Påvisning av arrangøren hypermethylation av CpG øya E-cadherin i mage hjerte adenocarcinoma

Påvisning av arrangøren hypermethylation av CpG øya E-cadherin i mage hjerte adenokarsinom
Abstract
Mål
Unormal hypermethylation av CpG øyer forbundet med tumorsuppressorgener kan føre til transcriptional stanse i neoplasi. Hensikten med denne studien var å undersøke arrangøren metylering og uttrykk for E-cadherin genet i mage hjerte adenokarsinom (GCA).
Metoder, En nestet MSP tilnærming, immunhistokjemi metode og RT-PCR ble brukt henholdsvis for å undersøke metylering status for 5 'CpG island of E-cadherin, proteinuttrykk og mRNA uttrykk i tumorer og tilsvarende normale vev.
Resultater
E-cadherin ble metylert i 63 av 92 (68,5%) vevsprøver, som var signifikant høyere enn i tilsvarende normale vev (P < 0,001). Metylering frekvenser av type III og IV tumorvev var signifikant høyere enn det i trinn I og II tumorvev (P = 0,01). Metylering statusen til dårlig differensiering gruppen var signifikant høyere enn moderate og dårlig moderat differensierings grupper (P < 0,01). Ved farging 51 av 92 kreft tisssues demonstrert heterogen, positiv farging av tumorvev (44,6%), vesentlig forskjellig fra matchet normalt vev (P < 0,001). Positiv farging av trinn III og IV tumorvev var signifikant lavere enn trinn I og II tumorvev (P < 0,01). Dårlig differensiering gruppen var også signifikant lavere enn moderate og dårlig moderat differensierings grupper (P < 0,05). 80 prosent av tumorvev med E-cadherin viste genet metylert inaktivert mRNA-ekspresjon.
Konklusjoner
høy status metylering av 5 'CpG øy av E-cadherin gen kan være en av mekanismene i utviklingen av gastrisk adenokarsinom hjerte .
nøkkelord
E-cadherin metylering mage hjerte adenokarsinom Innledning
E-cadherin er en M r 120.000 trans glykoprotein uttrykt på epitelceller og er ansvarlig for homofilist, Ca 2 + -avhengig intercellulær adhesjon som er nødvendig for å opprettholde normal vev arkitektur i epitelvev [1]. Det cytoplasmatiske domene av E-cadherin binder seg til a-, β-, og y-catenins, som i sin tur er knyttet til actins, og denne interaksjonen er kritisk for dets funksjon [2]. Celle-celle og celle-matrise interaksjoner er avgjørende involvert i neoplastisk transformasjon og metastasering [3, 4]. Defekt celleadhesjon kan bidra til tap av kontakt inhibisjon av vekst og tap av celleadhesjon kan forklare evnen av kreftceller til å krysse normale vev grenser og metastase [5]. Betydningen av E-cadherin i å opprettholde celleadhesjon innebærer at dens dysfunksjon kan spille en viktig rolle i tumorgenese. Tap av E-cadherin uttrykk forekommer i en rekke humane svulster og er antatt å være et viktig skritt i utviklingen fra tumordannelse til invasjon og metastase [6].
I de senere årene, er det flere studier på den viktige rollen av E-cadherin i tumorigenesis. Det er blitt vist at bakterie-linje mutasjoner av E-cadherin gen er knyttet til familiær mage og tykktarmskreft [7, 8]. Videre somatiske mutasjoner av E-cadherin ble også funnet i magekreft og allel tap av E-cadherin locus på 16q22.1 har blitt rapportert i ulike epiteltumorer som brystkreft, eggstokkreft, livmor, og prostata karsinom [9, 10] . Med unntak av denne genetiske forandringer, epigenetisk endring inkluderer hypermethylation av 5 'CpG island innenfor formidler av E-cadherin er også ansvarlig for transkripsjonen undertrykkelse av genet [11]. Det er kjent at unormale hypermethylation av CpG øyer forbundet med tumorsuppressorgener kan føre til transkripsjonen stanse i neoplasia [12]. Faktisk, metylering-assosiert stanse av E-cadherin representerer den mest vanlige årsaken til dens inaktivering i en rekke kreftformer som lever, prostata, bryst og esophageal [13-15].
