Detectie van promotor hypermethylering van het CpG eiland van E-cadherine in de maag cardiale adenocarcinoma

detectie van promotor hypermethylering van het CpG eiland van E-cadherine in de maag cardiale adenocarcinoom
Abstract
Richt
Abnormale hypermethylatie van CpG eilanden in verband met tumor suppressor genen kunnen leiden tot transcriptie silencing in neoplasie. Het doel van deze studie was om de promotor-methylering en expressie van E-cadherine-gen in gastrisch adenocarcinoom cardiale (GCA) onderzoeken.
Methods
Een ingebedde MSP benadering werkwijze immunohistochemie en RT-PCR werden respectievelijk gebruikt voor de studie methyleringsstatus van de 5 'CpG eiland E-cadherine, de eiwitexpressie en mRNA expressie in tumoren en overeenkomstige normale weefsels.
Resultaten
E-cadherine werd gemethyleerd in 63 van 92 (68,5%) tumormonsters die was significant hoger dan in overeenkomstige normale weefsels (P < 0,001). Methylering frequenties van stadium III en IV tumorweefsels was significant hoger dan die in fase I en II tumorweefsels (P = 0,01). Methylatie status van slechte differentiatie groep was significant hoger dan matige en slechte matige differentiatie groepen (P < 0,01). Door immunokleuring 51 van 92 tumor tisssues aangetoond heterogene, positieve immunokleuring van de tumor weefsels (44,6%), significant verschillend van elkaar afgestemd normale weefsels (P < 0,001). Positieve immunokleuring van stadium III en IV tumorweefsels was significant lager dan stadium I en II tumorweefsels (P < 0,01). Slechte differentiatie groep was significant lager dan matig en slecht matige differentiatie groepen (P < 0,05). 80 procent van tumorweefsels met E-cadherine-gen gemethyleerd toonde geïnactiveerd mRNA expressie.
Conclusies
Hoge methylatiestatus van de 5 'CpG eiland E-cadherine-gen kan één van de mechanismen in de ontwikkeling van cardiale maag adenocarcinoom .
Trefwoorden
E-cadherine methylatie maag cardiale adenocarcinoom Introductie
E-cadherine is een M r 120.000 transmembraan glycoproteïne uitgedrukt op epitheelcellen en is verantwoordelijk voor homofiele, Ca 2 + afhankelijke intercellulaire adhesie die essentieel is voor de handhaving van normale weefselarchitectuur in epitheliale weefsels [1]. Het cytoplasmatische domein van E-cadherine bindt aan a-, β- en y-cateninen, die weer verbonden actins en deze interactie is essentieel voor de functie [2]. Cel-cel en cel-matrix interacties cruciaal zijn betrokken bij neoplastische transformatie en metastase [3, 4]. Defecte celadhesie kan bijdragen tot verlies van contact inhibitie van de groei en verlies van celhechting kan verantwoordelijk zijn voor het vermogen van kankercellen om normaal weefsel grenzen te overschrijden en metastase [5]. Het belang van E-cadherine in het handhaven celadhesie impliceert dat de disfunctie een belangrijke rol kunnen spelen tumorgenese. Verlies van E-cadherine-expressie komt in een verscheidenheid van menselijke tumoren en wordt verondersteld een belangrijke stap bij de progressie van tumorvorming tot invasie en metastase [6].
De afgelopen jaren zijn er diverse studies op het kritieke rol van E-cadherine in tumorigenese. Er is aangetoond dat kiemlijn mutaties van het E-cadherine-gen komt voor bij familiaire maag- en darmkanker [7, 8]. Bovendien werden somatische mutaties van E-cadherine ook gevonden in maagcarcinoom en allele verlies van E-cadherine op 16q22.1 locus is gerapporteerd in verschillende epitheliale tumoren zoals borst-, eierstok-, endometriale en prostaatcarcinomen [9, 10] . Behalve deze genetische veranderingen, epigenetische verandering omvatten hypermethylering van de 5 'CpG eiland in de promoter van E-cadherine is ook verantwoordelijk voor transcriptionele repressie van het gen [11]. Het is bekend dat abnormale hypermethylering van CpG eilanden geassocieerd met tumor suppressor genen kan leiden tot transcriptionele silencing in neoplasie [12]. Inderdaad-methylatie geassocieerd silencing van E-cadherine is de meest voorkomende oorzaak voor zijn inactivatie in een aantal vormen van kanker, zoals de lever, prostaat-, borst- en slokdarmkanker [13-15].
Gastric cardiale adenocarcinoom (GCA), dat vroeger werd geregistreerd zoals slokdarmkanker en maagkanker, onafhankelijk is gediagnosticeerd in zeer recente jaren, vanwege de verbeterde vroege endoscopische screening en pathologische diagnose. China is een land met een hoge incidentie gebieden van GCA, Vooral in Taihang berg van Noord-China. Exogene factoren, waaronder voeding deficiëntie, ongezonde leefgewoonten, de consumptie van alcohol en tabak, worden pathogene infecties over het algemeen beschouwd als de risicofactoren voor het ontwikkelen van GCA in China [16-18]. Echter, slechts een aantal individuen blootgesteld aan de bovengenoemde exogene risicofactoren zou GCA ontwikkelen, suggereert dat meerdere genetische en epigenetische gebeurtenissen bijdragen aan de progressie van GCA. Het wordt steeds meer erkend dat epigenetische inactivatie van genexpressie door CpG promotor hypermethylatie een belangrijk alternatief mechanisme voor het inactiveren van tumorsuppressorgenen en tumor geassocieerde genen in kanker [19]. Mutaties van het E-cadherine-gen zijn zeldzaam in GCA dus in deze studie hebben we de rol van methylatie van de 5 'CpG eiland E-cadherine en zijn correlatie met verminderde E-cadherine in GCA geëvalueerd.
