Vurdering av toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile og interleukin-8 -251 polymorfismer i risiko for utvikling av distal magekreft

Vurdering av toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile og interleukin-8 -251 polymorfismer i risiko for utvikling av distal magekreft
Abstract
Bakgrunn
intensiteten av betennelse forårsaket av Helicobacter pylori
kolonisering er assosiert med utvikling av distale magekreft (GC). Verten respons på H
. pylori
har vært knyttet til genetisk polymorfisme som påvirker både medfødte og ervervede immunresponser.
Vårt mål var å undersøke om tilstedeværelsen av TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile Hotell og IL-8-251
A /T polymorfismer hatt noen innflytelse på utviklingen av distal GC i en meksikansk befolkningen
Metoder
Vi studerte 337 pasienter som ble delt i to grupper:. 78 pasienter med histologisk bekreftet distal GC og 259 ikke-kreft kontroller. Tilstedeværelsen av H. pylori
i kontrollpopulasjon ble definert av positive resultatene av minst to av fire diagnostiske tester: serologi, histologiske, hurtig urease test og kultur. Menneskelig DNA ble renset og genotypet for TLR4 Asp299Gly
polymorfisme av pyrosekvensering, for TLR4 Thr399Ile
av PCR-RFLP og for IL8-251
av forsterkningen ildfast mutasjon system (armer) -PCR.
Resultater
ikke-kreft kontrollgruppen ble funnet å være i Hardy-Weinberg likevekt på polymorfe loci studert (chi-kvadrat HW = 0,58 for IL8-251
, 0,42 for TLR4 Asp299Gly Hotell og 0,17 for TLR4 Thr399Ile
). Frekvensen av muterte alleler (homozygote pluss heterozygote) ble sammenliknet mellom saker og kontroller. Vi fant ingen signifikant forskjell for TLR4- Asp299Gly product: [den 7,7% av distale GC pasienter og 7,7% ikke-kreft-kontroller (p = 0,82)] og for TLR4 Thr399Ile product: [1,3% av GC pasienter og 5 % av kontrollpopulasjonen (p = 0,2)]. I motsetning til IL-8-251
A /T, 80,77% av pasientene og GC 66,4% i kontrollgruppen alder og kjønn matchet hadde minst ett eksemplar av mutert allel (OR = 2,12, 95% CI = 01.01 til 04.02) (p = 0,023).
Konklusjon
denne studien viste at IL8-251 * A
allelet kan være relatert til utvikling av distal magekreft i denne meksikanske befolkningen.
Bakgrunn
Helicobacter pylori
nesten utelukkende kolon slimete laget av den menneskelige mage og bor i verts for år, tiår eller kanskje livslang. I ca 10% av tilfellene, er organismen forbundet med ulike kliniske resultater, inkludert ikke-ulcer dyspepsi, magesår sykdom, og distal magekreft [1].
Både vert og miljømessige faktorer har vært forbundet med denne kliniske mangfold. Vertsfaktorer er i hovedsak relatert til erkjennelse av bakterier av immunsystemet og variasjon i nivået av cytokin-reaksjon [2, 3].
Gjenkjenning av patogener er mediert av et sett av kimlinje-kodet reseptorer som er referert til som mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS). Disse reseptorene gjenkjenne konserverte molekylmønstre, som er delt av store grupper av mikroorganismer. En viktig PRR er Toll-lignende reseptor 4 (TLR4), et transmembran reseptor som gjenkjenner et utvalg av ligander, inkludert lipopolysakkarid (LPS), som finnes i celleveggen av gramnegative bakterier som H. pylori product: [3- ]. To enkle nukleotid (SNP) i det TLR4
genet, Asp-299 → Gly og Thr-399 → Ile overganger, har vist seg å føre til hyporespons LPS, redusert epitelial TLR4 tetthet og redusert inflammatorisk cytokin som respons på LPS [ ,,,0],4]. Videre genetiske varianter av cytokiner er også kritisk for den inflammatoriske respons, og flere gener fra forskjellige veier er blitt forbundet med magekreft, herunder interleukin (IL) -1B
, TNF
, IL-10 og
IL-8 product: [5-7].
IL-8 cytokin fungerer som en potent kjemotiltrekkende for nøytrofile granulocytter og lymfocytter. Det er blitt rapportert at IL-8 nivåer øket 10 ganger i magekreft prøver sammenlignet med normal gastrisk vev. Et godt karakterisert SNP T /A i -251 locus har blitt beskrevet og assosiert med høyere IL-8 produksjon og flere sykdommer [8-11].
