Posúdenie toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile a interleukín-8 -251 polymorfizmov v riziku rozvoja karcinómu žalúdka distálnej

Posúdenie toll-like receptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile a interleukín-8 -251 polymorfizmy v riziku rozvoja karcinómu žalúdka distálnej
abstraktné
pozadia
intenzita zápalu vyvolaného Helicobacter pylori
kolonizácia je spojený s rozvojom distálny karcinómu žalúdka (GC). Hostiteľský reakcia na H
. pylori
je spojená s genetickými polymorfizmy, ktoré ovplyvňujú ako vrodené a adaptívne imunitnej odpovede.
Naším cieľom bolo zistiť, či prítomnosť TLR4 Asp299Gly
TLR4 Thr399Ile stroje a IL-8-251
a /T polymorfizmus mal nejaký vplyv vo vývoji distálnej GC v mexickej populácii
metódy
študovali sme 337 pacientov, ktorí boli rozdelení do dvoch skupín :. 78 pacientov s histologicky potvrdených distálnej GC a 259 nerakovinotvorných ovládacie prvky. Prítomnosť H. pylori
v kontrolnej populácie bola definovaná kladnými výsledkami aspoň dvoch zo štyroch diagnostických testov: sérologie, histológie, rýchly ureázy testov a kultúry. Ľudská DNA bola čistená a genotyp pre TLR4 Asp299Gly
polymorfizmus podľa pyrosekvenování, pre TLR4 Thr399Ile
podľa PCR-RFLP a IL8-251
podľa amplifikačného žiaruvzdorný mutácie systému (ARMS) -PCR.
Výsledky
bolo zistené, že v Hardy-Weinberg rovnováha v polymorfné lokusy kontrolná skupina non-rakovina študovaný (chi-square HW = 0,58 pre IL8-251
0.42 pre TLR4 Asp299Gly stroje a 0,17 pre TLR4 Thr399Ile
). boli porovnané Frekvencia mutovaných alel (homozygotných a heterozygotných) medzi prípadmi a kontrolami. Zistili sme žiadny významný rozdiel pre TLR4- Asp299Gly
[o 7,7% distálnej pacientov GC a 7,7% kontrol nerakovinotvorných (p = 0,82)] a pre TLR4 Thr399Ile
[1,3% pacientov GC a 5 % z kontrolnej populácie (p = 0,2)]. Naproti tomu u IL-8-251
/T, 80,77% pacientov GC a 66,4% vo veku kontrolnej skupiny a pohlavia uzavreté malo aspoň jednu kópiu mutované alely (OR = 2,12, 95% CI = 1.1.-2.4.) (p = 0,023). Záver
Táto štúdia ukázala, že IL8-251 * A
alela môže súvisieť s rozvojom distálnej rakoviny žalúdka v tejto mexickej populácie.
pozadia
Helicobacter pylori
takmer výhradne kolonizovať slizničnej vrstvy ľudského žalúdka a zdržiavať na území hostiteľského po celé roky, desaťročia alebo možno celý život. V približne 10% prípadov, organizmus je spojená s rôznymi klinické výsledky, vrátane neulcerózní dyspepsia, vredovej choroby, a distálnej karcinómu žalúdka [1].
Obaja hostiteľa a environmentálne faktory boli spojené s týmto klinickým rozmanitosti. Hostiteľské faktory sa týkajú predovšetkým uznanie baktérií imunitným systémom a rozdiely v úrovni cytokinové odpovede [2, 3].
