Die Beurteilung der Toll-like-Rezeptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile und Interleukin-8 -251 Polymorphismen im Risiko für die Entwicklung von distalen Magen cancer

Beurteilung des Toll-like-Rezeptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile und Interleukin-8 -251 Polymorphismen im Risiko für die Entwicklung des distalen Magenkrebs
Zusammenfassung
hintergrund und die Intensität des durch Helicobacter pylori
Kolonisierung induzierte Entzündung wird mit der Entwicklung der distalen Magenkrebs (GC) verbunden ist. Die Host-Reaktion auf H
. pylori
hat zu genetischen Polymorphismen in Zusammenhang gebracht, die sowohl angeborenen und adaptiven Immunantwort beeinflussen.
Unser Ziel war es, ob die Anwesenheit des TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
und IL-8-251 zu untersuchen
A /T-Polymorphismen hatte keinen Einfluss auf die Entwicklung des distalen GC in einer mexikanischen Bevölkerung
Methoden kaufen Wir 337 Patienten untersucht, die in zwei Gruppen eingeteilt:. 78 Patienten mit histologisch bestätigten distalen GC und 259 nicht-Krebs Kontrollen. Serologie, Histologie, Urease-Schnelltest und Kultur: Die Anwesenheit von H. pylori
in der Kontrollpopulation wurde durch positive Ergebnisse von mindestens zwei der vier diagnostischen Tests definiert. Menschliche DNA wurde gereinigt und für TLR4 Asp299Gly
Polymorphismus genotypisiert von Pyrosequenzierung, für TLR4 Thr399Ile und Videos PCR-RFLP und für IL8-251
durch die Amplification Refractory Mutation System (ARMS) -PCR.
Ergebnisse
die nicht-Krebs-Kontrollgruppe wurde festgestellt, an der polymorphen Loci in Hardy-Weinberg-Gleichgewicht zu unter (Chi-Quadrat HW = 0,58 für IL8-251
, 0,42 für TLR4 Asp299Gly
und 0,17 für TLR4 Thr399Ile
). Die Frequenzen von mutierten Allelen (homozygot und heterozygot) wurden zwischen Fällen und Kontrollen verglichen. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied für TLR4- Asp299Gly
[die 7,7% des distalen GC-Patienten und 7,7% Nicht-Krebs-Kontrollen (p = 0,82)] und für TLR4 Thr399Ile
[die 1,3% der GC-Patienten und die 5 % der Kontrollgruppe (p = 0,2)]. Im Gegensatz dazu ist für IL-8-251
A /T, 80,77% der GC-Patienten und 66,4% in der Kontrollgruppe nach Alter und Geschlecht abgestimmt hatten mindestens eine Kopie des mutierten Allels (OR = 2.12, 95% CI = 1,1-4,2) (p = 0,023).
Fazit
diese Studie zeigte, dass die IL8-251 * A
Allel zur Entwicklung des distalen Magenkrebs in dieser mexikanischen Bevölkerung zusammenhängen könnte.
Hintergrund Helicobacter pylori
fast ausschließlich die Schleimschicht des menschlichen Magens kolonisieren und sich in den Host für die Jahre, Jahrzehnte oder vielleicht lebenslang. In etwa 10% der Fälle wird der Organismus mit verschiedenen klinischen Ergebnisse verbunden sind, einschließlich nicht-Geschwür Dyspepsie, Magengeschwüre und Magenkrebs distalen [1].
Beide Gastgeber und Umweltfaktoren haben mit dieser klinischen Vielfalt in Verbindung gebracht worden. Wirtsfaktoren sind vor allem auf die Anerkennung der Bakterien durch das Immunsystem und die Variation in der Ebene der Zytokinantwort im Zusammenhang mit [2, 3].