Gastric hjerte adenokarsinom (GCA), som tidligere var registrert som spiserørskreft eller magekreft, har blitt diagnostisert uavhengig av hverandre i de aller siste årene, på grunn av forbedring i tidlig endoskopisk screening og patologisk diagnose. Kina er et land med høy forekomst regioner av GCA, Spesielt i Taihangfjellene av Nord-Kina. Eksogene faktorer, inkludert ernæring mangel, usunne levevaner, forbruk av alkohol og tobakk, er patogene infeksjoner generelt ansett som risikofaktorer for utvikling av GCA i Kina [16-18]. Imidlertid kan bare en undergruppe av personer som er utsatt for de ovennevnte eksogene risikofaktorer vil utvikle GCA, noe som tyder på at flere genetiske og epigenetiske hendelser bidrar til utviklingen av GCA. Det er nå stadig mer anerkjent at epigenetisk stanse av genuttrykk av arrangøren CpG hypermethylation er et viktig alternativ mekanisme i inaktivere tumorsuppressorgener og tumorassosierte gener i kreft [19]. Mutasjoner av E-cadherin-genet er sjeldne i GCA således i denne studien evaluerte vi rollen til metylering av 5 'CpG øy av E-cadherin og dens sammenheng med redusert E-cadherin ekspresjon i GCA.
Methods
pasienter og prøver
Tumor og sammenkoblede prøvene normale vev ble hentet fra 92 pasienter. Disse vev ble delt i to parallelle deler, en del ble frosset og lagret ved -80 ° C inntil RNA ble ekstrahert, den andre delen ble formalinfiksert og parafin-innleiret. Sakene var alle inneliggende pasienter for kirurgisk behandling i fjerde Affiliated Hospital, Hebei Medical University mellom 2004 og 2006. Histologisk svulst typing ble gjennomført på bakgrunn av resected eksemplarer i Avdeling for patologi av det samme sykehuset. Alle gastriske hjerte carcinoma var adenokarsinomer med sine epicenters på gastroøsofageal krysset, dvs. fra 1 cm over til 2 cm under overgangen mellom enden av den rørformede spiserøret og i begynnelsen av saccular magen [20]. Informasjon om TNM staging var tilgjengelig fra sykehus innspillinger og patologisk diagnose. Studien ble godkjent av etikkomiteen i Hebei Cancer Institute og informert samtykke ble innhentet fra alle rekruttert fag
. Metylering spesifikk polymerase chain reaction (MSP) for E-cadherin promoter metylering
Genomisk DNA fra mage hjerte adenokarsinomer og tilstøtende ikke-ondartede delene ble isolert fra parafininnstøpte vev objektglass ved hjelp av standardmetoder under anvendelse av en forenklet proteinase K-fordøyelse metode. For å undersøke DNA-metylering mønstrene, behandlet vi genomisk DNA med natriumbisulfitt, som tidligere beskrevet [21]. I korte trekk ble 2 mikrogram av DNA denaturert med 2 M NaOH ved 37 ° C i 10 minutter, etterfulgt av inkubasjon med 3 M natriumbisulfitt, pH 5,0, ved 50 ° C i 16 timer. Bisulfitt-behandlede DNA ble deretter renset (DNA opprydding Kit, Promega, Madison, Wisconsin, USA), inkubert med 3 M NaOH ved romtemperatur i fem minutter, utfelt med 10 M ammoniumacetat og 100% etanol, vasket med 70% etanol, og resuspendert i 20 ul destillert vann., En nested PCR-metode ble anvendt for å bestemme metylering status innenfor E-cadherin CpG øy i Exon 1 (sekvens -126 bp til 144 bp i forhold til transkripsjons-start, GenBank tilgangsnummer D49685 ) som har blitt publisert tidligere [15]. I den første runden av PCR, ble 100 ng av bisulfitt-behandlede DNA amplifisert. De sekvenseringsprimere var 5'-GTTTA GTTTTGGGGAGGGGTT-3 '(sense) og 5'-ACTAC TACTCCAAAAACCCATAACTAA-3' (antisens), og sykkel betingelsene var en syklus på 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser av 95 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Størrelsen av produkt etter denne første PCR-reaksjon ble 270 bp. For den andre runde av PCR, ble produktet fortynnet 1: 50 i vann, og 2 ul av fortynningen ble brukt til MSP. Nestet primer sekvenser for E-cadherin for det metylerte reaksjonen var 5'-TG TAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC-3 '(sense) og 5'-CGAATACGATCGAATCGAACCG-3' (antisens), og primersekvenser for unmethylated reaksjonen var 5'-TGGTTGTAGTTATGTATTTATT TTTAGTGGTGTT-3- '(sense) og 5'-ACACCAAATA CAATCAAATCAAACCAAA-3' (antisens). PCR-parametrene var som oppført ovenfor, med unntak av at annealing temperaturer for de metylerte og unmethylated reaksjoner var 64 ° C og 62 ° C, respektivt. Produktet størrelser av metylerte og unmethylated reaksjoner var 112 og 120 bp, respektivt. Brystkreftcellelinjen MDA-MB-231, noe som viser metylering og lyddemping av E-cadherin og reagens-emnene ble anvendt som positive og negative kontroller.