Målet vårt var å finne ut om TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
og IL8-251 A /T
polymorfismer er forbundet med distal magekreft i en veldefinert meksikanske befolkningen
. Metoder
pasient
Vi studerte 78 urelaterte pasienter med histologisk bekreftet distal GC (gjennomsnittsalder = 58.6y, median alder = 60, aldersgruppe: 22-84, F: M = 0,56). Vi studerte også 259 pasienter uten histologiske tegn på GC (gjennomsnittsalder = 57.1y, median alder = 54, aldersgruppe = 18-92, F: M = 1,17). Denne populasjonen har blitt beskrevet tidligere [7]. Alle pasienter ble tatt på sykehuset Universitario "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León. Den lokale etisk komité godkjente studien og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag.
Histopatologiske undersøkelser
fra alle kontrollpasienter, ble åtte biopsiprøver innhentet for histologisk evaluering, to fra mindre kurvatur, to fra større krumning , to fra incisura angularis, og to fra prepyloric regionen. Fra pasienter med distal GC, ble minst 8 biopsier erholdt fra tumoren for histologisk evaluering. Biopsier fra saker og kontroller ble fikset, parafin innebygd og farget med hematoksylin-eosin. En erfaren patolog undersøkt alle histologiske lysbilder.
H. pylori
status
H. pylori
status for kontroll befolkningen ble bestemt av histologi, rask urease test (RUT), serologi og kultur . For RUT, ble en antral biopsi analysert ved hjelp av en validert ikke-kommersiell test [12]. Biopsi ble plassert i en prøvehetteglass, inkuberes ved 37 ° C og leses i løpet av 24 timer. En fargeendring fra oransje til magenta indikerte et positivt resultat. For serologi, ble en enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) som benyttes for å demonstrere tilstedeværelsen av IgG-antistoffer som tidligere beskrevet [13].
Kultur ble utført på to corpus og antrum to biopsier ved hjelp av standardmetoder. Biopsier ble plassert i 10% blod-agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) og inkubert ved 37 ° C i minst én uke etter microaerobic betingelser. Stammer ble identifisert ved Gram farging ble oksidase, katalase og urease tester kontrollpasienter
. Betraktet H. pylori
smittet når minst to av de diagnostiske testene var positive.
Utbredelsen av H. pylori
infeksjon i magekreftpasienter ble bestemt ved produktet av histologi bare genotyping
Genomisk DNA.
ble ekstrahert fra perifert blod ved fenol-kloroform-isoamilic alkohol og utfelling med etanol metode. En forsterkning ildfast mutasjon system (ARMS) -PCR metoden ble brukt til å genotype den IL8-251
polymorfisme som beskrevet tidligere [14].
TLR4 Thr399Ile
polymorfisme ble bestemt ved PCR-RFLP [15] og den TLR4 Asp299Gly
polymorfisme ble bestemt av en pyrosekvensering metode utviklet for denne studien. I første omgang ble en PCR utført med prim F-GAT TAG CAT ACT Tags ACT ACT ACC TCC ATG og R-CCC TTT CAA Tags TCA CAC TCA CCA GG med revers primer biotinylert. PCR-betingelsene var: 94 ° C i 5 minutter og 40 sykluser av 94 ° C, 59 ° C og 72 ° C i 30 sekunder hver, og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. For pyrosekvensering, ble biotinylerte PCR maler immobilisert på streptavidin-belagte paramagnetiske Sepahrose perler i bindingsbuffer. De kule-templat kompleksene ble vasket ved neddykking i 70% alkohol og 0,5 M NaOH og deretter tilsatt til 45 ul av sammensmeltningsbuffer inneholdende 15 pmol av sekvenseringsprimeren 5'-CAT ACT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Glødning fant sted ved 80 ° C i 2 min. Sanntidspyrosekvensering ble utført i en automatisert 96-brønn pyrosequencer PSQ SNP 96 (pyrosekvensering AB, Uppsala, Sverige) ved hjelp av enzymer og substrater som er anbefalt av produsenten.