Erkennung von Krankheitserregern durch eine Reihe von Keimbahn-kodierten Rezeptoren vermittelt wird, die als bezeichnet werden Mustererkennungsrezeptoren (PRR). Diese Rezeptoren erkennen molekulare Muster konserviert, die durch große Gruppen von Mikroorganismen gemeinsam genutzt werden. Ein wichtiger PRR ist Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4), ein Transmembranrezeptor, der eine Reihe von Liganden, einschließlich Lipopolysaccharide (LPS) erkennt, die in der Zellwand von Gram-negative Bakterien, wie H. pylori
[3 gefunden ]. Zwei Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in der TLR4
Gen, Asp-299 → Gly und Thr-399 → Ile Übergänge wurden zu hyporesponsive zu LPS zu führen gezeigt, reduziert epithelialen TLR4 Dichte und reduziert inflammatorische Zytokin Reaktion auf LPS [ ,,,0],4]. Darüber hinaus sind genetische Varianten von Zytokinen auch kritisch für die Entzündungsreaktion und mehrere Gene aus verschiedenen Bahnen wurden mit Magenkrebs in Verbindung gebracht worden, einschließlich Interleukin (IL) -1B
, TNF
, IL-10 und
IL-8
[5-7].
IL-8 Zytokin fungiert als potente chemische Lockstoffe für Neutrophile und Lymphozyten. Es wurde berichtet, dass IL-8 Ebenen 10fach in Magenkrebs Proben erhöht, wenn verglichen mit normalem Magengewebe. Eine gut charakterisierte SNP T /A in der -251-Locus wurde mit höheren IL-8-Produktion und mehrere Krankheiten beschrieben und in Verbindung gebracht worden [8-11].
Unser Ziel war es, ob der TLR4 Asp299Gly
, um zu bestimmen, TLR4 Thr399Ile
und die IL8-251 A /T
Polymorphismen sind mit distalen Magenkrebs in einem wohldefinierten mexikanischen Bevölkerung in Verbindung gebracht.
Methoden
Patientenpopulation kaufen Wir 78 mit histologisch nicht verwandten Patienten untersucht bestätigt distalen GC (mittleres Alter = 58.6y, Durchschnittsalter = 60, Altersgruppe: 22-84, F: M = 0,56). Wir untersuchten auch 259 Patienten ohne histologische Nachweis von GC (Durchschnittsalter = 57.1y, Durchschnittsalter = 54, Alter range = 18-92, F: M = 1.17). Diese Population wurde bereits beschrieben [7]. Alle Patienten wurden am Hospital Universitario "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León eingeschrieben. Die lokale Ethikkommission genehmigte die Studie und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Probanden erhalten.
Histopathologische Untersuchungen
allen Kontrollpatienten, acht Biopsien für die histologische Auswertung erhalten wurden, zwei aus der geringeren Krümmung, zwei von der größeren Krümmung zwei von den incisura angularis und zwei aus der präpylorischen Region. Von Patienten mit distalen GC mindestens 8 Biopsien wurden aus dem Tumor zur histologischen Auswertung erhalten. Biopsien von Fällen und Kontrollen wurden fixierte, in Paraffin eingebettet und gefärbt mit Hematoxilin-Eosin. Ein erfahrener Pathologen untersucht, die alle histologischen Schnitten.
H. pylori
Status
Die H. pylori
Status der Kontrollpopulation durch Histologie, die schnelle Urease-Test (RUT), Serologie und Kultur bestimmt wurde . Für die RUT wurde eine antral Biopsie mit einer validierten nicht kommerziellen Test analysiert [12]. Die Biopsie wurde in einem Testfläschchen bei 37 ° C inkubiert gebracht und innerhalb von 24 h zu lesen. Ein Farbumschlag von orange nach Magenta zeigte ein positives Ergebnis. Für die Serologie ein enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wurde verwendet, um die Anwesenheit von IgG-Antikörper nachzuweisen, wie zuvor beschrieben [13].
Kultur auf zwei Korpus und Antrum zwei Biopsien nach Standardverfahren durchgeführt wurde. Biopsien wurden in 10% Blut-Agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) und bei 37 ° C für mindestens eine Woche unter mikroaeroben Bedingungen gegeben. Die Stämme wurden identifiziert durch Gram-Färbung, Oxidase, Katalase und Urease-Tests.
