Bedömning av Toll-like receptors 4 Asp299Gly, Thr399Ile och interleukin-8 -251 polymorfismer i risk för utveckling av distala magcancer

Bedömning av Toll-like receptors 4 Asp299Gly, Thr399Ile och interleukin-8 -251 polymorfismer i risk för utveckling av distala magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
intensiteten av inflammation som induceras av Helicobacter pylori
kolonisering är associerad med utvecklingen av distala gastrisk cancer (GC). Värdsvar till H
. pylori
har satts i samband med genetiska polymorfismer som påverkar både medfödda och adaptiva immunsvar.
Vårt mål var att undersöka om förekomsten av TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile Mössor och IL-8-251
A /T-polymorfism hade något inflytande i utvecklingen av distala GC i en mexikansk befolkningen
metoder
Vi studerade 337 patienter som delades in i två grupper:. 78 patienter med histologiskt bekräftade distala GC och 259 icke-cancer kontroller. Närvaron av H. pylori
i kontrollpopulationen definierades av positiva resultat av åtminstone två av fyra diagnostiska test: serologi, histologi, snabb ureastest och kultur. Humant DNA renades och genotypas för TLR4 Asp299Gly
polymorfism genom Pyrosequencing för TLR4 Thr399Ile Musik av PCR-RFLP och IL8-251 Musik av förstärkningen eldfasta mutationssystem (ARMS) -PCR.
Resultat
icke-cancerkontrollgruppen konstaterades vara i Hardy-Weinberg jämvikt vid polymorfa loci studerade (chi-kvadrat HW = 0,58 för IL8-251
, 0,42 för TLR4 Asp299Gly Mössor och 0,17 för TLR4 Thr399Ile
). Frekvenserna av muterade alleler (homozygota plus heterozygota) jämfördes mellan fall och kontroller. Vi fann ingen signifikant skillnad för TLR4- Asp299Gly
[den 7,7% av distala GC patienter och 7,7% icke-cancer kontroller (p = 0,82)] och för TLR4 Thr399Ile
[1,3% av GC patienter och 5 % av kontrollpopulationen (p = 0,2)]. I kontrast, för IL-8-251
A /T, hade 80,77% av GC patienterna och 66,4% i kontrollgruppen ålder och kön matchade åtminstone en kopia av muterat allel (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2) (p = 0,023).
Slutsats
denna studie visade att IL8-251 * A
allelen kan vara relaterat till utveckling av distala magcancer i denna mexikanska befolkning.
bakgrund
Helicobacter pylori
nästan uteslutande kolonisera slemlager av den mänskliga magen och uppehålla sig i värd för år, decennier eller kanske livslång. Hos cirka 10% av fallen, är organismen i samband med olika kliniska utfall, inklusive icke-ulcerös dyspepsi, magsår, och den distala magcancer [1].
Både värd och miljömässiga faktorer har associerats med denna kliniska mångfald. Värdfaktorer är främst relaterade till erkännande av bakterierna av immunsystemet och variation i nivån av cytokin svar [2, 3].
Erkännande av patogener förmedlas genom en uppsättning av nedärvda kodade receptorer som kallas mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS). Dessa receptorer känner igen konserverade molekylära mönster, som delas av stora grupper av mikroorganismer. En viktig PRR är Toll-like receptor 4 (TLR4), en transmembranreceptor som känner igen en rad av ligander, inklusive lipopolysackarid (LPS), som finns i cellväggen hos gramnegativa bakterier såsom H. pylori
[3 ]. Två single nucleotide polymorphisms (SNP) i TLR4
genen, Asp-299 → Gly och Thr-399 → Ile övergångar, har visat sig leda till hyporesponsiv till LPS, reducerade epitelial TLR4 densitet och minskad inflammatorisk cytokin svar på LPS [ ,,,0],4]. Vidare genetiska varianter av cytokiner är även kritiska för det inflammatoriska svaret, och flera gener från olika vägar har förknippats med gastrisk cancer, inklusive interleukin (IL) -1b
, TNF
, IL-10
och IL-8
[5-7] IL-8 cytokin fungerar som en potent kemoattraherande för neutrofiler och lymfocyter.
