Vurdering af toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile og interleukin-8 -251 polymorfier i risiko for udvikling af distale gastriske cancer

Vurdering af toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile og interleukin-8 -251 polymorfier i risikoen for udvikling af distale mavekræft
Abstract
Baggrund
intensiteten af ​​inflammation fremkaldt af Helicobacter pylori
kolonisering er forbundet med udviklingen af ​​distale gastrisk cancer (GC). Værten svar til H
. pylori
er blevet relateret til genetiske polymorfier, der påvirker både medfødte og adaptive immunrespons.
Vores mål var at undersøge, om tilstedeværelsen af ​​TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
og IL-8-251
a /T polymorfier havde nogen indflydelse på udviklingen af ​​distale GC i en mexicansk befolkning
Metoder
Vi studerede 337 patienter, der blev inddelt i to grupper:. 78 patienter med histologisk bekræftet distale GC og 259 ikke-kræft kontroller. Tilstedeværelsen af ​​H. pylori
i kontrolpopulationen blev defineret ved positive resultater af mindst to af fire diagnostiske tests: serologi, histologi hurtig ureaseprøve og kultur. Humant DNA blev renset og genotype for TLR4 Asp299Gly
polymorfi ved pyrosekventering, for TLR4 Thr399Ile
ved PCR-RFLP og IL8-251
af forstærkningen ildfaste mutation-system (ARMS) -PCR.
Resultater
kontrolgruppen ikke-cancer viste sig at være i Hardy-Weinberg ligevægt ved den polymorfe loci undersøgt (chi-square HW = 0,58 for IL8-251
, 0,42 for TLR4 Asp299Gly
og 0,17 for TLR4 Thr399Ile
). Hyppigheden af ​​muterede alleler (homozygote plus heterozygote) blev sammenlignet mellem cases og kontroller. Vi fandt ingen signifikant forskel for TLR4- Asp299Gly
[den 7,7% af distale GC patienter og 7,7% ikke-kræft kontroller (p = 0,82)] og for TLR4 Thr399Ile
[1,3% af GC patienterne og de 5 % af kontrollen population (p = 0,2)]. I modsætning hertil for IL-8-251
A /T, 80.77% af GC patienter og 66,4% i kontrolgruppen alder og køn matchede havde mindst én kopi af muteret allel (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2) (p = 0,023).
Konklusion
denne undersøgelse viste, at IL8-251 * A
allel kunne relateres til udviklingen af ​​distale mavekræft i denne mexicanske befolkning.
Baggrund
Helicobacter pylori
næsten udelukkende kolonisere slimlag af den menneskelige mave og opholde sig i værten for år, årtier eller måske livslang. Hos ca. 10% af tilfældene, er organismen forbundet med forskellige kliniske resultater, herunder ikke-ulcus dyspepsi, mavesår sygdom, og distal gastrisk cancer [1].
Både vært og miljømæssige faktorer er blevet forbundet med denne kliniske diversitet. Host faktorer er hovedsageligt relateret til anerkendelse af bakterierne af immunsystemet og variation i niveauet af cytokin respons [2, 3].
Anerkendelse af patogener medieres af et sæt af kimcellelinje-kodede receptorer, der omtales som receptorer mønster-genkendelse (PRRS). Disse receptorer genkender konserverede molekylære mønstre, som er fælles for store grupper af mikroorganismer. En vigtig PRR er Toll-lignende receptor 4 (TLR4), et transmembrant receptor, der genkender en række ligander, herunder lipopolysaccharid (LPS), som findes i cellevæggen af ​​Gram-negative bakterier som H. pylori
[3 ]. To enkelt-polymorfismer (SNP'er) i TLR4
genet, Asp-299 → Gly og Thr-399 → Ile overgange, har vist sig at føre til mindre reaktivitet for LPS, reducerede epitel TLR4 densitet og reduceret inflammatorisk cytokin respons på LPS [ ,,,0],4]. Endvidere genetiske varianter af cytokiner er også kritiske for den inflammatoriske reaktion, og adskillige gener fra forskellige tilgange er blevet forbundet med gastrisk cancer, herunder interleukin (IL) -1b
, TNF
, IL-10
IL-8
[5-7].
