некоторых образцах опухолей с E-кадгерина метилирования. Есть несколько возможных причин событий. Во-первых, это, вероятно, из-за того, что иммуногистохимического окрашивания была не так чувствительны, как ПЦР в обнаружении субпопуляции клеток с метилирования гена и, следовательно, понижающей Е-кадгерина. Во-вторых, опухолевые ткани могут смешаться некоторые нормальные ткани и могут показали нормальное мембранную окрашивание Е-кадгерина. В-третьих, ген гетерогенная метилирование или аллель метилирования может быть важной причиной. В наших исследованиях мы обнаружили, что статус метилирования опухолевых тканей, как показали положительную экспрессию белка и гиперметилирование были неполными Ecadherin метилирование. Кроме того, было показано, что метилирование ДНК, которая подавленную экспрессию гена в основном в транскрипционном уровне и плотность CpG острова метилирование было связано с подавленной степенью транскрипции [28]. Дикки промотор может быть полностью подавлена ​​более низкой плотности метилирования, тем не менее, когда промотор был усилен enhanser, функцией транскрипции будет извлечено. В нашем исследовании мы также обнаружили положительную экспрессию мРНК в некоторых образцах опухолей с геном Е-кадгерина метилированных. Это отчасти из-за того, что степень метилирования промотора был подавить Недостаточно высокий уровень Е-кадгерин транскрипцию. В целом, наше исследование показало, что эпигенетические глушение промотора E-кадгерина через гиперметилированием может быть одним из механизмов для инактивации Е-кадгерина в ВКА.
Declarations
Благодарности
Мы благодарим пациентов и контрольных лиц для участия в данном исследовании.
при поддержке грантов значительным отличительными предметов основания провинции Хэбэй.

• Клиническая значимость системы УАП при раке желудка с метастазами в брюшную
• Вирус Эпштейна-Барр специфических метилирование генов человека в клетках рака желудка