. Det har rapporterats att IL-8 nivåer ökat 10-faldigt i magcancer prov jämfört med normala mag vävnader. En väl karakteriserad SNP T /A i -251 lokus har beskrivits och i samband med högre IL-8-produktion och flera sjukdomar [8-11].
Vårt mål var att avgöra om TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
och IL8-251 A /T
polymorfismer är associerade med distal gastrisk cancer hos en väldefinierad mexikanska befolkningen.
Metoder
Patientpopulation
Vi studerade 78 obesläktade patienter med histologiskt bekräftade distala GC (medelålder = 58.6y, medianålder = 60, åldersgrupp: 22-84, F: M = 0,56). Vi har också studerat 259 patienter utan histologiska tecken på GC (medelålder = 57.1y, medianålder = 54, åldersgrupp = 18-92, F: M = 1,17). Denna population har beskrivits tidigare [7]. Alla patienter rekryterades på sjukhuset Universitario "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León. Den lokala etiska kommittén godkände studien och skriftligt informerat samtycke erhölls från alla individer.
Histopatologiska undersökningar
alla kontrollpatienter, åtta biopsiprover erhölls för histologisk utvärdering, två från den mindre krökningen, två från större krökning , två från incisura angularis, och två från prepyloric regionen. Från patienter med distal GC, var åtminstone 8 biopsier erhållits från tumören för histologisk utvärdering. Biopsier från fall och kontroller fixerade, inbäddade och färgades med hematoxilin-eosin. En erfaren patolog undersökt alla de histologiska diabilder.
H. pylori
status
H. pylori
status kontrollpopulationen bestämdes genom histologi, den snabba ureastest (RUT), serologi och kultur . För RUT, var en antral biopsi analyserades med en validerad icke-kommersiellt test [12]. Biopsin placerades i en provflaska, inkuberades vid 37 ° C och avlästes inom 24 h. En färgförändring från orange till magenta indikerade ett positivt resultat. För serologi, erhölls en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) används för att visa närvaron av IgG-antikroppar, såsom beskrivits tidigare [13] Culture.
Utfördes på två corpus och två antrum biopsier genom standardmetoder. Biopsier placerades i 10% biodagar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) och inkuberades vid 37 ° C under minst en vecka enligt mikroaerob betingelser. Stammar identifierades genom Gram-färgning, var oxidas, katalas och ureastester patienter kontroll.
Anses H. pylori
smittade när åtminstone två av de diagnostiska testerna var positiva.
Prevalensen av H. pylori
infektion hos patienter med ventrikelcancer bestämdes genom resultatet av histologi endast.
Genotypning
Genomiskt DNA extraherades från perifert blod genom fenol-kloroform-isoamilic alkohol och utfällning med etanol metoden. En amplifiering Refractory Mutation System (ARMS) -PCR-metoden användes för att genotypa den IL8-251
polymorfism såsom beskrivits tidigare [14].
TLR4 Thr399Ile
polymorfism bestämdes genom PCR-RFLP [15] och den TLR4 Asp299Gly
polymorfism bestämdes med en pyrosekvensering metod utformad för denna studie. Initialt gjordes en PCR med primrarna F-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT ACC TCC ATG och R-CCC TTT CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG med den omvända primern biotinyleras. PCR-betingelserna var: 94 ° C under 5 min och 40 cykler av 94 ° C, 59 ° C och 72 ° C under 30 s vardera, och en slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min. För Pyrosequencing var biotinylerade PCR-mallar immobiliserade på streptavidinbelagda paramagnetiska Sepahrose pärlor i bindningsbuffert. De bead-mallkomplex tvättades genom nedsänkning i 70% alkohol och 0,5 M NaOH och tillsattes därefter till 45 pl av glödgning buffert innehållande 15 pmol av sekvenseringsprimern 5'-CAT ACT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Glödgning skedde vid 80 ° C under 2 min. Realtidspyrosekvensering utfördes i en automatiserad 96-brunnars pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyrosequencing AB, Uppsala, Sverige) med användning av enzymer och substrat som rekommenderas av tillverkaren.
