Detecção de hipermetilação do promotor da ilha CpG de E-caderina em Detecção adenocarcinoma

cardíaca gástrica de hipermetilação do promotor da ilha CpG de E-caderina em adenocarcinoma gástrico cardíaca da arte abstracta
AIM
hipermetilação anormal de ilhas CpG associados com genes supressores de tumores pode levar ao silenciamento transcricional na neoplasia. O objetivo deste estudo foi investigar a metilação do promotor e expressão do gene da E-caderina em adenocarcinoma gástrico cardíaca (GCA).
Métodos
Uma abordagem MSP aninhada, método de imunohistoquímica e RT-PCR foram utilizados, respectivamente, para examinar a estado de metilação da ilha 5 'CpG de e-caderina, a sua expressão de proteínas e a expressão de ARNm em tumores e tecidos normais correspondentes.

resultados da e-caderina foi metilado em 63 de 92 (68,5%) amostras de tumores, os quais foi significativamente mais elevada do que nos tecidos normais (P < 0,001) correspondente. frequências de metilação de fase III e tecidos tumorais IV foi significativamente maior do que na fase I e tecidos tumorais II (p = 0,01). estado de metilação do grupo diferenciação pobre foi significativamente maior do que os grupos de diferenciação moderado e fraco moderado (p < 0,01). Por imunocoloração 51 de 92 tisssues tumorais demonstrada heterogénea imunocoloração positiva e precisa dos tecidos de tumor (44,6%), significativamente diferentes a partir de tecidos normais correspondentes (P < 0,001). imunocoloração positiva da fase III e IV tecidos de tumor foi significativamente mais baixo do que a fase I e II tecidos de tumor (P < 0,01). grupo diferenciação pobre também foi significativamente menor do que os grupos de diferenciação moderado e pobre moderado (p < 0,05). 80 por cento dos tecidos de tumor com gene da E-caderina metilado mostraram expressão de ARNm inactivado.
Conclusões
estado alta metilação da ilha 5 'CpG do gene da E-caderina pode ser um dos mecanismos para o desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico cardíaca .
Palavras-chave
e-caderina metilação gástrica Introdução adenocarcinoma cardíaca
e-caderina é um M r 120.000 glicoproteína transmembranar expressa em células epiteliais e é responsável por homofílico, Ca 2 + dependente de adesão intercelular que é essencial para a manutenção da arquitectura de tecido normal em tecidos epiteliais [1]. O domínio citoplasmático da E-caderina liga-se a a-, β-, e y-cateninas, que são por sua vez ligados a ácinos, e esta interacção é crítico para a sua função de [2]. interacções célula-célula e célula-matriz são crucialmente envolvidas na transformação neoplásica e metástase [3, 4]. a adesão de células defeituosas podem contribuir para a perda de inibição por contacto do crescimento e perda de adesão celular pode ser responsável pela capacidade das células cancerosas para ultrapassar os limites dos tecidos normais e metástase [5]. A importância da E-caderina em manter a adesão celular implica que a sua disfunção pode desempenhar um importante papel na tumorigénese. A perda da expressão de E-caderina ocorre numa variedade de tumores humanos e é a hipótese de ser um passo importante na progressão da formação de tumores a invasão e metástase [6].
Nos últimos anos, existem vários estudos sobre o papel crítico de E-caderina na tumorigênese. Demonstrou-se que as mutações de linha germinal do gene da E-caderina está relacionada com gástrico e cancro colorectal familiar [7, 8]. Além disso, as mutações somáticas de E-caderina, também foram encontrados no carcinoma gástrico e perda alélica do locus de E-caderina em 16q22.1 tem sido relatada em diferentes tumores epiteliais, tais como cancro da mama, do ovário, do endométrio, e carcinomas da próstata [9, 10] . Excepto para estas alterações genéticas, alteração epigenética incluem hipermetilação do "ilha de CpG 5 dentro do promotor de E-caderina é também responsável pela repressão da transcrição do gene [11]. Sabe-se que a hipermetilação anormal de ilhas CpG associados com genes supressores de tumor pode levar ao silenciamento transcricional na neoplasia [12]. Na verdade, o silenciamento associada a metilação da caderina-E representa a causa mais comum para a sua inativação em vários tipos de câncer como fígado, próstata, mama e esôfago [13-15].