Statistisk analyse
Hardy-Weinberg likevekt alleler på enkelte loci ble vurdert av chi-kvadrat statistikk. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt av Student t
test, chi-kvadrat eller Fisher eksakt test, to halet. En sannsynlighet (p) verdi < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Odds ratio (OR) med 95% konfidensintervall (CIS) ble beregnet ved hjelp av Epi-Info 2000 programvare (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Tre analyser ble utført, en der alle tilfeller og kontroller ble inkludert, en andre i hvilke tilfeller ble sammenlignet bare med H. pylori
+ kontroller og en tredje analyse der populasjonsbaserte kontroller ble matchet av 5-års alder gruppe og kjønn med krefttilfellene.
Resultater
Kollokvier egenskaper og H. pylori
status
fordeling av genotyper i henhold til histologiske funn er vist i tabell 1.Table en Genotype og allelfrekvenser av IL-8 251
A /T og TLR-299
og -399
loci i den ikke-kreft og kreft grupper i henhold til histologiske funn

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n)
genotype
allel
genotype
allel
genotype
allel
AA
AT
TT product: * A product: * T
1,1
1,2 product: * 1 product: * 2
1 , en
1,2 product: * 1 product: * 2
gastritt (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29)
4
14
11
0,38
0,62
29
0
1 0
27
2
0.97
0,03
AG + IM (23)
5
10
8
0,43
0,57
20
3
0,93
0,07
23
0
1 0
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal skriver
8
21
7
0,51
0,49
34
2
0,97
0,03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age og kjønn matchet (n = 189)
33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0,96
0,04
179
10
0,97
0,03
PUD: mavesår; AG, atrofisk gastritt; IM: intestinal metaplasi Bedrifter Den genotypefrekvensene på individnivå loci studerte var i Hardy-Weinberg likevekt, med ikke-signifikante chi-kvadrat verdier (0,58 for IL8-251
, 0,42 for TLR4 Asp299Gly Hotell og 0,17 for den TLR4 Thr399Ile
). Blant kontrollgruppen, 80% hadde kronisk gastritt (tabell 1), 11,2% av pasientene hadde PUD og 8,8% av pasientene hadde atrofisk gastritt og /eller intestinal metaplasi. Andelen diffuse og tarmmagekreft var 1,2. 1
forekomsten av H. pylori
i kontrollgruppen var 73,7%. Dette er lik den verdi som tidligere er rapportert for denne studiepopulasjonen [16]. Forekomsten av H. pylori
blant mage kreftpasienter var 53,8%.
Vurdering av risiko for IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly Hotell og TLR4 Thr399Ile
genotyper
Vi sammenlignet alle spesielle genotyper for IL8-251
(AA, AT og TT), for TLR4 Asp299Gly plakater (1,1, 1,2 og 2,2) og TLR4 Thr399Ile plakater (1,1, 1,2 og 2,2) (tabell 1). Frekvensen av IL8-251
AT genotype var høyere i magekrefttilfeller enn i alle kontroller, bare H. pylori
positive kontroller og alder og kjønn matchede kontroller (tabell 2) .table 2 Odds ratio og 95 % konfidensintervall for analyse genotypene av distale mage krefttilfeller vs
alle ikke-kreft kontroller.

IL8-251 * En
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
Alle saker vs
OR (95% CI)
p
OR (95% CI)
p
OR 95% CI
p
OR CI
95% p
Alle kontroller (n = 259)
2.12 (01.01 til 04.02)
0,023
1,73 (1-3)
0,049
1 (0,3 til 2,8)
0,82
0,25 (0,01 til 1,8)
0,2
H. pylori
+ kontroller (n = 191)
2.12 (01.01 til 04.02)
0,029
1,7 (0,96 til 3)
0,068
0,91 (0,3 til 2,6)
0,95
0,24 (0-1,8)
0,19
Alder og kjønn matchet kontroller (n = 189)
2.42 (01.02 til 04.08)
0,009
1,78 (1 til 3,2
0.035
1,04 (0,3 til 3,1)
0,86
0,23 (0-1,8)
0,1
Vurdering av risiko for IL8-251 product: * A, TLR4 Asp299Gly * 2
og TLR4 Thr399Ile * 2
lene
Vi neste forhold transport av IL8-251 * A
allelet (homozygot pluss heterozygot) for GC tilfeller og alle gastritt pluss normale kontroller. Vi fant en sammenslutning av IL8 -251 * A
allel og utvikling av GC (OR = 2,12, 95% CI = 1.1 til 4.2, p = 0,023) (tabell 2). Når vi sammenlignet alle gastritt pluss normale kontroller vs
histologiske krefttyper , risikoen for diffus og tarm magekrefttyper var like, men ikke signifikant (OR = 2,15, p = 0,08 og OR = 2,1, p = 0,13 henholdsvis).
