Оценка платных-подобный рецептор 4 Asp299Gly, Thr399Ile и интерлейкина-8 -251 полиморфизмы в риске для развития дистального рака желудка

Оценка платных-подобный рецептор 4 Asp299Gly, Thr399Ile и интерлейкин-8 -251 полиморфизмы в риске для развития дистального рака желудка
Аннотация
Справочная информация
Интенсивность воспаления, вызванного Helicobacter Pylori <бр> колонизация связана с развитием дистального рака желудка (GC). Ответ принимающей H
. пилори
была связана с генетическим полиморфизмом, которые влияют как врожденные и адаптивные иммунные реакции.
Наша цель заключалась в изучении ли присутствие TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
и IL-8-251
A /T полиморфизм имел какое-либо влияние в развитии дистального GC в мексиканской популяции
Методы
Мы изучили 337 пациентов, которые были разделены на две группы:. 78 пациентов с гистологически подтвержденным дистального GC и 259 нераковых управления. Наличие хеликобактерной
в контрольной популяции определялась положительными результатами, по меньшей мере, двух из четырех диагностических тестов: серологические, гистология, быстрый уреазный тест и культуры. ДНК человек был очищен и генотипирование для TLR4 Asp299Gly
полиморфизма пиросеквенирования, для TLR4 Thr399Ile
помощью ПЦР-ПДРФ и IL8-251
системой амплификации огнеупорный мутации (ARMS)
-PCR. Результаты
Контрольная группа без рака было установлено, что в Харди-Вайнберга в полиморфных локусов (хи-квадрат <суб> HW = 0,58 для IL8-251
, 0,42 для TLR4 Asp299Gly
и 0,17 для TLR4 Thr399Ile
). Частоты мутированные аллели (гомозиготных плюс гетерозиготных) были сопоставлены между случаями и контролем. Мы не обнаружили существенной разницы для TLR4- Asp299Gly
[на 7,7% дистальных пациентов GC и 7,7% контроля нераковых (р = 0,82)] и для TLR4 Thr399Ile
[1,3% пациентов GC и в 5 % населения контрольной (р = 0,2)]. В противоположность этому, IL-8-251
A /T, 80,77% пациентов GC и 66,4% в контрольной группе возраста и соответствующего пола имели по крайней мере одну копию мутантного аллеля (OR = 2,12, 95% CI = 1.1-4.2) (р = 0,023).
Заключение
это исследование показало, что IL8-251 * A
аллель может быть связано с развитием дистального рака желудка в этом мексиканского населения.
Справочная информация
хеликобактерной
почти исключительно колонизировать слизистую слой желудка человека и проживать в хозяине в течение многих лет, десятилетий или, возможно, на протяжении всей жизни. Приблизительно в 10% случаев, организм связан с различными клиническими результатами, включая неязвенной диспепсии, язвенная болезнь, и дистального рака желудка [1].
Хозяина и факторы окружающей среды были связаны с этим клиническим разнообразием. Хост факторов, главным образом связаны с признанием бактерий иммунной системой и изменением уровня цитокинового ответа [2, 3].
Признание патогенов опосредуется множеством зародышевых закодированные рецепторов, которые упоминаются как рецепторы распознавания образов (РРСС). Эти рецепторы распознают законсервированы молекулярные модели, которые являются общими для больших групп микроорганизмов. Важным является ПРР Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), трансмембранный рецептор, который распознает ряд лигандов, в том числе и липополисахарида (LPS), который находится в клеточной стенке грамотрицательных бактерий, таких как H. пилори
[3 ]. Два одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) в TLR4
гена, АСП-299 → Gly и Thr-399 → Ile переходов, было показано, что приведет к hyporesponsiveness к LPS, пониженной плотности эпителиальной TLR4 и снижение воспалительной реакции цитокина на LPS [ ,,,0],4]. Кроме того, генетические варианты цитокинов также являются критическими для воспалительной реакции, а также несколько генов из разных путей, были связаны с раком желудка, в том числе интерлейкин (IL), -1B
, ФНО
, ИЛ-10 и
IL-8
[5-7].
IL-8 цитокина функционирует в качестве мощного хемокина для нейтрофилов и лимфоцитов. Сообщалось, что уровни IL-8 увеличилось в 10 раз в желудочном образцов рака, по сравнению с нормальными тканями желудка. Хорошо характеризуется SNP T /A в -251 локуса был описан и ассоциируется с более высоким IL-8 производства и ряда заболеваний [8-11].
Нашей целью было определить, является ли TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
и в IL8-251 A /T
полиморфизмов связаны с дистального рака желудка в хорошо определенной мексиканского населения.
методов
популяции пациентов