Adenocarcinoma gástrico cardíaca (GCA), que foi anteriormente registada como câncer de esôfago ou cancro gástrico, foi diagnosticado de forma independente em anos muito recentes, devido à melhoria na triagem endoscópica precoce e diagnóstico patológico. A China é um país com regiões de alta incidência de GCA, especialmente em Taihang montanha do norte da China. fatores exógenos, incluindo deficiência de nutrição, hábitos de vida pouco saudáveis, o consumo de álcool e tabaco, infecções patogénicas são geralmente considerados como os fatores de risco para o desenvolvimento de GCA na China [16-18]. No entanto, apenas um subconjunto de indivíduos expostos aos factores de risco acima referidos exógenos iria desenvolver GCA, sugerindo que os acontecimentos genéticos e ambientais múltiplos pode contribuir para a progressão da GCA. É cada vez mais reconhecido que o silenciamento epigenético da expressão do gene promotor por hipermetilação CpG é um importante mecanismo alternativo na inactivação de genes supressores de tumores e os genes associados a tumores em cancros [19]. Mutações do gene da caderina-E são raros na ACG, assim, neste estudo, foi avaliado o papel da metilação da ilha 5 'CpG de E-caderina e sua correlação com reduzida expressão de E-caderina em GCA.
Métodos
pacientes e espécimes
tumor e amostras de tecidos normais pareados foram obtidos de 92 pacientes. Estes tecidos foram divididos em duas partes paralelas, uma parte foi congelada e armazenada a -80 ° C até ARN foi extraído, a outra parte foi fixada em formalina e incluídos em parafina. Os casos foram todos os pacientes internados para tratamento cirúrgico na Quarta Affiliated Hospital, Hebei Medical University, entre 2004 e 2006. digitação histológico do tumor foi realizada com base em espécimes ressecados no Departamento de Patologia do mesmo hospital. Todos os carcinomas gástricos cardíacos eram adenocarcinomas com os seus epicentros na junção gastroesofágico, isto é, a partir de 1 cm acima até 2 cm abaixo da junção entre a extremidade do esófago tubular e o início do estômago sacular [20]. Informação sobre o estadiamento TNM estava disponível a partir de gravações hospitalares e diagnóstico patológico. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Institute Hebei Ética e consentimento informado foi obtido de todos os indivíduos recrutados.
Metilação reação em cadeia da polimerase específico (MSP) para E-caderina metilação do promotor
DNA genômico de adenocarcinomas cardíacos gástricas e adjacente secções não malignas foi isolado a partir de lâminas embebidas em parafina de tecido por métodos convencionais, utilizando um método de digestão de proteinase K simplificado. Para analisar os padrões de metilação do DNA, que tratada de ADN genómico com bissulfito de sódio, como descrito anteriormente [21]. Em resumo, 2 ug de ADN foram desnaturados com NaOH a 2 M a 37 ° C durante 10 minutos, seguido por incubação com 3 M de bissulfito de sódio, pH 5,0, a 50 ° C durante 16 horas. Bissulfito tratada DNA foi então purificado (Kit de Limpeza de ADN; Promega, Madison, Wisconsin, EUA), incubou-se com NaOH 3 M, à temperatura ambiente durante cinco minutos, precipitou-se com acetato 10 de amónio e 100% de etanol, lavados com etanol a 70%, e ressuspensas em 20 ul de água destilada.