Uznanie patogénov je sprostredkovaná sadou receptorov embryonálnymi kódovaním, ktoré sú len receptory vzor-rozpoznávacie (PRRS). Tieto receptory uznávať konzervované molekulárnej vzory, ktoré sú zdieľané veľkých skupín mikroorganizmov. Dôležitou PRR je Toll-like receptor 4 (TLR4), transmembránový receptor, ktorý rozpoznáva rad ligandov, vrátane lipopolysacharid (LPS), ktorý sa nachádza v bunkovej steny gram-negatívnych baktérií, ako je H. pylori
[3 ]. Dve jednonukleotidových polymorfizmov (SNP) v TLR4
génu, Asp-299 → Gly a Thr-399 → Ile prechody, bolo preukázané, že vedie k zníženej odpovedi na LPS, zníženú hustotu epitelu TLR4 a znižuje zápalovú reakciu cytokínu LPS [ ,,,0],4]. Okrem toho, genetické varianty cytokínov sú tiež dôležité pre zápalové odpovede, a niekoľko génov z rôznych ciest, ktoré boli spojené s rakovinou žalúdka, vrátane interleukínu (IL) -1b
, TNF
, IL-10 a
IL-8
[5-7].
IL-8 cytokíny pôsobí ako silný chemoatraktant pre neutrofily a lymfocyty. Bolo zistené, že hladiny IL-8 zvyšuje 10-krát vo vzorkách s karcinómom žalúdka v porovnaní s normálnymi tkanivami žalúdka. Dobre vyznačujúci sa SNP T /A do -251 lokuse bolo popísané, a sú spojené s vyššou produkciou IL-8 a niekoľkých ochorení [8-11].
Naším cieľom bolo zistiť, či sa TLR4 Asp299Gly
, TLR4 Thr399Ile stroje a IL8-251 /T
polymorfizmy sú spojené s distálnej rakovinou žalúdka v dobre definované mexickej populácie.
metódy
populácie pacientov
študovali sme 78 nepríbuzných pacientov s histologicky potvrdených distálnej GC (priemerný vek = 58.6, stredný vek = 60, veková kategória: 22-84, F: M = 0,56). Tiež sme študovali 259 pacientov bez histologicky overeným GC (priemerný vek = 57.1, stredný vek = 54, vekové = 18-92, F: M = 1,17). Táto populácia bola popísaná skôr [7]. Všetci pacienti boli zaradení do nemocnice Universitario "Dr. José González Eleuterio", Universidad Autónoma de Nuevo León. Miestne etickej komisie schválil štúdiu a písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých subjektov.
Histopatologické vyšetrenie predaj z všetkými kontrolnými pacientmi, bolo získané osem biopsia pre histologické vyhodnotenie, dvaja z menšej zakrivenie, dvaja z veľkého zakrivenie , dvaja z incisura angularis, a dvaja z prepyloric regiónu. Od pacientov s distálnej GC, aspoň 8 biopsie boli získané z nádoru pre histologické vyhodnotenie. Biopsia z prípadov a kontrol bolo opravené, parafínové vložený a zafarbené hematoxilinem eozín. Skúsený patológ preskúmal všetky histologických preparátov.
H. pylori
stave
H. pylori
stav populácie kontrolných bola stanovená histologicky, rýchle Ureáza testu (RUT), sérologie a kultúru , Pre ruje, čo antrálnej biopsia bola analyzovaná pomocou validovaného nekomerčné testu [12]. Biopsia sa umiestni do testovacej fľaštičke, inkubujú pri teplote 37 ° C a čítať do 24 h. Zmena farby z oranžovej do fialovej ukázali pozitívny výsledok. Pre serológiu, bol použitý enzyme-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), aby sa preukázala prítomnosť IgG protilátok, ako bolo opísané skôr [13].
Kultúra bola vykonaná na dvoch korpusu a dve antra biopsia štandardnými spôsobmi. Biopsie boli umiestnené v 10% krvnom agare (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) a inkubované pri 37 ° C počas aspoň jedného týždňa v mikroaerobní podmienok. Kmene boli identifikované Gram farbenie, oxidázy, katalázový a ureázy testy.
Kontrolné skupiny pacientov boli považované za infikované H. pylori
prípade, že aspoň dvaja z diagnostických testov boli pozitívne.