Når vi sammenlignet magekrefttilfellene med H. pylori
+ kontroller fant vi en lignende verdi (OR = 2,12, 95% CI = 1.1 til 4.2, p = 0,029).
Deretter sammenlignet vi frekvensen i magekreft gruppe withage og kjønn matchet kontroller og vi fant en sterkere assosiasjon (OR: 2,42, 95% CI = 1.2 til 4.8, p = 0.0.009).
Vi fant ikke noen tilknytning til TLR4 Asp299Gly * 2 Hotell og TLR4 Thr399Ile * 2
hyporeactive alleler.
Diskusjoner og konklusjon
mangfold i respons på infeksjon med H. pylori
har blitt tilskrevet flere faktorer. Den genetisk regulert immunrespons synes å spille en avgjørende rolle i å bestemme intensiteten av skade på verten [1-3].
Flere forfattere har beskrevet den økte produksjon av IL-8 i løpet av H. pylori-infeksjon
. En A /T-polymorfismen ved posisjon -251 i genet har vært knyttet til en høyere aktivitet av denne interleukin og nylig har dette allel er gjengitt i to studier for utvikling av magekreft i japansk populasjon [10, 11]. I en av disse studiene var IL8-251 AA
genotype holdt en høyere risiko for atrofisk gastritt (OR = 2,35, 95%, KI = 1,12 til 4,94) og magekreft (OR = 2,22; 95% CI = 1.08- 4,56) sammenlignet med TT genotype. De studerte 252 friske kontroller, 215 personer med atrofisk gastritt, og 396 pasienter med magekreft. AA og AT genotyper var signifikant assosiert med høyere nivåer av IL8 protein, mer alvorlig nøytrofile infiltrasjon i forhold til TT genotype. I den andre studien ble IL-8 -251 product: * A-allelet knyttet til en høyere risiko for magekreft (OR = 2.1, 95% CI = 1,38 til 2,92). Våre resultater viste ingen sammenheng mellom høyere forekomst av GC og AA genotype, men en positiv sammenheng ble funnet for AT genotype og transport av minst ett eksemplar av * En allelet (homozygot pluss heterozygot). Det er bemerkelsesverdig at ORS verdien observert i vår studie (2,12) var ganske lik den som ble observert i den japanske befolkningen (2,1).
IL-1B-31 C /T
polymorfisme har vært assosiert med utvikling av magekreft og en geografisk-etnisk forskjell er blitt beskrevet for dette locus, med en sterkere assosiasjon av polymorfisme i occidental enn i orientalsk befolkningen. Resultatene for IL-8-251
A /T polymorfisme korrelerer med tidligere data presentert for japanske befolkningen, viser ingen trend i geografisk eller etnisk variasjon.
Det er foreløpig uavklart om en hyporesponsive LPS signalveien er gunstig eller skadelig for verten. Personer med den hyporeactive TLR4
polymorfismer har vist reduserte nivåer av sirkulerende inflammatoriske cytokiner, en økt risiko for akutte bakterielle infeksjoner og en trend mot økt dødelighet. Andre nyere studier støtter hypotesen om at de lave fungerende TLR4
polymorfismer kan resultere i en redusert inflammatorisk respons forbundet med en lav-ødeleggende infeksjon som vil fremme en vedvarende infeksjon [17-20]. I denne studien fant vi ikke noen sammenheng mellom GC og TLR4 polymorfismer, noe som tyder på at de ikke bidrar til utvikling av distal magekreft. Både TLR4 Asp299Gly Hotell og Thr399Ile
polymorfismer har blitt rapportert i koblingsulikevekt (LD) [21, 22], men vi bestemte oss for å genotype både fordi vi ikke visste om de var i LD i vår befolkning.
i konklusjonen, våre foreløpige resultatene tyder på at IL8-251
er en biologisk plausibel sykdomsmodifiserende polymorfisme. Hvis bekreftet i flere bestander, som det har vært på japansk, og nå meksikanske grupper, dette polymorfe stedet, sammen med andre, kan brukes til å identifisere pasienter med større risiko for GC, som kanskje trenger tettere oppfølging.
Erklæringer
konkurrerende interesser
forfatteren (e) erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Gastric Helicobacter pylori infeksjon forbinder med en økt risiko for kolorektale polypper i afrikansk Americans
• Fosforylert Smad2 i avansert stadium Gastric Carcinoma