Statistisk analys
Hardy-Weinberg-jämvikt av alleler på individ loci bedömdes genom chi-kvadrat statistik. Statistiskt signifikanta skillnader bestämdes med Students t
test chi-kvadrat eller Fisher exakta test, två tailed. En sannolikhet (p) värde < 0,05 ansågs som statistiskt signifikant. Oddskvot (OR) med 95% konfidensintervall (CI) beräknades med hjälp av programmet Epi-Info 2000 (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Tre analyser genomfördes, en där alla fall och kontroller ingick en andra i vilka fall jämfördes endast med H. pylori
+ kontroller och en tredje analys där populationsbaserade kontroller matchas med 5-års ålder och kön med cancerfallen.
Resultat
studiegrupper egenskaper och H. pylori
status
fördelningen av genotyper enligt histologiska fynd visas i tabell 1.Table en genotyp och allel frekvenser av IL-8 251
A /T och TLR-299 Mössor och -399
loci i den icke-cancer och cancergrupper enligt histologiska fynd

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n) Review genotyp
allel
genotyp
allel
genotyp
allel
AA-delar på
TT
* A
* T
1,1
1,2
* 1
* 2 Review 1 , en
1,2
* 1
* 2 Review gastrit (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29) 4
14
11
0,38
0,62
29
0 1
0
27 2
0,97
0,03
AG + IM (23) Review 5
10
8
0,43
0,57
20
3
0,93
0,07
23
0 1
0
Magcancer (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal skriver
8 21
7
0,51
0,49
34 2
0,97
0,03
36
0
en
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age och könsmatchade (n = 189) katalog 33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0,96
0,04
179
10
0,97
0,03
PUD: magsår; AG, atrofisk gastrit; IM: intestinal metaplasi
genotyp frekvenser på individ loci studerade var i Hardy-Weinberg jämvikt, med icke-signifikanta chi-kvadrat-värden (0,58 för IL8-251
, 0,42 för TLR4 Asp299Gly Mössor och 0,17 för den TLR4 Thr399Ile
). Bland kontrollgruppen, den 80% hade kronisk gastrit (tabell 1), hade 11,2% av patienterna PUD och 8,8% av patienterna hade atrofisk gastrit och /eller intestinal metaplasi. Andelen diffus och intestinal magcancer var 1,2:. 1
Prevalensen av H. pylori
i kontrollgruppen var 73,7%. Detta liknar värdet tidigare rapporterats för denna studiepopulation [16]. Prevalensen av H. pylori
bland mag cancerpatienter var 53,8% Bedömning.
Risk för IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly Mössor och TLR4 Thr399Ile
genotyper
vi jämförde alla vissa genotyper för IL8-251
(AA, AT och TT) för TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 och 2,2) och TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 och 2,2) (tabell 1). Frekvensen hos IL8-251-delar på genotyp var högre i magsäckens cancerfall än i alla kontroller, endast H. pylori sälja positiva kontroller och ålder och kön matchade kontroller (tabell 2) .table 2 oddskvoten och 95 % konfidensintervall för analys av genotyper av distala gastriska cancerfall vs
alla kontroller icke-cancer.
vid IL8-251 * En
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
Samtliga fall vs
OR (95% CI) katalog p
OR (95% CI) katalog p
ELLER 95% CI
p
ELLER 95% CI
p
Alla kontroller (n = 259) Review 2,12 (1,1-4,2) Review 0,023
1,73 (1-3) Review 0,049
en (0,3-2,8) Review 0,82
0,25 (0,01-1,8) Review 0,2
H. pylori
+ kontroller (n = 191) Review 2,12 (1,1-4,2) katalog 0,029
1,7 (0,96-3) Review 0,068
0,91 (0,3-2,6) Review 0,95
0,24 (0-1,8) Review 0,19
Ålder och kön matchade kontroller (n = 189) Review 2,42 (1,2-4,8) Review 0,009
1,78 (1-3,2
0,035
1,04 (0,3-3,1) Review 0,86
0,23 (0-1,8) Review 0,1
Bedömning av risken för IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2 Review och TLR4 Thr399Ile * 2
alleler
Vi nästa jämfört transport av IL8-251 * A
allelen (homozygot plus heterozygot) för GC fall och alla gastrit plus normala kontroller. Vi hittade en sammanslutning av IL8 -251 * A
allelen och utvecklingen av GC (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2, p = 0,023) (tabell 2). När vi jämförde alla gastrit plus normala kontroller vs
histologiska cancertyper , risken för diffusa och intestinala mag cancertyper var liknande men inte signifikant (OR = 2,15, p = 0,08 och OR = 2,1, p = 0,13 respektive).