Uma abordagem de PCR aninhada foi utilizado para determinar o estado de metilação dentro da ilha de CpG de E-caderina no exão 1 (sequência de -126 pb para 144 pb em relação ao início da transcrição, número de acesso GenBank D49685 ) que foi publicado anteriormente [15]. Na primeira rodada de PCR, 100 ng de DNA tratado pelo bissulfito foram amplificados. Os iniciadores de sequenciação foram 5'-GTTTA GTTTTGGGGAGGGGTT-3 '(sentido) e 5'-ACTAC TACTCCAAAAACCCATAACTAA-3' (anti-sentido), e as condições de ciclo foram um ciclo de 95 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s, e uma extensão final a 72 ° C durante 5 min. O tamanho do produto após esta reacção de PCR inicial foi de 270 pb. Para a segunda ronda de PCR, o produto foi diluído 1: 50 em água, e 2 ul da diluição foi usado para MSP. sequências de iniciadores aninhados para E-caderina para a reacção metilado eram 5'-TG TAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC-3 '(sentido) e 5'-CGAATACGATCGAATCGAACCG-3' (anti-sentido), e as sequências de iniciadores para a reacção não metilado foram 5'-3-TGGTTGTAGTTATGTATTTATT TTTAGTGGTGTT '(sentido) e 5'-ACACCAAATA CAATCAAATCAAACCAAA-3' (anti-sentido). parâmetros de PCR foram como listado acima, excepto que as temperaturas de recozimento para as reacções metilados e não metilados foram de 64 ° C e 62 ° C, respectivamente. Os tamanhos dos produtos das reações metilados e não metilados eram 112 e 120 pb, respectivamente. A linha celular de cancro da mama MDA-MB-231, o que demonstra a metilação e silenciamento de E-caderina e espaços em branco de reagente foram utilizados como controlos positivos e negativos.
Coloração imuno-histoquímica para a E-caderina
expressão de E-caderina foi determinada pela imunocoloração utilizando o método da imunoperoxidase complexo de avidina-biotina, que foi realizada em secções paralelas histopatológicas da secção de tumor embebido em parafina e tecido normal emparelhado. A peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 minutos, seguido por recuperação de antigénio de microondas durante nove minutos a 98 ° C em mM de tampão 10 de citrato de sódio (pH 6,0) e incubados em soro normal de cavalo a 2%, para minimizar a ligação não específica. As lâminas foram sequencialmente incubadas com anticorpo monoclonal primário, anticorpo de ratinho anti-E-caderina (diluição 1: 100 em tampão fosfato salino, Santa Cruz, sc-8426) durante a noite a 4 ° C, o anticorpo secundário biotinilado durante 30 min a 37 ° C e reagente ABC durante 45 min a 37 ° C. 0,5% de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma, St Louis, MO) foi utilizado como o cromagénio. Para um controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído com IgG de rato. Slides com mucosa gástrica normal foram usados ​​como um controlo positivo.
Medição da expressão de ARNm de caderina-E
Extraiu-se ARN a partir de tecidos por congelação, por métodos convencionais, utilizando Trizol (Invitrogen, EUA). O ADNc foi sintetizado utilizando o Advantage RT-for-PCR kit (Clontech, Palo Alto, CA) com oligo (dT) iniciação, tal como recomendado no protocolo fornecido. O gene GAPDH foi usada como um controlo. As sequências dos iniciadores de E-caderina foram 5 ° ‰ -CGACCCAACC CAAGAATCTA-3 ° ‰ (sentido) e 5 ° ‰ -AATGGCAG GAATTTGCAATC-3 ° ‰ (antisense), sequência de iniciador de GAPDH foram 5 ° ‰ -GGGAAACTGTGGCGT GAT-3 ° ‰ (sentido) e 5 ° ‰ -GTGGTCGTTGAGGG CAAT-3 ° ‰ (antisense), tamanho do produto foram 202 pb e 342 pb, respectivamente. Os produtos de PCR foram resolvidos em geles de agarose a 2% e as intensidades de sinal foram quantificados utilizando um sistema de imagem de computador. Os níveis de transcritos de genes foram quantificadas como a razão entre a intensidade do sinal de E-caderina para a intensidade de β-actina. expressão inactivado foi marcado quando a expressão de um gene da E-caderina na amostra do tumor foi < 25% da sua expressão na amostra normal correspondente.

Análise estatística A análise estatística foi realizada usando o pacote de software SPSS10.0 (SPSS Company, de Chicago, Illinois, EUA). O teste exato de Fisher e Qui-quadrado foram utilizados para avaliar a significância estatística das diferenças e comparar associações categóricas. Dois lados testes foram utilizados para determinar a significância e valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes para todos os testes estatísticos.