Prevalencia H. pylori
infekcie u pacientov s karcinómom žalúdka bola stanovená v dôsledku histológie iba.
genotypu
genómovej DNA bola extrahovaná z periférnej krvi pomocou fenol-chloroform-isoamilic alkoholu a vyzrážaním etanolom spôsobom. Amplifikácia žiaruvzdorný mutácie systému (ARMS) -PCR metóda bola použitá na genotype IL8-251
polymorfizmus, ako bolo opísané skôr [14].
TLR4 Thr399Ile
polymorfizmus bola stanovená pomocou PCR-RFLP [15] a v TLR4 Asp299Gly
polymorfizmus bol stanovený metódou pyrosekvenační určené pre túto štúdiu. Spočiatku, PCR bola vykonaná s primermi F-GAT TAG ACT CAT TAG ACT ACT ACC TCC ATG a R-CCC CAA TTT TAG TCA TCA CCA CAC GG s reverznej primer biotínom. Podmienky PCR boli nasledujúce: 94 ° C počas 5 min a 40 cyklov pri 94 ° C, 59 ° C a 72 ° C počas 30 s každou, a konečná extenzia pri teplote 72 ° C počas 5 min. Pre Pyrosequencing, biotinylizované PCR šablóny boli imobilizované na streptavidínom potiahnuté paramagnetické guľôčky Sepahrose vo väzbovom pufri. Korálku-šablóny komplexy boli premyté ponorením do 70% alkoholu a 0,5 M roztoku hydroxidu sodného a potom sa pridá 45 ul pufra, ktorý obsahuje žíhanie 15 pmol priméru sekvencovania 5'-CAT ACT TAG ACT ACT ACC TC 3 '. Žíhanie sa uskutočnila pri teplote 80 ° C po dobu 2 min. V reálnom čase, pyrosekvenování bola vykonaná v automatizovanej 96-jamkové pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyrosequencing AB, Uppsala, Švédsko) za použitia enzýmov a substrátov odporúčaných výrobcom.
Štatistická analýza
Hardy-Weinbergovy rovnováhy alel v jednotlivých lokusov bola hodnotená chi-kvadrát štatistiky. Štatisticky významné rozdiely boli stanovené pomocou Studentov testu
, chi-kvadrát alebo Fisherov presný test, dva sledoval. Hodnota pravdepodobnosti (p) < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú. Vzájomné pomery (OR) s 95% intervalmi spoľahlivosti (CIS) boli vypočítané pomocou softvéru Epi-Info 2000 (Centrum pre kontrolu a prevenciu chorôb, Atlanta, GA.). Tri analýzy boli vykonané, v ktorom boli zahrnuté všetky prípady a kontroly, druhý, ktorý bral prípady len s H. pylori
+ kontrol a tretí analýzy, v ktorom boli kontroly populačný na báze porovnaná 5 rokov veku skupín a pohlavia s prípadov rakoviny.
výsledky
študijnej skupiny vlastnosti a H. pylori
stave
distribúcia genotypov podľa histologických nálezov je uvedený v tabuľke 1. 1.Table genotypu a alel frekvencie IL-8 251 stroje a /T a TLR-299 stroje a -399
loci v non-rakoviny a rakoviny skupín podľa histologických nálezov

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n)
genotyp
alely
genotyp
alela
genotyp
alela
AA online na
TT
* A * T
1,1
1,2
* 1 * 2
1 1
1,2
* 1 * 2
Gastritída (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29)
4
14
11
0,38
0,62
29
0
1
0
27
2
0,97
0,03
AG + IM (23)
5
10
8
0,43
0,57
20 Sims 3
0,93 0,07

23
0
1
0
karcinóm žalúdka (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal typ
8
21
7
0,51
0,49
34
2
0,97
0,03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age a pohlavia uzavreté (n = 189)
33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0,96
0,04
179
10
0,97
0,03
PUD: žalúdočný vred choroba; AG, atrofickú gastritídu; IM: črevná metaplázia
genotypu frekvencií na individuálnu loci študoval boli v Hardy-Weinberg rovnováhy, s nesignifikantným chi-square hodnôt (0,58 pre IL8-251
0,42 pre TLR4 Asp299Gly stroje a 0,17 pre TLR4 Thr399Ile
). Medzi kontrolnej skupine, 80% malo chronické gastritídy (tabuľka 1), 11,2% pacientov malo PUD a 8,8% pacientov malo atrofickú gastritídou a /alebo črevné metaplázia. Podiel rozptýleného a črevného karcinómu žalúdka bol 1,2 :. 1
prevalencia H. pylori
v kontrolnej skupine bola 73,7%. To je podobné ako hodnoty predtým zaznamenali tento študovanej populácie [16]. Prevalencia H. pylori
medzi pacientmi s rakovinou žalúdka bol 53,8%.