Kontrollpatienten wurden als H. pylori infiziert
, wenn mindestens zwei der diagnostischen Tests positiv waren. Die Prävalenz von H. pylori

Infektion bei Patienten Magenkrebs wurde erst. durch das Ergebnis der Histologie bestimmt
Genotyping
Genomische DNA aus peripherem Blut durch die Phenol-Chloroform-isoamilic Alkohol und Präzipitation mit Ethanol Methode extrahiert wurde. Eine Amplification Refractory Mutation System (ARMS) wurde -PCR Methode vorher die IL8-251
Polymorphismus, wie Genotyp verwendet [14].
Die TLR4 Thr399Ile
Polymorphismus von PCR-RFLP bestimmt wurde [15] und die TLR4 Asp299Gly
Polymorphismus wurde durch eine Pyrosequenzierung Methode für diese Studie entwickelt, bestimmt. Zunächst wurde eine PCR mit den Primern F-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT ACC TCC ATG und R-CCC TTT CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG mit dem Rückwärtsprimer biotinyliert durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren: 94 ° C für 5 min und 40 Zyklen von 94 ° C, 59 ° C und 72 ° C für 30 s jeweils und eine abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min. in Bindungspuffer Für Pyrosequenzierung wurden biotinylierte PCR-Matrizen auf Streptavidin-beschichteten paramagnetischen Sepahrose Kügelchen immobilisiert. Die Wulst-Template-Komplexe wurden durch Eintauchen in 70% Alkohol und 0,5 M NaOH gewaschen und dann zu 45 &mgr; l Annealing-Puffer, der 15 pmol des Sequenzierungsprimers 5'-CAT TAT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Das Tempern erfolgte bei 80 ° C für 2 min. Real-time Pyrosequenzierung wurde in einem automatisierten 96-Well-pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyrosequencing AB, Uppsala, Schweden) mit Hilfe von Enzymen und Substraten vom Hersteller empfohlen.
Statistische Analyse
Hardy-Weinberg-Gleichgewicht von Allelen an einzelnen Loci durchgeführt wurde von Chi-Quadrat-Statistiken bewertet. Statistisch signifikante Unterschiede wurden durch den Student-t
Test, Chi-Quadrat oder Fisher-Exact-Test bestimmt, zwei tailed. Eine Wahrscheinlichkeit (p) Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Odds Ratios (OR) mit 95% Konfidenzintervall (CI) wurden berechnet, um die Epi-Info 2000 Software (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Drei Analysen wurden durchgeführt, in der alle Fälle und Kontrollen enthalten waren, eine zweite, in welchen Fällen wurden im Vergleich nur mit H. pylori
+ Kontrollen und eine dritte Analyse, in der die populationsbasierte Kontrollen, die von 5-Jahres-Alter angepasst wurden Gruppe und Geschlecht mit den Krebsfällen.
Ergebnisse | Studiengruppen Merkmale und H. pylori
Status
Die Verteilung der Genotypen zu histologischen Befunde nach auf Tabelle 1.Table 1 Genotype und Allelfrequenzen gezeigt wird von die IL-8 251
A /T und TLR-299
und -399
Loci in der nicht-Krebs und Krebs Gruppen nach histologischen Befunde

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Gruppe (n)
Genotyp
Allel
Genotyp
Allel
Genotyp
Allel
AA
AT
TT
* A * T

1,1
1,2
* 1 | * 2
1 1,
1,2
* 1 | * 2
Gastritis (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29)
4 14
11
0,38
0,62
29
0 seite 1 0
27
2 0,97
0,03
AG + IM (23)
5 10
8
0,43
0,57
20
3
0,93
0,07
23
0 seite 1 0
Magenkrebs (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal Typ
8 21
7
0,51
0,49
34 2
0,97
0,03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age und Geschlecht angepasst (n = 189)
33
87
69
0.4
0.6
175
14
0,96
0,04
179
10
0,97
0,03
PUD: Ulkuskrankheit; AG, atrophische Gastritis; IM: intestinale Metaplasie
Der Genotyp Frequenzen an den einzelnen Loci untersucht wurden in Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, mit nicht-signifikanten Chi-Quadrat-Werte (0,58 für IL8-251
, 0,42 für TLR4 Asp299Gly
und 0,17 für die TLR4 Thr399Ile
). Unter der Kontrollgruppe, die 80% chronische Gastritis (Tabelle 1) hatten 11,2% der Patienten hatten PUD und 8,8% der Patienten hatten atrophische Gastritis und /oder intestinale Metaplasie. Der Anteil der diffusen und Darm Magenkrebs war. 1.2: 1
Die Prävalenz von H. pylori
in der Kontrollgruppe war 73,7%. Dies ist ähnlich dem Wert, der zuvor für diesen Studienpopulation berichtet [16]. Die Prävalenz von H. pylori
unter den Magenkrebs-Patienten war 53,8%.