Immunohistokjemisk farging for E-cadherin
E-cadherin ekspresjon ble bestemt ved hjelp farging hjelp av avidin-biotin kompleks immunoperoxidase metoden, som ble utført på parallelle histopatologiske seksjoner fra parafin-embedded tumor seksjon og paret normalt vev. Endogen peroksidase ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter, etterfulgt av mikrobølge antigen gjenfinning i ni minutter ved 98 ° C i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) og inkuberes i 2% normalt hesteserum for å minimere ikke-spesifikk binding. Glassene ble sekvensielt inkubert med primært monoklonalt, muse anti-E-cadherin antistoff (1: 100 fortynning i fosfatbufret saltvann, Santa Cruz, sc-8426) over natt ved 4 ° C, biotinylert sekundært antistoff i 30 minutter ved 37 ° C og ABC-reagens i 45 minutter ved 37 ° C. 0,5% 3,3'-Diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MO) ble anvendt som chromagen. For en negativ kontroll ble det primære antistoff erstattet med muse-IgG. Lysbilder med normal mageslimhinnen ble anvendt som en positiv kontroll.
Måling av mRNA-ekspresjon av E-cadherin
RNA ble ekstrahert fra frosne delen vev ved standardmetoder under anvendelse av Trizol (Invitrogen, USA). cDNA ble syntetisert ved bruk av Advantage RT-for-PCR-sett (Clontech, Palo Alto, CA) med oligo (dT) priming som anbefalt i protokollen gitt. GAPDH-genet ble anvendt som en kontroll. Primer sekvenser av E-cadherin var 5 ° ‰ -CGACCCAACC CAAGAATCTA-3 ° ‰ (fornuft) og 5 ° ‰ -AATGGCAG GAATTTGCAATC-3 ° ‰ (anti), primer sekvens av GAPDH var 5 ° ‰ -GGGAAACTGTGGCGT GAT-3 ° ‰ (forstand) og 5 ° ‰ -GTGGTCGTTGAGGG CAAT-3 ° ‰ (anti), produktstørrelse var 202 bp og 342 bp, henholdsvis. PCR-produkter ble løst på 2% agarosegeler og signalintensitetene ble kvantifisert ved anvendelse av en datamaskin avbildningssystem. Nivåene av gentranskriptene ble kvantifisert som forholdet mellom intensiteten av E-cadherin signal til intensiteten av β-aktin. Inaktivert uttrykk ble scoret da uttrykk for en E-cadherin genet i svulsten prøven var < 25% av dets ekspresjon i den tilsvarende normale prøven.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved anvendelse SPSS10.0 programvarepakke (SPSS Company, Chicago, Illinois, USA). Fishers eksakte test og Chi-kvadrat test ble brukt for å vurdere statistisk signifikans av forskjeller og sammenligne kategoriske foreninger. To-sidige tester ble brukt til å bestemme betydning, og p-verdiene mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant for alle statistiske tester.