Мы изучили 78 пациентов, не связанные с гистологически подтвержденным дистальный GC (средний возраст = 58.6y, средний возраст = 60, возрастной диапазон: 22-84, F: M = 0,56). Мы также изучили 259 пациентов без гистологического доказательства GC (средний возраст = 57.1y, средний возраст = 54, возрастной диапазон = 18-92, F: M = 1.17). Это население было описано ранее [7]. Все пациенты были включены в больнице Университарио "д-р Хосе Eleutério Гонсалеса", Автономного университета штата Нуэво-Леон. Местный комитет по этике одобрил данное исследование и письменное информированное согласие было получено от всех субъектов.
Гистопатологические исследования
Из всех пациентов контрольной группы, восемь биопсии были получены для гистологической оценки, два из малой кривизны, два из большой кривизны , два из incisura angularis, и два из prepyloric региона. Из пациентов с дистальной GC, по крайней мере, 8 биопсий были получены из опухоли для гистологической оценки. Биопсия из случаев и контроля фиксировали, парафином и окрашивали гематоксилином-эозином. Опытный патологоанатом изучили все гистологические слайды.
H. Pylori
статус
The H. Pylori
статус контрольной популяции определялась гистологии, тест быстрый уреазный (БУТ), серологические и культуры , Для БУТ, антрального биопсии анализировали с помощью проверенного некоммерческое теста [12]. Биопсию помещали в тест-пробирку, инкубировали при 37 ° С и читать в течение 24 часов. Изменение цвета от оранжевого до пурпурного показали положительный результат. Для серологического исследования, фермент, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) использовали для демонстрации присутствия IgG антител, как описано ранее [13].
Культивирование проводили на двух и двух корпусе антральном биопсий стандартными методами. Биопсии были помещены в 10% кровяной агар (Becton Dickinson, Cockeysville, MD), и инкубировали при 37 ° С в течение по меньшей мере одной недели в условиях микроаэробных. Штаммы были идентифицированы окрашиванием по Граму, оксидазы, каталазы и уреазы тестов.
Пациенты контрольной группы были рассмотрены H. Pylori
заражена, когда по крайней мере два из диагностических тестов были положительными.
Распространенность антихеликобактерной <бр> инфекция у больных раком желудка определяли по результатам гистологии.
генотипирование
геномную ДНК экстрагировали только из периферической крови фенол-хлороформ-isoamilic спирта и осаждения с помощью метода этанола. Амплификации огнеупорная система мутации (ARMS) -PCR метод был использован для генотипа IL8-251
полиморфизм, как описано ранее [14].
TLR4 Thr399Ile
полиморфизма определяли с помощью ПЦР-ПДРФ [15] и в TLR4 Asp299Gly
полиморфизм определяли методом Пиросеквенирование разработанной для этого исследования. Первоначально, ПЦР проводили с использованием праймеров F-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT TCC ACC ATG и R-КТС ТТТ CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG с обратным праймером биотинилированного. Условия ПЦР были: 94 ° С в течение 5 мин и 40 циклов при 94 ° С, 59 ° С и 72 ° С в течение 30 с каждый, и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 5 мин. Для Пиросеквенирование, биотинилированные шаблоны ПЦР иммобилизованного на покрытых стрептавидином парамагнитных Sepahrose шариков в буфере для связывания. Комплексы бусинок шаблонные отмывали погружением в 70% спирте и 0,5 М NaOH, а затем добавляли к 45 мкл буфера для отжига, содержащего 15 пмоль праймера последовательности 5'-CAT ACT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Отжиг имели место при 80 ° С в течение 2 мин. В режиме реального времени Пиросеквенирование проводили в автоматизированном 96-луночного pyrosequencer PSQ SNP 96 (Пиросеквенирование AB, Уппсала, Швеция) с использованием ферментов и субстратов, рекомендованных производителем.
Статистический анализ
Харди-Вайнберга аллелей в отдельных локусов оценивали с помощью хи-квадрат статистики. Статистически значимые различия определялись критерия Стьюдента
, хи-квадрат или точный критерий Фишера, два хвостатых. А (р) значение вероятности &л; 0,05 рассматривалось как статистически значимое. Отношение шансов (OR) с 95% доверительный интервал (ДИ) были рассчитаны с использованием программного обеспечения Epi-Info 2000 (Центр по контролю и профилактике заболеваний, Атланта, штат Джорджия.). Три исследования были выполнены, в котором были включены все случаи и средства управления, второй, в каких случаях сравнивали только с H. Pylori
+ Органы управления и третьего анализа, в котором элементы управления популяционные были сопоставимы по 5-летнего возраста групп и полов с случаев рака.

