Beoordeling van de toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile en interleukine-8 -251 polymorfismen van het risico op het ontwikkelen van distale maagkanker

Beoordeling van de toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile en interleukine-8 -251 polymorfismen in het risico voor de ontwikkeling van de distale maagkanker
Abstracte achtergrond
De intensiteit van de ontsteking veroorzaakt door Helicobacter pylori
kolonisatie wordt geassocieerd met de ontwikkeling van distale maagkanker (GC). De gastheer respons op H
. pylori
is gerelateerd aan genetische polymorfismen die zowel aangeboren en adaptieve immuunsysteem beïnvloeden.
Ons doel was om te onderzoeken of de aanwezigheid van de TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile Kopen en IL-8-251
a /T polymorfisme invloed had op de ontwikkeling van het distale GC in een Mexicaanse populatie
Methods
We bestudeerden 337 patiënten die werden verdeeld in twee groepen:. 78 patiënten met histologisch bevestigde distale GC en 259 niet-kanker controles. De aanwezigheid van H. pylori
in de controlepopulatie werd bepaald door positieve resultaten van ten minste twee van vier kenmerkende tests: serologie, histologie, snelle ureasetest en cultuur. Menselijk DNA werd gezuiverd en gegenotypeerd voor TLR4 Asp299Gly
polymorfisme door Pyrosequencing, voor TLR4 Thr399Ile
door PCR-RFLP en voor IL8-251
door de versterking vuurvaste mutatie systeem (ARMS) -PCR.
Results
de niet-kanker controle groep bleek te zijn in Hardy-Weinberg-evenwicht in de polymorfe loci onderzocht (chi-kwadraat HW = 0,58 voor IL8-251
, 0,42 voor TLR4 Asp299Gly Kopen en 0,17 voor TLR4 Thr399Ile
). De frequenties van gemuteerde allelen (homozygote plus heterozygoot) werden vergeleken tussen patiënten en controles. We vonden geen significant verschil voor TLR4- Asp299Gly
[de 7,7% van de distale GC patiënten en 7,7% niet-kanker controles (p = 0,82)] en voor TLR4 Thr399Ile
[de 1,3% van de GC de patiënten en de 5 % van de controlepopulatie (p = 0,2)]. In tegenstelling tot IL-8-251
A /T, 80,77% van de GC patiënten en 66,4% in de controlegroep leeftijd en geslacht gepaard minstens één kopie van gemuteerde allel (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2) (p = 0,023).
Conclusie
deze studie toonde aan dat de IL8-251 * A
allel kan worden gerelateerd aan de ontwikkeling van distale maagkanker in deze Mexicaanse populatie.
Achtergrond
Helicobacter pylori
bijna uitsluitend koloniseren de slijmlaag van de menselijke maag en wonen in het gastland voor de komende jaren, decennia of misschien levenslang. Bij ongeveer 10% van de gevallen wordt het organisme geassocieerd met verschillende klinische resultaten, met inbegrip van niet-ulcer dyspepsie, maagzweer en distale maagkanker [1].
Zowel gastheer als omgevingsfactoren zijn geassocieerd met deze klinische diversiteit. Host factoren hebben voornamelijk betrekking op de erkenning van de bacteriën door het immuunsysteem en de variatie in het niveau van cytokine reactie [2, 3].
Erkenning van ziekteverwekkers wordt gemedieerd door een set-kiemlijn gecodeerde receptoren die worden aangeduid als patroonherkenning receptoren (PRRS). Deze receptoren herkennen geconserveerde moleculaire patronen, die gemeenschappelijk zijn aan grote groepen micro-organismen. Belangrijk is PRR Toll-like receptor 4 (TLR4), een transmembraan receptor die verschillende liganden herkent, waaronder lipopolysaccharide (LPS), die is gevonden in de celwand van Gram-negatieve bacteriën zoals H. pylori
[3 ]. Twee single nucleotide polymorphisms (SNPs) in het TLR4-gen
, Asp-299 en → Gly Thr-399 → Ile overgangen, is aangetoond dat leidt tot hyporesponsiviteit op LPS verlaagde epitheliale TLR4 dichtheid en verminderde inflammatoire cytokine respons op LPS [ ,,,0],4]. Bovendien genetische varianten van cytokinen zijn ook kritisch voor de ontstekingsreactie en verscheidene genen van verschillende routes zijn geassocieerd met maagkanker, waaronder interleukine (IL) -1B
TNF
, IL-10 Kopen en IL-8
[5-7].
IL-8 cytokine functioneert als een krachtige chemoattractant voor neutrofielen en lymfocyten. Er is gerapporteerd dat IL-8 niveaus verhoogd 10-voudig in maagkanker monsters in vergelijking met een normale gastrische weefsels. Een goed gekarakteriseerd SNP T /A in de -251 locus is beschreven en geassocieerd met hogere IL-8 productie en andere ziekten [8-11].
Ons doel was te bepalen of de TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile Kopen en IL8-251 de a /T
polymorfismen zijn geassocieerd met distale maagkanker in een welbepaalde Mexicaanse populatie.
Methods
Patiëntenpopulatie
We bestudeerden 78 verbonden patiënten met histologisch bevestigde distale GC (gemiddelde leeftijd = 58.6y, gemiddelde leeftijd = 60, leeftijd: 22-84, F: M = 0,56). We bestudeerden ook 259 patiënten zonder histologisch bewijs van GC (gemiddelde leeftijd = 57.1y, gemiddelde leeftijd = 54, leeftijd = 18-92, F: M = 1.17). Deze populatie is eerder beschreven [7]. Alle patiënten werden ingeschreven bij het Hospital Universitario "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León. De lokale ethische commissie keurt de studie en schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vakken.