Resultater
emne egenskaper
Som vist i tabell 1, ble 92 GCA pasienter oppnådd i denne forskningen, inkludert 73 mannlige og 19 kvinnelige, alder varierte fra 38 ~ 76, gjennomsnittsalder 56,9. Alle sakene ble klassifisert i fire tumor-node-metastaser (TNM) stadier ifølge UICC standard, åtte av stadium I (8,7%), 32 av stadium II (34,8%), 38 av stadium III (41,3%), 14 av trinn IV (15,2%). I henhold til de patologiske fasene ble de tilfeller klassifisert i 3 grupper, 42 (45,7%) av moderat gruppe, 34 (36,9%) av dårlig moderat-gruppe og 16 (17,4%) av dårlig group.Table 1 Kliniske og patologiske kjennetegn GCA pasienter
grupper
n (%)
Sex
Mann fra 73 (79,3)
Kvinne 19 (20,7 )
Mean alder i år (SD)
56,9 (8,86)
TNM stadium
jeg
8 (8.7)
II
32 (34,8)
III
38 (41,3)
IV
14 (15,2)
Patologisk differensiering av tumor
moderat
42 (45,7)
dårlig moderat
34 (36,9)
dårlig
16 (17,4)
metylering analyse av E-cadherin genet
metylering analyse ble vellykket utført i alt svulst og paret normale vevsprøver (figur 1). For 10% av prøvene ble metylering analyse gjentas for kvalitetskontroll. I 63 (68,5%) av 92 GCA svulster E-cadherin metylering ble oppdaget, mens bare i 10 (10,9%) av sammenkoblede normalt vev E-cadherin metylering ble oppdaget. Hyppigheten av E-cadherin metylering av tumorvev var betydelig høyere enn sammenkoblede normale vev (P < 0,001). Når stratifisert for TNM etapper, Frekvens av E-cadherin genet metylering av GCA pasienter med stadium III og stadium IV (78,8%) var betydelig høyere enn GCA pasienter med stadium I og stadium II (55%) (χ2 = 5,96, P = 0,01 ). Når stratifisert for patologiske faser, de E-cadherin-genet metylering frekvenser av moderat, dårlig til moderat og dårlig gruppe var 52,4%, 73,5% og 100%, frekvens av E-cadherin-genet metylering av dårlig gruppe signifikant høyere enn i moderat og dårlig -Moderat grupper (χ2 = 8,92, P = 0,003) (tabell 2). Figur 1 Metylering analyse av E-cadherin i tumorvevet (T) og tilsvarende normale vev (N). u: indikerer tilstedeværelse av unmethylated gener; m: indikerer tilstedeværelse av denaturert gener. Saker 1 og 2: tumor-spesifikke metylering; Tilfelle 3: svulsten er fullstendig denaturert, mens den tilsvarende normale vev har et meget svakt bånd demonstrere metylering; Sak 4: begge svulst og tilsvarende normalt vev unmethylated
Tabell 2 E-cadherin metylering og immunhistokjemiske fargings kjennetegn GCA pasienter
<. col> Gruppe
metylering status
P
Immunhistokjemisk farging
P
M
U
-
+
TNM stadium
jeg
4
4
2
6
II
18
14
13
9
III
29
9
26
12
IV
12
2
0.015a
10
4
0.002a
patologisk differensiering av tumor
moderat
22
20
20
2
dårlig moderat
25
9
18
16
dårlig
16
0
0.003b
13
3
0.022b
en P-verdi av stadium III og IV pasienter mot stadium i og II pasienter, b P-verdi for dårlig differensiering gruppe mot moderate og dårlig moderat grupper
farging av E-cadherin-genet
Som vist i tabell 2, fargingen var heterogene i 51 tumorvev, tumorceller med redusert membranøs E-cadherin farging ble blandet med tumorceller viser sterk membran farging (figur 2). Frekvens av protein uttrykk var 44,6% i tumorvev, mens paret normale vevsprøver alt demonstrert diffuse sterk membran E-cadherin farging. Frekvens av protein uttrykk var signifikant forskjellig mellom svulst og sammenkoblede normalt vev (P < 0,001). Når stratifisert for TNM stadier, Frekvens av E-cadherin gen protein ekspresjon av trinn III og tumorvev IV (30,8%) var betydelig lavere enn det i trinn I og II tumorvev (62,5%) (χ2 = 9,21, p = 0,002) . Frekvens av E-cadherin gen protein uttrykk for dårlig gruppe betydelig lavere enn i moderate og fattige moderat grupper (χ2 = 5,23, P = 0,022). Figur 2 E-cadherin immunfarging i GCA vev. A: positiv farging (normalt vev). B:. Negativ farging (GCA vev)
mRNA uttrykk for E-cadherin genet