Результаты групп по изучению характеристик и состояния пилори

распределение генотипов согласно гистологических показано в таблице 1.Table 1 генотип и частоты аллели H. из ИЛ-8 251
A /T и TLR-299
и -399
локусы в непроизводственной рака и рака группы согласно гистологических
<й>
IL8-251 A /T


TLR4 Asp299Gly


TLR4Thr399Ile


Group (п)
генотип
аллеля
генотип
аллель
генотип <бр> аллель
AA
на авто TT
* A * T

1,1
1,2
* 1 * 2

1 , 1
1,2
* 1 * 2

Гастрит (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29) 4
14
11
0,38
0,62
29
0
1
0
27 страница 2 0,97
0,03
AG + IM (23) страница 5 из 10
8
0,43
0,57
20 страница 3 0,93 0,07

23
0
1
0
рак желудка (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal тип
8
21
7
0,51
0,49
34 страница 2 0,97
0.03
36
0
1
0
H. пилори
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age и соответствующего пола (n = 189)
33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0,96
0,04
179 <бр> 10
0,97
0,03
PUD: язвенная болезнь; А.Г., атрофический гастрит; IM: кишечная метаплазия
генотипа частот на индивидуальном локусов были в Харди-Вайнберга, с незначимых хи-квадрат значений (0,58 для IL8-251
, 0,42 для TLR4 Asp299Gly
и 0,17 для TLR4 Thr399Ile
). Среди контрольной группы, 80% имели хронический гастрит (таблица 1), 11,2% пациентов имели PUD и 8,8% пациентов имели атрофический гастрит и /или кишечная метаплазия. Доля диффузного и кишечного рака желудка составляет 1,2: 1.
Распространенность хеликобактерной
в контрольной группе составила 73,7%. Это аналогично значению ранее для этой популяции исследования [16]. Распространенность хеликобактерной
среди больных раком желудка составила 53,8%.
Оценка риска IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly
и TLR4 Thr399Ile
генотипы
Мы сравнили все конкретные генотипы для IL8-251
(AA, АТ и ТТ), для TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 и 2,2) и TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 и 2,2) (таблица 1). Частота IL8-251
AT генотипа была выше в желудочных случаев рака, чем у всех элементов управления, только H. Pylori
Результаты положительного контроля и по возрасту и полу контрольной группы (таблица 2) .table 2 отношения шансов и 95 % доверительные интервалы для анализа генотипы дистальных желудочных случаев рака против
все элементы управления неонкологические.
<й>
IL8-251 * A