Resultados
características Assunto
Como mostrado na Tabela 1, 92 pacientes GCA foram obtidos em esta pesquisa, incluindo 73 do sexo masculino e 19 do sexo feminino, a idade variou de 38 ~ 76, idade 56,9 dizer. Todos os casos foram classificados em 4 tumor-nódulo-metástase (TNM) estágios acordo com a norma UICC, 8 de fase I (8,7%), 32 de fase II (34,8%), 38 de fase III (41,3%), 14 de estágio IV (15,2%). De acordo com as fases patológicas, os casos foram classificados em 3 grupos, 42 (45,7%) do grupo moderado, 34 (36,9%) do grupo pobre moderada e 16 (17,4%) dos pobres group.Table 1 características clínicas e patológicas de pacientes GCA
Grupos
n (%)
Sexo Masculino

73 (79,3)
Feminino
19 (20,7 )
a média de idade em anos (SD)
56,9 (8,86)
estágio TNM
I
8 (8,7)
II
32 (34,8)
III
38 (41,3)
IV
14 (15,2)
Patológica diferenciação de tumor
moderada
42 (45,7)
pobre moderada
34 (36,9)
análise de metilação do gene da caderina-e
A análise de metilação pobres
16 (17,4)
foi realizada com sucesso em todo o tumor e emparelhado amostras de tecidos normais (Figura 1). Para 10% de amostras, análise de metilação foi repetido para o controlo de qualidade. No 63 (68,5%) de 92 tumores GCA E-caderina foi detectada metilação, enquanto apenas em 10 (10,9%) de tecidos normais emparelhadas foi detectada E-caderina metilação. A frequência de metilação de E-caderina de tecidos de tumor foi significativamente maior do que os tecidos normais emparelhadas (P < 0,001). Quando estratificada por fases TNM, a frequência de metilação do gene da caderina-E de pacientes GCA com estágio III e estágio IV (78,8%) foram significativamente maiores do que os pacientes GCA com a fase I e fase II (55%) (χ2 = 5,96, P = 0,01 ). Quando estratificado por fases patológicas, os E-caderina frequências de metilação do gene do grupo moderado, má-moderada e pobres eram 52,4%, 73,5% e 100%, a frequência de metilação do gene da caderina-E de má grupo significativamente maior do que em moderada e fraca grupos -moderate (χ2 = 8,92, P = 0,003) (Tabela 2). A Figura 1 Análise de metilação de E-caderina em tecido de tumor (T) e tecido normal (N) correspondente. u: indica a presença de genes que não metilados; m: indica a presença de genes metilados. Os casos 1 e 2: metilação específico do tumor; Caso 3: o tumor é completamente metilado, enquanto que o tecido normal correspondente tem uma muito fraca banda demonstrando metilação; Caso 4: ambos tumor e correspondente tecido normal não metilado
Tabela 2 E-caderina metilação e características de coloração imuno-histoquímica de pacientes GCA
<. col> Grupo
estado de metilação
P
imuno coloração
P
M
U Restaurant -
+
estágio TNM
I
4 4
2
6
II
18
14
13
9
III
29
9
26
12
IV
12 Página 2
0.015a
10 4
0.002a
diferenciação patológico do tumor
moderada
22
20
20 Página 2
pobres moderada
25
9
18
16
pobres
16
0
0.003b
13 Sims 3
0.022b
um valor P de fase III e IV pacientes contra a fase I e II, os doentes, valor P b de má grupo diferenciação contra grupos moderados e pobre moderadas
imunocoloração de e-caderina gene
Como mostrado na Tabela 2, a coloração foi heterogénea em 51 tecidos de tumor, as células de tumor com diminuição da coloração membranosa e-caderina foram misturadas com células tumorais mostra forte coloração das membranas (Figura 2). Frequência de expressão da proteína foi de 44,6% em tecidos tumorais, enquanto que amostras de tecido normal emparelhados todos demonstraram difusa forte coloração E-caderina membranoso. Frequência de expressão da proteína foi significativamente diferente entre tumor e tecidos normais emparelhadas (P < 0,001). Quando estratificada por fases TNM, a frequência de expressão da proteína do gene da caderina-E da fase III e tecidos tumorais IV (30,8%) foi significativamente menor do que na fase I e tecidos II tumor (62,5%) (χ2 = 9,21, P = 0,002) . Frequência de E-caderina expressão da proteína do gene de má grupo significativamente menor do que em grupos moderados e pobres moderada (χ2 = 5,23, P = 0,022). Figura imunocoloração 2 E-caderina no tecido GCA. A: coloração positiva (tecido normal). B:. Coloração negativa (tecido GCA)