Nivåene av transkripsjonene ble bestemt i de 32 utvalgte frosne GCA prøver av RT-PCR-analyse (figur 3). De 32 GCA prøver inkluderende to av trinn I, 2 av fase II, 8 av trinn III og 8 av trinn IV i tilfeller hvor tumoren ble metylert og 12 saker (2 i trinn I, 4 trinn II, 4 av trinn III og 2 fra trinn IV) med unmethylated E-cadherin-genet. Et 202 bp fragment av E-cadherin gentranskriptet ble generert, med et 342 bp-fragment GAPDH av transkriptet som en kontroll. 16 (en av trinn II, 7 av trinn III og 8 fra trinn IV) tilfeller (80%) av inaktiverte mRNA-ekspresjon ble observert i 20 tumorprøver med E-cadherin-genet metylert, den andre fire (to av trinn I, en av stadium II, en av stadium III) tilfeller viste positivt uttrykk. 12 tumorprøver med E-cadherin genet unmethylated alle viste positivt uttrykk for E-cadherin genet. Figur 3 mRNA-analyse av E-cadherin i tumorvev. 1: 100 bp DNA markør 2,4,5,6,9: positiv mRNA uttrykk 3,7,8. Negativ mRNA uttrykk
Diskusjon
Kina er et land med høy forekomst av fordøyelseskanalen kreft som blant annet esophageal karsinom, magekreft og mage hjerte adenokarsinom (GCA). GCA, som tidligere var registrert som spiserørskreft eller magekreft, har blitt diagnostisert uavhengig av hverandre i de aller siste årene, på grunn av forbedring i tidlig endoskopisk screening og patologisk diagnose. Det har blitt foreslått av flere epidemiologiske data at forekomsten av GCA er økende i de senere år. Noen undersøkelser har vist at mekanismen og klinisk symptom på GCA er forskjellig fra magekreft, men i likhet med spiserørskreft. Den nøyaktige mekanisme for forekomsten av GCA fortsatt uklart for øyeblikket. Det er generelt akseptert at den arvelige faktor som irriterende på forekomsten av tumor inkludert to mekanisme, genetikk og epigenetikk mekanisme. Genetiske avvik av proto-onkogener og tumorsuppressorgener er kjente endringer som ofte er involvert i kreft patogenesen. Imidlertid er epigenetisk inaktivering av visse tumorsuppressorgener ved avvikende promotor metylering hyppig observert i en rekke kreftformer, og kan spille en sentral rolle i tumorgenese. Selv om genetiske avvik er assosiert med endringer i DNA-sekvensen, kan epigenetiske hendelser fører til endringer i genekspresjon som forekommer uten endringer i DNA-sekvensen. Hvis tumorsuppressorgener er berørt, resulterer det ofte i transkripsjonen demping og dermed inaktivering av dette gen. Det kan da gi vekst fordelene til disse cellene som favoriserer utviklingen av kreft [22].
Som et medlem av celleadhesjon molekylære, E-cadherin spiller en viktig rolle i å opprettholde celleadhesjon og dens dysfunksjon kan resultere i tumorigenesis.6 Den biologiske konsekvenser av denne dysfunksjon omfatter forstyrrelse av inter adhesjon og nedskrivning av ß-catenin-mediert trans [23]. Hittil har imidlertid de regulatoriske mekanismer som er ansvarlig for endrede nivåer av E-cadherin proteiner i GCA har ikke blitt klarlagt. Det har blitt rapportert at hypermethylation av E-cadherin var assosiert med magekreft og spiserørs adenokarsinom [21, 24]. Men det er ingen annen rapport om forholdet mellom Ecadherin metylering og tumorigenesis av GCA. I denne studien viste vi at hypermethylation av 5'-CpG øy av E-cadherin-promoteren oppsto ofte i GCA vev (68,5%) og at denne metylering endringen var assosiert med redusert ekspresjon av E-cadherin protein. Våre data foreslo at epigenetisk stanse av E-cadherin arrangøren via hypermethylation kan være en av de avgjørende mekanisme for inaktivering av dette genet i GCA. Gene stanse assosiert med hypermethylation medieres av metyl-bindende proteiner som binder seg til denaturert cytosines og rekruttere et kompleks av proteiner som undertrykke transkripsjon, inkludert histone deacetylases [25].