IL-8 cytokin fungerer som en potent kemoattraktant for neutrofiler og lymfocytter. Det er blevet rapporteret, at IL-8-niveauer steg 10 gange i gastrisk cancer prøver sammenlignet med normale gastriske væv. Et godt karakteriseret SNP T /A i -251 locus er blevet beskrevet og forbundet med højere IL-8 produktion og flere sygdomme [8-11].
Vores mål var at afgøre, om TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile
og IL8-251 a /T
polymorfier er forbundet med distal gastrisk kræft i en veldefineret mexicanske befolkning.
Metoder
Patient befolkning
Vi undersøgte 78 ubeslægtede patienter med histologisk bekræftet distal GC (gennemsnitsalder = 58.6y, median alder = 60, aldersgruppe: 22-84, F: M = 0,56). Vi undersøgte også 259 patienter uden histologiske tegn på GC (gennemsnitsalder = 57.1y, median alder = 54, aldersgruppe = 18-92, F: M = 1,17). Denne population er tidligere blevet beskrevet [7]. Alle patienter blev indskrevet på hospitalet Universitario "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León. Det lokale etiske komité har godkendt undersøgelsen og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag.
Histopatologiske undersøgelser
Fra alle kontrol patienter blev otte biopsiprøver opnået for histologisk evaluering, to fra mindre krumning, to fra større krumning , to fra incisura angularis, og to fra prepyloric region. Fra patienter med distal GC blev mindst 8 biopsier opnået fra tumoren til histologisk evaluering. Biopsier fra cases og kontroller blev fastsat, paraffin indlejret og farvet med hematoxilin-eosin. En erfaren patolog undersøgt alle de histologiske objektglas.
H. pylori
status
H. pylori
status kontrolpopulationen blev bestemt ved histologi, den hurtige ureaseprøve (RUT), serologi og kultur . For RUT blev en antral biopsi analyseret af en valideret ikke-kommerciel test [12]. Den biopsi blev anbragt i en test hætteglas, inkuberet ved 37 ° C og aflæses inden 24 timer. En farveændring fra orange til magenta angivet et positivt resultat. Til serologi, blev et enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) anvendes til at påvise tilstedeværelsen af ​​IgG-antistoffer som beskrevet tidligere [13].
Kultur blev udført på to corpus og antrum to biopsier ved standardmetoder. Biopsier blev anbragt i 10% blodagar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) og inkuberet ved 37 ° C i mindst en uge under mikroaerobe betingelser. Stammer blev identificeret ved Gram farvning blev oxidase, katalase og urease tests.
Kontrolpatienter betragtes H. pylori
inficeret, når mindst to af de diagnostiske tests var positive.
Prævalensen af ​​H. pylori
infektion i mavecancerpatienter blev bestemt af resultatet af histologi kun.
Genotypning
Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifert blod ved phenol-chloroform-isoamilic alkohol og udfældning med ethanol metode. En forstærkning ildfast mutation-system (ARMS) -PCR metode blev anvendt til at genotype den IL8-251
polymorfi som tidligere beskrevet [14].
TLR4 Thr399Ile
polymorfi blev bestemt ved PCR-RFLP [15] og den TLR4 Asp299Gly
polymorfi blev bestemt ved en pyrosekventering metode udviklet til denne undersøgelse. I første omgang blev en PCR udført med primerne F-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT ACC TCC ATG og R-CCC TTT CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG med reverse primer biotinyleret. PCR-betingelserne var: 94 ° C i 5 minutter og 40 cyklusser ved 94 ° C, 59 ° C og 72 ° C i 30 s hver, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min. For pyrosekventering blev biotinylerede PCR-skabeloner immobiliseret på streptavidin-coatede paramagnetiske Sepahrose perler i bindingsbuffer. De perle-template-komplekser blev vasket ved nedsænkning i 70% alkohol og 0,5 M NaOH og derefter tilsat til 45 pi annealing buffer indeholdende 15 pmol af sekvenseringsprimeren 5'-CAT ACT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Annealing foregik ved 80 ° C i 2 min. Real-time pyrosekventering blev udført i en automatiseret 96 brønde pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyrosequencing AB, Uppsala, Sverige) ved hjælp af enzymer og substrater anbefales af producenten.