Bewertung des Risikos von IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly
und TLR4 Thr399Ile
Genotypen
Wir verglichen alle bestimmten Genotypen für IL8-251
(AA, AT und TT), für TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 und 2,2) und TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 und 2,2) (Tabelle 1). Die Frequenz des IL8-251
AT Genotyp war höher in den Magenkrebsfälle als in allen Kontrollen, nur H. pylori positive Kontrollen und Alter und Geschlecht abgestimmte Kontrollen (Tabelle 2) .Tabelle 2 Odds Ratios
und 95 % Konfidenzintervall für die Analyse der Genotypen des distalen Magenkrebs Fällen vs
alle nicht-Krebs-Kontrollen.

IL8-251 * A
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
Alle Fälle vs
OR (95% CI)
p oder in (95% CI)
p oder in 95% CI
p oder in 95% CI
p
Alle Kontrollen (n = 259)
2,12 (1,1-4,2)
0,023
1,73 (1-3)
0.049
1 (0,3-2,8)
0,82
0,25 (0,01-1,8)
0.2
H. pylori
+ Kontrollen (n = 191)
2,12 (1,1-4,2)
0,029
1,7 (0,96-3)
0.068
0,91 (0,3-2,6)
0,95
0,24 (0-1,8)
0,19
Alter und Geschlecht Kontrollen angepasst (n = 189)
2,42 (1,2-4,8)
0,009
1,78 (1-3,2
0,035
1,04 (0,3-3,1)
0,86
0,23 (0-1,8)
0.1
Bewertung des Risikos von IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
und TLR4 Thr399Ile * 2
Allele kaufen Wir als nächstes den Wagen des IL8-251 verglichen * A
Allel (homozygot und heterozygot) für die GC-Fälle und alle Gastritis und normalen Kontrollen. Wir fanden eine Assoziation des IL8 -251 * A
Allel und die Entwicklung von GC (OR = 2.12, 95% CI = 1,1-4,2, p = 0,023) (Tabelle 2). Wenn wir alle Gastritis und normalen Kontrollen vs
histologischen Krebsarten im Vergleich , die Risiken für die diffuse und Darm-Magen-Krebs-Typen waren ähnlich, aber nicht signifikant (OR = 2,15, p = 0,08 und OR = 2,1, p = 0,13 beziehungsweise).
Wenn wir die Magenkrebsfälle mit der H. pylori verglichen
+ Kontrollen fanden wir einen ähnlichen Wert (OR = 2.12, 95% CI = 1,1-4,2, p = 0,029).
Als nächstes verglichen wir die Frequenz in der withage Magenkrebs Gruppe und Geschlecht abgestimmte Kontrollen und wir fanden ein stärkere Assoziation (OR: 2,42, 95% CI = 1,2-4,8, p = 0.0.009).
Wir fanden keine Assoziation für TLR4 Asp299Gly * 2
und TLR4 Thr399Ile * 2
hyporeactive Allele.
Diskussionen und den Abschluss
die Vielfalt in Reaktion auf die Infektion durch H. pylori
hat auf mehrere Faktoren zurückzuführen ist. Die genetisch regulierte Immunantwort scheint bei der Bestimmung der Intensität der Schäden an den Host [1-3] eine entscheidende Rolle zu spielen.