När vi jämförde magcancer fall med H. pylori
+ kontroller fann vi ett liknande värde (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2, p = 0,029).
Därefter jämförde vi frekvensen i magcancer gruppen withage och kön matchade kontroller och vi hittade en starkare association (OR: 2.42, 95% CI = 1,2-4,8, p = 0.0.009).
Vi hittade inte någon förening för TLR4 Asp299Gly * 2 Review och TLR4 Thr399Ile * 2
hyporeactive alleler.
Diskussioner och slutsatser
mångfald som svar på infektion med H. pylori
har tillskrivits flera faktorer. Den genetiskt reglerat immunsvar verkar spela en avgörande roll för att bestämma intensiteten av skador på den mottagande [1-3].
Flera författare har beskrivit ökad produktion av IL-8 under H. pylori
infektion. En A /T-polymorfismen vid positionen -251 i genen har associerats till en högre aktivitet av detta interleukin och nyligen, har denna allel relaterats i två studier för utveckling av magcancer i japanska befolkningen [10, 11]. I en av dessa studier IL8-251 AA
genotyp höll en högre risk för atrofisk gastrit (OR = 2,35; 95% CI = 1,12-4,94) och magcancer (OR = 2,22; 95% CI = 1.08- 4,56) jämfört med TT genotyp. De studerade 252 friska kontrollpersoner, 215 personer med atrofisk gastrit, och 396 patienter med magcancer. AA och AT genotyper var signifikant associerade med högre nivåer av IL8 protein, allvarligare neutrofila infiltration jämfört med TT genotyp. I den andra studien, var IL-8 -251
* En allel associerad med en högre risk för magcancer (OR = 2,1, 95% CI = 1,38-2,92). Våra resultat visade inget samband mellan högre GC och AA genotypen, men ett positivt samband hittades för AT genotyp och transport av åtminstone en kopia av * A-allelen (homozygot plus heterozygot). Det är anmärkningsvärt att de yttersta randområdena värde som observerats i vår studie (2,12) var ganska lik den som observerades i den japanska befolkningen (2,1).
IL-1B-31 C /T
polymorfism har associerats med utveckling av magcancer och en geografisk etnisk skillnad har beskrivits för denna locus, med en starkare association av polymorfism i västerländska än i orientalisk befolkning. Resultatet för IL-8-251
A /T-polymorfism korrelerar med tidigare data som presenteras för japanska befolkningen, visar ingen trend i geografisk eller etnisk variation.
Det är för närvarande olöst om en hyporesponsiva LPS signalväg är välgörande eller skadlig för värden. Individer med hyporeactive TLR4
polymorfismer har visat minskade nivåer av cirkulerande inflammatoriska cytokiner, en ökad risk för akut bakteriella infektioner och en trend mot ökad dödlighet. Andra nya studier stöder hypotesen att låga fungerande TLR4
polymorfismer kan leda till ett minskat inflammatoriskt svar i samband med en låg-skadande infektion som kommer att främja en ihållande infektion [17-20]. I denna studie har vi inte hittat något samband mellan GC och TLR4 polymorfismer, vilket tyder på att de inte bidrar till utvecklingen av distala magcancer. Både TLR4 Asp299Gly Mössor och Thr399Ile
polymorfismer har rapporterats i kopplingsojämvikt (LD) [21, 22], men vi bestämde oss för att genotypa båda eftersom vi inte visste om de var i LD i vår befolkning.
Sammanfattningsvis våra preliminära resultat tyder på att IL8-251
är en biologiskt rimligt sjukdomsmodifierande polymorfism. Om bekräftats i flera populationer, som det har varit på japanska, och nu mexikanska grupper, detta polymorfa stället, tillsammans med andra, kan användas för att identifiera patienter som löper större risk för GC, som kan behöva närmare övervakning.
Förklaringar
konkurrerande intressen
författare (s) förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

• Gastric Helicobacter pylori-infektion associerar med en ökad risk för kolorektala polyper i afrikanska Americans
• Fosforylerad Smad2 i framskridet stadium Gastric Carcinoma