expressão de mRNA para os níveis do gene da E-caderina
das transcrições foram determinadas em 32 amostras congeladas GCA seleccionados por análise de RT-PCR (Figura 3). As 32 amostras GCA incluindo 2 de fase I, 2 de fase II, 8 de fase III e 8 do estágio IV de casos em que o tumor foi metilado e 12 casos (2 de fase I, 4 dos níveis II, 4 de fase III e 2 do estágio IV) com o gene da caderina-e não metilado. Um fragmento de 202 pb do transcrito do gene da E-caderina foi gerado, com um fragmento de GAPDH 342 pb do transcrito como um controlo. 16 (1 de fase II, 7 de fase III e 8 do estágio IV) casos (80%) da expressão de mRNA inativada foram observadas em 20 amostras de tumores com o gene da caderina-E metilado, os outros 4 (2 de fase I, 1 de fase II, 1 de III) casos de palco mostrou expressão positiva. 12 amostras de tumor com gene da E-caderina não metilado todos mostraram expressão positiva do gene da E-caderina. Figura 3 Análise de ARNm da E-caderina em tecidos tumorais. 1: 100 bp marcador de DNA 2,4,5,6,9: expressão de mRNA positiva 3,7,8:. Expressão de mRNA negativo
Discussão
China é um país com alta incidência de câncer do trato digestivo, que inclui esôfago carcinoma, câncer de estômago e adenocarcinoma gástrico cardíaca (GCA). GCA, que antigamente era registrado como câncer de esôfago ou cancro gástrico, foi diagnosticado de forma independente em anos muito recentes, devido à melhoria na triagem endoscópica precoce e diagnóstico patológico. Tem sido sugerido por vários dados epidemiológicos que a incidência de GCA está a aumentar nos últimos anos. Algumas pesquisas mostraram que o mecanismo e clínica sintoma da GCA é diferente de câncer gástrico, mas semelhante ao câncer de esôfago. O mecanismo exato da ocorrência de GCA ainda não está claro para o momento. É geralmente aceite que o fator hereditário que irritar a ocorrência de tumor incluindo dois mecanismo, genética e mecanismo de epigenética. anormalidades genéticas de proto-oncogenes e genes supressores de tumor são mudanças bem conhecidas que são frequentemente envolvidos na patogênese do câncer. No entanto, epigenética inactivação de certos genes supressores de tumor por metilação aberrante do promotor é frequentemente observado em vários tipos de cancro e pode desempenhar um papel crucial na tumorigénese. Enquanto anormalidades genéticas estão associados a mudanças na sequência de DNA, eventos epigenéticos podem levar a mudanças na expressão gênica que ocorrem sem mudanças na sequência de DNA. Se os genes supressores de tumores são afectados, resulta geralmente no silenciamento transcricional e, portanto, a inactivação deste gene. Pode, em seguida, confere vantagens de crescimento para estas células que favorecem o desenvolvimento do cancro [22].
Como membro de adesão celular molecular, E-caderina desempenhar um papel importante na manutenção da adesão celular e a sua disfunção pode resultar em tumorigenesis.6 O biológico consequências da sua disfunção incluem rompimento de adesão intercelular e comprometimento de transativação ß-catenina-mediada [23]. Até à data, no entanto, os mecanismos reguladores responsáveis ​​pela níveis alterados de proteínas de E-caderina em GCA não foram elucidados. Tem sido relatado que a hipermetilação de E-caderina foram associados com o cancro gástrico e esofágico adenocarcinoma [21, 24]. No entanto, não há nenhum outro relatório sobre a relação entre Ecadherin metilação e tumorigênese da GCA. Neste estudo mostramos que a hipermetilação da ilha 5 'CpG do promotor da E-caderina ocorreu frequentemente em tecidos GCA (68,5%) e que esta alteração metilação foi associado com expressão reduzida de proteína E-caderina. Os nossos dados sugerem que o silenciamento epigenético do promotor de E-caderina através de hipermetilação pode ser um dos mecanismo crítico para a inactivação deste gene na ACG. silenciamento do gene associado com a hipermetilação é mediada por proteínas de ligação de metilo que se ligam a citosinas metiladas e recrutam um complexo de proteínas que reprimem a transcrição, incluindo a histona desacetilases [25].