Mehrere Autoren die erhöhte Produktion von IL-8 beschrieben wurden während H. pylori
Infektion. Ein A /T-Polymorphismus an der Position -251 in dem Gen zu einer höheren Aktivität dieses interleukin und vor kurzem in Verbindung gebracht worden, dieses Allel in zwei Studien zur Entwicklung von Magenkrebs in der japanischen Bevölkerung [10, 11], bezogen ist. In einer dieser Studien, die IL8-251 AA
Genotyp ein höheres Risiko für atrophische Gastritis gehalten (OR = 2,35; 95% CI = 1,12-4,94) und Magenkrebs (OR = 2,22; 95% CI = 1.08- 4,56) im Vergleich mit dem TT-Genotyp. Sie untersuchten 252 gesunden Kontrollen, 215 Personen mit atrophischer Gastritis, und 396 Patienten mit Magenkrebs. Die AA und AT-Genotypen waren signifikant mit höheren IL8 Protein, schwereren Neutrophilen-Infiltration im Vergleich mit dem TT-Genotyp assoziiert. In der anderen Studie, die IL-8 -251
* A-Allel wurde zu einem höheren Risiko von Magenkrebs (OR = 2,1, 95% CI = 1,38-2,92). Unsere Ergebnisse zeigten keinen Zusammenhang zwischen höheren Raten von GC und dem AA-Genotyp, sondern eine positive Assoziation wurde für den AT-Genotyp und der Beförderung von mindestens einer Kopie des * A-Allel (homozygot und heterozygot) gefunden. Es ist bemerkenswert, dass die RUP Wert in unserer Studie beobachtet (2,12) war ganz ähnlich wie die in der japanischen Bevölkerung beobachtet (2.1).
Die IL-1B-31 C /T
Polymorphismus wurde mit der Entwicklung in Verbindung gebracht worden von Magenkrebs und einer geografischen ethnischen Unterschied wurde für diesen Ort, mit einer stärkeren Assoziation des Polymorphismus in der abendländischen als in der orientalischen Bevölkerung beschrieben. Die Ergebnisse für das IL-8-251
A /T-Polymorphismus mit früheren Daten korrelieren für japanische Bevölkerung präsentiert, in geografischen oder ethnischen Variation keine Tendenz.
Es ist derzeit ungeklärt, ob ein hyporesponsive LPS-Signalweg ist von Vorteil, oder schädlich für den Wirt. Personen mit dem hyporeactive TLR4
Polymorphismen haben reduzierte Mengen gezeigt inflammatorische Zytokine zirkulierender, ein erhöhtes Risiko einer akuten bakteriellen Infektionen und einem Trend zu einer erhöhten Sterblichkeit. Andere neuere Studien unterstützen die Hypothese, dass die niedrigen funktionierende TLR4
Polymorphismen in einer reduzierten Entzündungsreaktion führen kann mit einer niedrigen schädlichen Infektion assoziiert, die eine persistierende Infektion fördern [17-20]. In dieser Studie finden wir keinen Zusammenhang zwischen GC und TLR4-Polymorphismen, was darauf hindeutet, sie nicht auf die Entwicklung der distalen Magenkrebs beitragen. Beide TLR4 Asp299Gly
und Thr399Ile
Polymorphismen wurden in Kopplungsungleichgewicht (LD) [21, 22] berichtet, aber wir beschlossen, sowohl Genotyp, weil wir nicht wissen, ob sie in LD in unserer Bevölkerung.
Zusammenfassend deuten unsere vorläufigen Ergebnisse, dass IL8-251
eine biologisch plausible disease modifying Polymorphismus ist. Wenn in mehreren Populationen bestätigt, wie es in der japanischen gewesen, und jetzt mexikanischen Gruppen, diese polymorphen Stelle, in Verbindung mit anderen verwendet werden könnten Patienten ein höheres Risiko für die GC zu identifizieren, die eine genauere Überwachung benötigen.
Erklärungen
konkurrierende Interessen
Autor (en) erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

• Gastric Helicobacter-pylori-Infektion assoziiert mit einem erhöhten Risiko für kolorektale Polypen in afrikanischen Americans
• Phosphorylated Smad2 im fortgeschrittenen Stadium Magenkarzinom