IL8-251 на авто аукционе
TLR-299 * 2


TLR-399 * 2

Все случаи против

OR (95% ДИ)
р
OR (95% ДИ)
р
или 95% CI
р
ИЛИ 95% ДИ
р
Все элементы управления (п = 259)
2.12 (1.1-4.2)
0,023
1,73 (1-3)
0,049
1 (0.3-2.8)
0,82
0.25 (0.01-1.8)
0,2
H. пилори
+ управления (п = 191)
2.12 (1.1-4.2)
0,029
1.7 (0.96-3)
0,068
0.91 (0.3-2.6)
0,95
0.24 (0-1.8)
0,19
Возраст и пол контрольной группы (п = 189)
2.42 (1.2-4.8)
0,009
1.78 (1-3.2
0,035
1.04 (0.3-3.1)
0,86
0,23 (0-1.8)
0,1
Оценка риска IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
и TLR4 Thr399Ile * 2
аллели
Затем мы сравнивали перевозку в IL8-251 * A
аллеля (гомозиготная плюс гетерозиготных) для случаев GC и все гастрит плюс нормальным контролем. Мы нашли ассоциацию IL8 -251 * A
аллель и развитие GC (OR = 2.12, 95% CI = 1.1-4.2, р = 0,023) (таблица 2). Когда мы сравнили все гастрит плюс нормальные элементы управления VS
гистологических типов рака , риски для диффузной и кишечника желудка типов рака были похожи, но не имеет существенного значения (OR = 2,15, р = 0,08 и OR = 2,1, p = 0,13 соответственно).
Когда мы сравнили желудка случаев рака с H. Pylori <бр> + элементы управления мы нашли аналогичное значение (OR = 2,12, 95% ДИ = 1.1-4.2, р = 0,029).
Далее, мы сравнили частоту в желудочном группе рака withage и гендерной контрольной группы, и мы нашли сильная ассоциация (ОР: 2,42, 95% ДИ = 1.2-4.8, р = 0.0.009).
Мы не нашли какую-либо ассоциацию для TLR4 Asp299Gly * 2
и TLR4 Thr399Ile * 2
hyporeactive аллели.
Обсуждения и вывод
разнообразие в ответ на инфекции H.pylori,
было обусловлено несколькими факторами. Генетически регулируется иммунный ответ, кажется, играет решающую роль в определении интенсивности повреждения хозяину [1-3].
Несколько авторов описали увеличение производства IL-8 в течение H. Pylori
инфекции. А /Т полиморфизм в положении -251 в гене было связано с более высокой активностью этого интерлейкина и в последнее время, этот аллель был связан в двух исследованиях с развитием рака желудка в японской популяции [10, 11]. В одном из этих исследований, IL8-251 АА
генотип провел более высокий риск атрофический гастрит (OR = 2,35, 95% ДИ = 1.12-4.94) и рак желудка (OR = 2,22, 95% ДИ = 1.08- 4,56) по сравнению с генотипом ТТ. Они изучили 252 здоровых лиц, 215 лиц с атрофическим гастритом и 396 пациентов с раком желудка. AA и AT генотипов были связаны с более высокими уровнями IL8 белка, более тяжелой инфильтрацией нейтрофилов по сравнению с генотипом ТТ. В другом исследовании, IL-8 -251
* аллель был связан с более высоким риском рака желудка (OR = 2,1, 95% ДИ = 1.38-2.92). Наши результаты не показали никакой связи между более высоким уровнем GC и генотипом АА, но положительная связь была обнаружена для генотипа AT и перевозки по меньшей мере одной копии * аллеля (гомозиготная плюс гетерозиготном). Примечательно, что значение ОШ наблюдается в нашем исследовании (2.12) было совершенно аналогично тому, что наблюдается в японской популяции (2.1).
IL-1B-31 C /T
полиморфизм связан с развитием рака желудка и географического-этнических различий описана в этом локусе, с более сильной ассоциации полиморфизма в Occidental, чем в восточной популяции. Результаты для IL-8-251
A /T полиморфизма коррелирует с предыдущими данными, представленными для японского населения, не проявляя тенденции в географической или этнической вариации.
В настоящее время нерешенным ли гипореспонсивных LPS сигнальный путь является полезным или наносит ущерб хозяину. Лица с hyporeactive TLR4
полиморфизмов показали сниженные уровни циркулирующих провоспалительных цитокинов, повышенным риском развития острых бактериальных инфекций и тенденция к увеличению смертности. Другие недавние исследования подтверждают гипотезу о том, что низкофункционирующие TLR4
полиморфизм может привести к уменьшению воспалительного ответа, связанный с низкой повреждающих инфекции, которая будет способствовать персистирующей инфекции [17-20]. В данном исследовании мы не нашли какой-либо связи между GC и TLR4 полиморфизмом, предполагая, что они не способствуют развитию дистального рака желудка. Оба TLR4 Asp299Gly
и Thr399Ile
полиморфизмы были зарегистрированы в неравновесия по сцеплению (LD) [21, 22], но мы решили генотипу и потому, что мы не знали, если бы они были в LD в нашей популяции.
В заключение, наши предварительные результаты свидетельствуют о том, что IL8-251
является биологически правдоподобным модифицирующие заболевание полиморфизм. Если подтверждено в нескольких популяциях, как это было на японском языке, а теперь мексиканских групп, этот полиморфный сайт, в сочетании с другими, могут быть использованы для выявления пациентов с большим риском для GC, который, возможно, потребуется более тщательный контроль.
Объявления
конкурирующие интересы
автор (ы) заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

• инфекции связывает Желудочный Helicobacter Pylori с повышенным риском развития полипов в африканских Americans
• Фосфорилированные Smad2 в продвинутой стадии Желудочный Carcinoma