No nosso estudo, verificou-se que na maioria dos casos examinámos, metilação E-caderina foi específico do tumor. No entanto, 10 casos em que a alteração de metilação estava presente em ambos os tumores e tecidos normais emparelhadas do mesmo paciente. Dada a sensibilidade de MSP aninhada, é possível que as amostras de aparência normal continha uma célula de cancro raro que era indetectável por histomorfologia. Devido à limitação de espécime, não estudamos a metilação da caderina-E em tecidos cárdia normais. No entanto, tecido esofágico normal não mostram metilação aberrante da E-caderina em alguns estudos [21] e em estudos anteriores investigar metilação E-caderina em diferentes tipos de tumores, tecidos normais da medula óssea, da mama, da tiróide, e da mucosa oral foram não metilado [ ,,,0],14, 26]. Estes dados sugerem fortemente que a metilação do promotor de E-caderina é um evento aberrante. O facto de que apenas detectada em tecidos normais de metilação emparelhados de doentes nos quais o tumor foi metilada correspondente também é consistente com a hipótese de que o cancro nestes indivíduos surgiu a partir de um precursor clonal metilado. Em um estudo de progressão neoplásica esófago de Barrett, a hipermetilação do gene p16 supressor do tumor foi detectado em amostras patologicamente de aparência normal obtida de um doente que mais tarde desenvolveram displasia [27]. Por conseguinte, a inactivação epigenética de genes supressores de tumor pode ser uma característica precoce de tumorigénese.
Os nossos resultados mostraram que a expressão da proteína de Ecadherin em tecidos de tumor significativamente inferior do que em tecidos normais emparelhadas, no entanto, coloração imuno-histoquímica mostrou também a coloração das membranas normais de E -cadherin em algumas amostras tumorais com metilação de E-caderina. Há várias razões possíveis para os eventos. Em primeiro lugar, Esta foi, provavelmente, devido ao facto de coloração imuno-histoquímica não era tão sensível como PCR na detecção de subpopulações de células com metilação de genes e, consequentemente, a regulação negativa de E-caderina. Em segundo lugar, os tecidos tumorais podem misturar-se alguns tecidos normais e podem apresentou coloração membranosa normal da E-caderina. Em terceiro lugar, gene de metilação heterogêneo ou um metilação alelo pode ser uma razão importante. Em nossos estudos, descobrimos que o estado de metilação dos tecidos tumorais que ambos mostraram expressão da proteína positiva e hipermetilação estavam incompletos metilação Ecadherin. Além disso, foi demonstrado que a metilação de ADN que suprimida a expressão do gene substancialmente no nível de transcrição e a densidade de CpG island methylation foi relacionada com o grau de transcrição reprimida [28]. juntamento promotor pode ser completamente suprimido por metilação densidade mais baixa, no entanto, quando o promotor foi reforçada por enhanser, função da transcrição será reactivado. Em nosso estudo, também encontramos a expressão do mRNA positiva em algumas amostras de tumores com o gene da caderina-E metilados. É, em parte, devido ao facto de que o grau de metilação do promotor foi insufficent para suprimir a transcrição de E-caderina. Ao todo, nosso estudo sugere que o silenciamento epigenético do promotor E-caderina via hipermetilação pode ser um dos mecanismo de inativação de E-caderina em GCA.
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos aos pacientes e indivíduos controle por participar neste estudo.
apoiada por doações do considerável assuntos distintos fundação da província de Hebei.

• significado clínico do sistema de uPA em câncer gástrico com metástase peritoneal
• De Epstein-Barr metilação de genes humanos em células de cancro gástrico específico do vírus