Statistisk analyse
Hardy-Weinberg ligevægt af alleler på individuelt loci blev bedømt ved chi-square statistik. Statistisk signifikante forskelle blev bestemt ved Students t
test, chi-square eller Fisher eksakt test, to sidede. En sandsynlighed (p) værdi < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Odds ratio (OR) med 95% konfidensintervaller (CIS) blev beregnet ved hjælp af Epi-Info 2000 software (Center for Disease Control og Forebyggelse, Atlanta, Ga.). Tre analyser blev udført, en, hvor alle tilfælde og kontroller blev inkluderet, en anden i hvilke tilfælde blev sammenlignet kun H. pylori
+ kontrol og en tredje analyse, hvor de befolkningsbaserede kontroller blev modsvaret af 5-års alderen gruppe og køn med kræfttilfælde.
resultater
Undersøgelse grupper egenskaber og H. pylori
status
fordelingen af ​​genotyper efter histologiske fund vises på tabel 1.Table en Genotype og allelfrekvenserne af IL-8 251
A /T og TLR-299
-399
loci i den ikke-kræft og kræft grupper efter histologiske fund

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n)
genotype
allel
genotype
allel
genotype
allel
AA
AT
TT
* A
* T
1,1
1,2
* 1
* 2
1 , 1
1,2
* 1
* 2
Gastritis (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29)
4
14
11
0,38
0,62
29
0
1
0
27
2
0.97
0.03
AG + IM (23)
5
10
8
0,43
0,57
20
3
0,93
0,07
23
0
1
0
mavekræft (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal skriv
8
21
7
0,51
0,49
34
2
0,97
0.03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age og køn matchede (n = 189)
33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0.96
0,04
179
10
0,97
0.03
PUD: mavesår sygdom; AG, atrofisk gastritis; IM: tarm metaplasi
Den genotypefrekvenser på det individuelle loci studerede var i Hardy-Weinberg ligevægt, med ikke-signifikante chi-square værdier (0,58 for IL8-251
, 0,42 til TLR4 Asp299Gly
og 0,17 for den TLR4 Thr399Ile
). Blandt kontrolgruppen, 80% havde kronisk gastritis (tabel 1), 11,2% af patienterne havde PUD og 8,8% af patienterne havde atrofisk gastritis og /eller intestinal metaplasi. Andelen af ​​diffuse og intestinal gastrisk cancer var 1,2:. 1
Prævalensen af ​​H. pylori
i kontrolgruppen var 73,7%. Dette svarer til den værdi, der tidligere er rapporteret for dette undersøgelsespopulationen [16]. Udbredelsen af ​​H. pylori
blandt de mavecancerpatienter var 53,8%.
Vurdering af risiko for IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly
TLR4 Thr399Ile
genotyper
Vi sammenlignet alle visse genotyper for IL8-251
(AA, AT og TT), til TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 og 2,2) og TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 og 2,2) (tabel 1). Hyppigheden af ​​IL8-251 dele på genotype var højere i mavens kræfttilfælde end i alle kontroller, kun H. pylori
positive kontroller og alder og køn matchede kontroller (tabel 2) .table 2 Odds ratio og 95 intervaller% tillid til analyse genotyperne af distale sager mavekræft vs
alle ikke-cancer kontrol.

IL8-251 * En
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
Alle tilfælde vs
ELLER (95% CI)
p
ELLER (95% CI)
p
ELLER 95% CI
p
ELLER 95% CI
p
Alle kontroller (n = 259)
2,12 (1,1-4,2)
0,023
1,73 (1-3)
0,049
1 (0,3-2,8)
0,82
0,25 (0,01-1,8)
0,2
H. pylori
+ kontroller (n = 191)
2,12 (1,1-4,2)
0,029
1.7 (0,96-3)
0,068
0,91 (0,3-2,6)
0,95
0,24 (0-1,8)
0,19
Alder og køn matchede kontroller (n = 189)
2,42 (1,2-4,8)
0,009
1,78 (1-3,2
0,035
1,04 (0,3-3,1)
0,86
0,23 (0-1,8)
0,1
Vurdering af risiko for IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
og TLR4 Thr399Ile * 2
alleler
Vi næste sammenlignede transport af IL8-251 * A
allel (homozygot plus heterozygot) for GC sager og alle gastritis plus normale kontroller. Vi fandt en forening af IL8 -251 * A
allel og udvikling af GC (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2, p = 0,023) (tabel 2). Når vi sammenlignet alle gastritis plus normale kontroller vs
histologiske typer kræft , risikoen for diffus og tarm mavekræft typer var ens, men ikke signifikant (OR = 2,15, p = 0,08 og OR = 2,1, p = 0,13 henholdsvis).