Posúdenie rizika IL8-251
/T, TLR4 Asp299Gly stroje a TLR4 Thr399Ile
genotypy
porovnávali sme všetky jednotlivé genotypy pre IL8-251
(AA, AT a TT), pre TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 a 2,2) a TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 a 2,2) (tabuľka 1). Frekvencia IL8-251
AT genotypu bola vyššia u prípadov rakoviny žalúdka ako vo všetkých ovládacích prvkov, len H. pylori
pozitívnej kontroly a vek a pohlavie uzavreté ovládacie prvky (tabuľka 2) .Table 2 miery pravdepodobnosti a 95 intervaly% spoľahlivosti pre analýzu genotypy distálnych prípadov rakoviny žalúdka vs
všetky ovládacie prvky non-rakovinové.

IL8-251 * A
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
všetkých prípadoch vs
OR (95% CI)
p
OR (95% CI)
p
alebo 95% CI
p
alebo 95% CI
p
Všetky ovládacie prvky (n = 259)
2,12 (01.1.-2.4.)
0,023
1,73 (1-3)
0,049
1 (0,3-2,8)
0,82
0,25 (0,01 - 1,8)
0,2
H. pylori
+ kontroly (n = 191)
2,12 (01.1.-2.04.)
0,029
1.7 (0.96-3)
0,068
0,91 (0.3-2.6)
0,95
0,24 (0-1,8)
0,19
vek a pohlavie uzavreté kontroly (n = 189)
2,42 (02 /1-08 /04)
0,009
1,78 (1-3,2
0,035
1,04 (0,3-3,1)
0,86
0,23 (0-1,8)
0,1
Posúdenie rizika IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
a TLR4 Thr399Ile * 2
alely
Ďalej sme porovnávali prepravu na IL8-251 * a
alely (homozygotná navyše heterozygotná) v prípadoch GC a všetky žalúdka a navyše normálnych kontrol. Našli sme pridružení IL8 -251 * a
alela a vývoj GC (OR = 2,12, 95% CI = 1.1-4.2, p = 0,023) (tabuľka 2). Pri porovnaní všetkých gastritídy a normálnych kontrol vs
histologických typov rakoviny riziká pre difúzne a črevné žalúdočné typov rakoviny boli podobné, ale nie sú významné (OR = 2,15, p = 0,08 a OR = 2,1, p = 0,13 v uvedenom poradí).
Keď sme porovnali žalúdočné prípadov rakoviny s H. pylori
+ kontroly sme zistili podobnú hodnotu (OR = 2,12, 95% CI = 01.1.-2.04., p = 0,029).
Ďalej sme porovnali frekvenciu v žalúdku skupiny rakovina withage a pohlavia uzavreté kontroly a sme našli silnejšie asociácie (OR: 2,42, 95% CI = 02.01.-08.04., p = 0.0.009).
sme nenašli žiadne združenie pre TLR4 Asp299Gly * 2 stroje a TLR4 Thr399Ile * 2
hyporeactive alel.
Diskusia a záver
rozmanitosti v reakcii na infekciu H. pylori
bol pripočítaný niekoľkým faktorom. Zdá sa, že geneticky upravené imunitnú odpoveď na zohrávajú kľúčovú úlohu pri určovaní intenzity poškodení hostiteľa [1-3].