I vår studie fant vi at i de fleste tilfellene vi undersøkte, E-cadherin metylering var tumor spesifikke. imidlertid 10 tilfeller hvor metylering endringen var til stede i både tumor og sammenkoblet normale vev fra den samme pasient. Gitt følsomheten av nestede MSP, er det mulig at normal-vises prøvene inneholdt en sjelden kreftcelle som var oppdages av histomorphology. På grunn av begrensninger i prøven, kan vi ikke studere metylering av E-cadherin i normale Cardia vev. Men gjorde normal esophageal vev ikke vise avvikende E-cadherin metylering i noen studier [21] og i tidligere studier undersøker E-cadherin metylering i ulike tumortyper, normalt vev fra benmarg, bryst, skjoldbruskkjertelen, og munnslimhinnen var unmethylated [ ,,,0],14, 26]. Disse dataene sterkt antydet at E-cadherin promoter metylering er en avvikende hendelse. Det faktum at vi bare oppdaget metylering i sammenkoblede normalt vev fra pasienter der det tilsvarende svulst ble også metylert er konsistent med hypotesen om at kreft i disse individene oppsto fra et denaturert klonal forløper. I en studie av neoplastisk progresjon i Barretts øsofagus, ble hypermethylation av svulst suppressor genet p16 påvist i patologisk normale-vises prøver hentet fra en pasient som senere utviklet dysplasi [27]. Derfor kan epigenetisk inaktivering av tumorsuppressorgener være et tidlig funksjon i tumorgenese.
Våre resultater viste at protein ekspresjon av Ecadherin i tumorvev betydelig lavere enn i normale vev sammenkoblet, men immunhistokjemisk farging viste også normal membranøs farging av E -cadherin i enkelte tumorprøver med E-cadherin metylering. Det er flere mulige årsaker til hendelsene. Først Dette var sannsynligvis på grunn av det faktum at immunhistokjemisk farging var ikke like følsom som PCR for å påvise subpopulasjoner av celler med genet metylering og derved nedregulering av E-cadherin. For det andre kan tumorvev blande noen normalt vev og kan viste normal membran farging av E-cadherin. Tredje, genet heterogen metylering eller et allel metylering kan være en viktig årsak. I våre studier, fant vi at metylering status for tumorvev som begge viste positiv protein uttrykk og hypermethylation var ufullstendige Ecadherin metylering. Videre har det blitt vist at DNA-metylering som undertrykket genekspresjon hovedsakelig i transkripsjonsnivået og tettheten av CpG øy metylering var relatert til den undertrykte graden av transkripsjon [28]. Dicky promoter kan bli fullstendig undertrykt av lavere tetthet metylering, men når promoteren ble forbedret av enhanser, funksjon av transkripsjon blir hentet. I vår studie fant vi også positivt mRNA uttrykk i enkelte tumorprøver med E-cadherin genet metylert. Det delvis på grunn av det faktum at graden av promoteren metylering var For lite til å undertrykke E-cadherin transkripsjon. I alt Vår studie antydet at epigenetisk stanse av E-cadherin arrangøren via hypermethylation kan være en av mekanismen for inaktivering av E-cadherin i GCA.
Erklæringer
Takk
Vi takker pasienter og kontrollpersoner for å delta i denne studien.
støttet med tilskudd fra den betydelige særegne fagene fundament i Hebei-provinsen.

• Klinisk betydning av UPA system i magekreft med peritoneal metastase
• Epstein-Barr-virus-spesifikke metylering av humane gener i magekreftcellene