Da vi sammenlignede mavekræft tilfælde med H. pylori
+ kontroller vi fandt en lignende værdi (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2, p = 0,029).
Næste sammenlignede vi frekvensen i mavekræft gruppen withage og køn matchede kontroller og vi fandt en stærkere association (OR: 2,42, 95% CI = 1,2-4,8, p = 0.0.009).
Vi fandt ikke nogen forening for TLR4 Asp299Gly * 2
og TLR4 Thr399Ile * 2
hyporeactive alleler. Salg Diskussioner og konklusion
mangfoldigheden i reaktion på infektion med H. pylori
er blevet tilskrevet flere faktorer. Den genetisk reguleret immunrespons synes at spille en afgørende rolle ved bestemmelse af intensiteten af ​​skader på værten [1-3].
Flere forfattere har beskrevet den øgede produktion af IL-8 under H. pylori
infektion. En A /T-polymorfi ved positionen -251 i genet er blevet forbundet til en højere aktivitet af denne interleukin og for nylig er denne allel er relateret i to undersøgelser til udvikling af gastrisk cancer hos japanske befolkning [10, 11]. I en af ​​disse undersøgelser var den IL8-251 AA
genotypen afholdt en højere risiko for atrofisk gastritis (OR = 2,35, 95% CI = 1,12-4,94) og gastrisk cancer (OR = 2,22; 95% CI = 1.08- 4.56) sammenlignet med TT genotype. De studerede 252 raske kontrolpersoner, 215 personer med atrofisk gastritis, og 396 patienter med mavekræft. AA og AT genotyper var signifikant associeret med højere niveauer af IL8-protein, mere alvorlig neutrofil infiltration sammenlignet med TT genotype. I den anden undersøgelse blev IL-8 -251
* En allel forbundet med en højere risiko for mavekræft (OR = 2,1, 95% CI = 1,38-2,92). Vores resultater viste ingen sammenhæng mellem højere GC og AA-genotypen, men en positiv sammenhæng blev fundet for AT genotypen og transport af mindst én kopi af den * En allelen (homozygot plus heterozygot). Det er bemærkelsesværdigt, at den yderste periferi værdi observeret i vores undersøgelse (2.12) var meget lig den, der observeres i den japanske befolkning (2.1).
IL-1B-31 C /T
polymorfi er blevet forbundet med udvikling af gastrisk kræft og en geografisk-etnisk forskel er blevet beskrevet for dette locus, med en stærkere association af polymorfi i Satgur end i orientalsk befolkning. Resultaterne for IL-8-251
A /T polymorfi korrelerer med tidligere data præsenteret for japanske befolkning, viser ingen tendens i geografisk eller etnisk variation.
Det er i øjeblikket uafklaret, om et hyporesponsive LPS signalvejen er gavnligt eller skadelig for værten. Personer med den hyporeactive TLR4
polymorfier har vist reducerede niveauer af cirkulerende inflammatoriske cytokiner, en øget risiko for akutte bakterielle infektioner og en tendens i retning af øget dødelighed. Andre nylige undersøgelser understøtter den hypotese, at de lave fungerende TLR4
polymorfismer kan resultere i en reduceret inflammatorisk reaktion forbundet med en lav-ødelæggende infektion, der vil fremme en vedvarende infektion [17-20]. I denne undersøgelse har vi ikke finde nogen sammenhæng mellem GC og TLR4 polymorfier, hvilket tyder på, at de ikke bidrager til udviklingen af ​​distale mavekræft. Både TLR4 Asp299Gly
og Thr399Ile
polymorfier er blevet rapporteret i koblingsuligevægt (LD) [21, 22], men vi besluttede at genotype både fordi vi ikke vidste, om de var i LD i vores befolkning.
Afslutningsvis vores foreløbige resultater tyder på, at IL8-251
er en biologisk plausibel sygdomsmodificerende polymorfi. Hvis bekræftet i flere populationer, som det har været på japansk, og nu mexicanske grupper, dette polymorfe sted, i samarbejde med andre, kunne bruges til at identificere patienter med øget risiko for GC, der kan have brug tættere overvågning.
Erklæringer
konkurrerende interesser
forfatter (e) erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Gastric Helicobacter pylori infektion forbinder med en øget risiko for kolorektale polypper i afroamerikanere
• Fosforyleret Smad2 i Advanced Stage Gastric Carcinoma