Methods
patiënten en monsters
Tumor en gepaarde normale weefselmonsters werden verkregen van 92 patiënten. Deze weefsels werden verdeeld in twee evenwijdige delen, enerzijds werd ingevroren en bewaard bij -80 ° C tot RNA werd geëxtraheerd, anderzijds werd met formaline gefixeerd en in paraffine ingebed. De gevallen waren allemaal opgenomen patiënten voor chirurgische behandeling in de vierde Affiliated Hospital, Hebei Medical University tussen 2004 en 2006. histologische tumor typering werd uitgevoerd op basis van resectiepreparaten in de afdeling Pathologie van hetzelfde ziekenhuis vervoerd. Alle cardiale maag carcinomen waren adenocarcinomen hun epicentrum in de gastro-oesofageale overgang, d.w.z. van 1 cm boven tot 2 cm onder de verbinding tussen het uiteinde van het buisvormige slokdarm en het begin van het zakvormig maag [20]. Informatie over TNM staging beschikbaar was uit het ziekenhuis opnames en pathologische diagnose. De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Hebei Cancer Institute en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle aangeworven onderwerpen.
Methylering specifieke polymerase kettingreactie (MSP) voor E-cadherine-promoter methylering
Genomic DNA uit de maag cardiale adenocarcinomen en aangrenzende nonmalignant secties werd geïsoleerd uit in paraffine ingebed weefsel objectglaasjes volgens standaardwerkwijzen met gebruikmaking van een vereenvoudigde proteinase K digestie methode. De DNA methylatie patronen onderzoeken we behandeld genomisch DNA met natriumbisulfiet zoals eerder [21] beschreven. In het kort, 2 ug DNA werd gedenatureerd met 2 M NaOH bij 37 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door incubatie met 3 M natriumbisulfiet, pH 5,0, bij 50 ° C gedurende 16 uur. Bisulfiet behandelde DNA werd vervolgens gezuiverd (DNA Cleanup Kit, Promega, Madison, Wisconsin, USA), geïncubeerd met 3 M NaOH bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, neergeslagen met 10 M ammoniumacetaat en 100% ethanol, gewassen met 70% ethanol, en geresuspendeerd in 20 pl gedestilleerd water.
Een ingebedde PCR benadering werd gebruikt om de methylatiestatus in de E-cadherine CpG eiland in Exon 1 bepalen (sequentie -126 bp tot 144 bp ten opzichte van de transcriptie start, GenBank toegangsnummer D49685 ) die eerder is gepubliceerd [15]. In de eerste ronde van PCR, 100 ng bisulfiet-behandelde DNA werd geamplificeerd. De bepalende primers waren 5'-GTTTA GTTTTGGGGAGGGGTT-3 '(sense) en 5'-ACTAC TACTCCAAAAACCCATAACTAA-3' (antisense) en de cycling condities waren één cyclus van 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 30 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 50 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s, en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. De grootte van het product na deze eerste PCR-reactie was 270 bp. Voor de tweede ronde van PCR werd het product verdund 1: 50 in water, en 2 pl van de verdunning werden gebruikt voor MSP. Geneste primer sequenties voor E-cadherine voor de gemethyleerde reactie waren 5'-TG TAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC-3 '(sense) en 5'-CGAATACGATCGAATCGAACCG-3' (antisense) en primer sequenties voor de niet-gemethyleerde reactie waren 5'-TGGTTGTAGTTATGTATTTATT TTTAGTGGTGTT-3 '(sense) en 5'-ACACCAAATA CAATCAAATCAAACCAAA-3' (antisense). PCR parameters waren zoals hierboven vermeld, behalve dat de annealing temperaturen voor de gemethyleerde en niet-gemethyleerde reacties waren 64 ° C en 62 ° C. Het product afmetingen van de gemethyleerde en niet-gemethyleerde reacties waren 112 en 120 bp, resp. De borstkanker cellijn MDA-MB-231, die methylering en inactivatie van E-cadherine en reagens blanco illustratie werden gebruikt als positieve en negatieve controles.
Immunohistochemische kleuring van E-cadherine
E-cadherine-expressie werd bepaald door immunokleuring met het avidine-biotine complex immunoperoxidase methode, die werd uitgevoerd op parallelle histopathologische coupes van in paraffine ingebedde tumor sectie en gepaard normaal weefsel. Endogeen peroxidase werd geblokkeerd met 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten, gevolgd door microgolf antigeenterugtrekking negen minuten bij 98 ° C in 10 mM natriumcitraat buffer (pH 6,0) en geïncubeerd in 2% normaal paardenserum om niet-specifieke binding te minimaliseren. De objectglaasjes werden achtereenvolgens geïncubeerd met primair monoklonaal, muis anti-E-cadherine antilichaam (1: 100 verdunning in met fosfaat gebufferde zoutoplossing, Santa Cruz, sc-8

• Klinische betekenis van het uPA-systeem in de maag buikvlieskanker met uitzaaiingen
• Epstein-Barr virus-specifieke methylatie van genen in menselijke maagkanker cellen