Niekoľko autorov popísal zvýšenú produkciu IL-8 v H. pylori
infekcie. A /T polymorfizmus v polohe -251 génu bolo spojené s vyššou aktivitou tohto interleukínu, a v poslednej dobe, táto alela je spojená v dvoch štúdiách k rozvoju rakoviny žalúdka v japonskej populácie [10, 11]. V jednej z týchto štúdií, do IL8-251 AA
genotyp držal vyššie riziko atrofickej gastritídy (OR = 2,35; 95%, CI = 1,12 - 4,94) a rakovina žalúdka (OR = 2,22, 95% CI = 1.08- 4,56) v porovnaní s genotypom TT. Študovali 252 zdravých kontrol, 215 jedincov s atrofickú gastritídu a 396 pacientov s karcinómom žalúdka. AA a AT genotypov boli významne spojené s vyššími úrovňami IL8 bielkovín, ťažším infiltrácia neutrofilov v porovnaní s genotypom TT. V ďalšej štúdii, IL-8 -251
* A alely je spojená so zvýšeným rizikom rakoviny žalúdka (OR = 2,1; 95% CI = 1.38-2.92). Naše výsledky ukázali, žiadny vzťah medzi vyššej rýchlosti a GC AA genotyp, ale pozitívny vzťah bol zistený u genotypu AT a prepravu aspoň kópiu * A alely (homozygotná a heterozygotná). Je pozoruhodné, že hodnota najvzdialenejšie regióny pozorované v našej štúdii (2,12) bol veľmi podobný ako u japonskej populácie (2.1).
IL-1B-31 C /T
polymorfizmus bol spojený s vývojom žalúdočné rakoviny a správne etnikami rozdiel bol popísaný v tomto lokuse, sa silnejším združením polymorfizmu v Occidental než v orientálnej populácie. Výsledky pre /T polymorfizmu IL-8-251
korelujú s predchádzajúcimi prezentovaných údajov pre japonskej populácie, zobrazujúci geografickej alebo etnického variante bez trendu.
V súčasnej dobe nevyriešený, či niekoľko hyporeaktívne LPS signálna dráha je prospešné alebo škodlivé pre hostiteľa. Jedinci s hyporeactive TLR4
polymorfizmy ukázali zníženej hladiny cirkulujúcej zápalové cytokíny zvýšené riziko akútnych bakteriálnych infekcií a trend k zvýšenej úmrtnosti. Nedávne štúdie podporujú hypotézu, že TLR4
polymorfizmy nízke fungujúci môže mať za následok zníženú zápalové reakcie spojené s nízkou poškodzujúcimi infekcia, ktorá bude podporovať pretrvávajúce infekcii [17-20]. V tejto štúdii sme nezistili žiadnu súvislosť medzi GC a TLR4 polymorfizmy, čo naznačuje, že neprispievajú k rozvoju distálnej rakoviny žalúdka. Oba TLR4 Asp299Gly stroje a Thr399Ile
polymorfizmy boli hlásené vo väzobnej nerovnováhe (LD) [21, 22], ale rozhodli sme sa genotypu jednak preto, že sme nevedeli, ak by boli v LD v našej populácii.
záverom možno povedať, naše predbežné výsledky ukazujú, že IL8-251
je polymorfizmus biologicky pravdepodobný chorobu modifikujúce. Ak potvrdí v niekoľkých populáciách, ako tomu bolo v japončine, a teraz mexickej skupiny, to polymorfné miesta, v spojení s inými, by mohli byť použité na identifikáciu pacientov vo väčšom nebezpečenstve pre GC, ktoré budú pravdepodobne potrebovať podrobnejšie sledovanie.
Vyhlásenia
Konflikt záujmov
Autor (ri) vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Žalúdočné infekcie Helicobacter pylori asociuje so zvýšeným rizikom kolorektálnych polypov v afrických Americans
• Fosforylovaný Smad2 v pokročilom štádiu žalúdku Carcinoma