Histopathologisch onderzoek
van alle controle patiënten, acht biopten werden verkregen voor histologisch onderzoek, twee uit de mindere kromming, twee van de grotere kromming twee van de incisura angularis en twee uit de prepyloric regio. Van patiënten met distale GC werden ten minste 8 biopsieën verkregen uit de tumor voor histologische evaluatie. Biopten van patiënten en controles werden vastgesteld, in paraffine ingebedde en gekleurd met hematoxiline-eosine. Een ervaren patholoog onderzocht alle histologische coupes.
H. pylori
statuut
De H. pylori
status van de controle populatie werd bepaald door histologie, de snelle urease-test (RUT), serologie en cultuur . Voor de RUT, werd een biopsie antrale geanalyseerd door een gevalideerde niet-commerciële proef [12]. De biopsie werd in een test flesje, geïncubeerd bij 37 ° C en binnen 24 uur gelezen. Een kleurverandering van oranje naar magenta wees op een positief resultaat. Voor serologie, een enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) werd gebruikt om de aanwezigheid van IgG-antilichamen aantonen zoals eerder beschreven [13].
Kweek werd uitgevoerd op twee corpus en antrum twee biopten met standaardmethoden. Biopsieën in 10% agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) geplaatst en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende ten minste één week onder microaerobic omstandigheden. Stammen werden geïdentificeerd door Gram kleuring werden oxidase, catalase en urease testen.
Controle patiënten beschouwd H. pylori
geïnfecteerd wanneer ten minste twee van de diagnostische tests waren positief. Ondernemingen De prevalentie van H. pylori
infectie bij maagkankerpatiënten werd bepaald door het resultaat van histologie alleen.
Genotypering
Genomisch DNA werd geëxtraheerd uit perifeer bloed door het fenol-chloroform-isoamilic alcohol en precipitatie met ethanol methode. Een vuurvaste amplificatie mutatiesysteem (ARMS) -PCR werd gebruikt om de IL8-251
genotype polymorfisme zoals eerder beschreven [14].
TLR4 Thr399Ile
polymorfisme werd bepaald door PCR-RFLP [15] en de TLR4 Asp299Gly
polymorfisme werd bepaald door een pyrosequentiebepaling werkwijze ontwikkeld voor deze studie. In eerste instantie een PCR werd uitgevoerd met de primers F-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT ACC TCC ATG en R-CCC TTT CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG met de reverse primer gebiotinyleerd. De PCR-omstandigheden waren: 94 ° C gedurende 5 minuten en 40 cycli van 94 ° C, 59 ° C en 72 ° C gedurende 30 s elk, en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 5 minuten. Voor pyrosequencing werden gebiotinyleerd PCR templates geïmmobiliseerd op met streptavidine beklede paramagnetische parels Sepahrose in bindingsbuffer. De kraal-sjabloon complexen werden gewassen door onderdompeling in 70% alcohol en 0,5 M NaOH en vervolgens toegevoegd aan 45 pl hybridisatie buffer die 15 pmol van de primer sequentie 5'-CAT TAG ACT ACT ACT ACC TC 3 '. Annealing vond plaats bij 80 ° C gedurende 2 minuten. Real-time pyrosequencing werd uitgevoerd in een geautomatiseerde 96-wells pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyrosequencing AB, Uppsala, Zweden) onder toepassing van enzymen en substraten aanbevolen door de fabrikant.
Statistische analyse
Hardy-Weinberg evenwicht van allelen van afzonderlijke loci werd bepaald door chi-kwadraat statistiek. Statistisch significante verschillen werden bepaald door Student's t
test, chi-kwadraat of Fisher exact test, tweezijdige. Een waarschijnlijkheid (p) de waarde < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Odds ratio (OR) met 95% betrouwbaarheidsintervallen (CI's) werden berekend met behulp van de Epi-Info 2000-software (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Drie analyses werden uitgevoerd, één waarin alle gevallen en controles werden opgenomen, een tweede in welke gevallen werden vergeleken alleen met H. pylori
+ controls en een derde analyse waarin de bevolking op basis van controles werden geëvenaard door 5-jarigen en geslacht van de gevallen van kanker.
Resultaten
Study groepen kenmerken en H. pylori-status

de verdeling van genotypen volgens histologische bevindingen op Tabel 1.Table 1 Genotype getoond en allel frequenties van de IL-8 251
A /T en TLR-299 Kopen en -399
loci in de niet-kanker en kanker groepen volgens histologische bevindingen

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n)
genotype
allel
genotype
allel
genotype
allel
AA op
TT
* A * T

1,1
1,2
* 1
* 2
1 , 1
1,2
* 1
* 2
Gastritis (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29) verhuur 4
14
11
0.38
0.62
29
0 1
0
27 2
0.97
0.03
AG + IM (23)
5
10

• Gastric Helicobacter pylori-infectie associeert met een verhoogd risico op colorectale poliepen in de Afrikaanse Americans
• Gefosforyleerd Smad2 in vergevorderd stadium Gastric Carcinoma