A avaliação do receptor de tipo Toll 4 Asp299Gly, Thr399Ile e -251 polimorfismos no risco para o desenvolvimento de Avaliação distai cancer

gástrica do receptor de tipo Toll 4 8 interleucina-Asp299Gly, Thr399Ile e -251 polimorfismos no risco para a interleucina-8 o desenvolvimento de câncer gástrico distal da arte abstracta
Fundo
a intensidade da inflamação induzida pela Helicobacter pylori colonização
está associada com o desenvolvimento de câncer gástrico distal (GC). A resposta do hospedeiro a H
. pylori
tem sido relacionada com polimorfismos genéticos que influenciam ambas as respostas imune inata e adaptativa.
Nosso objetivo foi investigar se a presença do
TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile Comprar e IL-8-251
polimorfismos a /T tido qualquer influência no desenvolvimento da GC distal em uma população mexicana
Métodos
foram estudados 337 pacientes, que foram divididos em dois grupos:. 78 pacientes com diagnóstico histológico de GC distal e 259 não-câncer controlos. A presença de H. pylori
na população de controlo foi definida por resultados positivos de pelo menos dois dos quatro testes de diagnóstico: serologia, histologia, teste da urease e cultura. DNA humano foi purificada e genotipados para TLR4 Asp299Gly
polimorfismo por pyrosequencing, por TLR4 Thr399Ile
por PCR-RFLP e para IL8-251
pelo sistema de amplificação refratária de mutação (ARMS)-PCR.
Resultados
o grupo controle não-câncer foi encontrado em Hardy-Weinberg no locos polimórficos estudadas (qui-quadrado HW = 0,58 para IL8-251
, 0,42 para TLR4 Asp299Gly
e 0,17 para TLR4 Thr399Ile
). As frequências de alelos mutados (homozigotos mais heterozigotos) foram comparados entre casos e controles. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa para TLR4- Asp299Gly
[a 7,7% dos pacientes do GC distais e 7,7% controles não-cancerosas (p = 0,82)] e para TLR4 Thr399Ile
[a 1,3% dos pacientes do GC e os 5 % da população de controlo (p = 0,2)]. Em contraste, para IL-8-251
A /T, 80,77% dos pacientes do GC e 66,4% na faixa etária de controle e sexo pareados tiveram pelo menos uma cópia do alelo mutado (OR = 2,12, 95% CI = 1,1-4,2) (p = 0,023).
Conclusão
este estudo mostrou que a IL8-251 * a
alelo pode estar relacionado com o desenvolvimento de câncer gástrico distal nesta população mexicana.
Fundo
Helicobacter pylori
colonizar quase exclusivamente a camada mucosa do estômago humano e permanecer no hospedeiro por anos, décadas ou talvez ao longo da vida. Em aproximadamente 10% dos casos, o organismo está associada com diversos resultados clínicos, incluindo dispepsia não ulcerosa, doença de úlcera péptica, e cancro gástrico distal [1]. Ambos
hospedeiro e factores ambientais têm sido associados com esta diversidade clínica. Os factores do hospedeiro estão essencialmente relacionados com o reconhecimento de que as bactérias pelo sistema imunológico e a variação no nível de resposta de citocinas [2, 3].
Reconhecimento de patógenos é mediado por um conjunto de receptores codificados em linha germinal que são referidos como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Estes receptores reconhecem conservada padrões moleculares, que são compartilhados por grandes grupos de microrganismos. Um PRR é importante receptor de tipo Toll 4 (RST4), um receptor transmembranar que reconhece uma gama de ligandos, incluindo lipopolissacárido (LPS), que se encontra na parede celular de bactérias Gram-negativas como H. pylori
[3 ]. Dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no gene do TLR4
, Asp-299 → Gly e THR-399 → transições Ile, têm sido mostrados para levar a resposta diminuída a LPS, reduziu a densidade epitelial TLR4 e reduziu a resposta de citocinas inflamatórias ao LPS [ ,,,0],4]. Além disso, as variantes genéticas de citocinas também são críticos para a resposta inflamatória, e vários genes de diferentes percursos têm sido associadas com o cancro gástrico, incluindo interleucina (IL) -1B
, TNF
, IL-10 e

[5-7].
IL-8 funções de citocinas como um quimioatractor potente para neutrófilos e linfócitos de IL-8. Tem sido relatado que a IL-8 níveis aumentou 10 vezes em amostras de cancro gástrico, quando comparada com os tecidos normais gástricas. Um bem caracterizada SNP T /A no -251 lócus foi descrita e associada com maior IL-8 produção e várias doenças [8-11].
Nosso objetivo foi determinar se o
TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile
eo IL8-251 a /T
polimorfismos estão associados com câncer gástrico distal em uma população mexicana bem definido.
Métodos
população paciente
Foram estudados 78 pacientes não relacionados com confirmação histológica GC distal (média de idade = 58.6y, idade média = 60, a faixa etária: 22-84, F: M = 0,56). Nós também estudou 259 pacientes sem evidência histológica de GC (média de idade = 57.1y, idade média = 54, a faixa etária = 18-92, F: M = 1,17). Esta população tem sido descrito anteriormente [7]. Todos os pacientes foram registrados no Hospital Universitário "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León. O comitê de ética local aprovou o estudo e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos.
Exames histopatológicos
de todos os pacientes do grupo controle, oito amostras de biópsia foram obtidos para avaliação histológica, dois da curvatura menor, dois da curvatura maior , dois dos incisura angularis, e dois da região prepyloric. A partir de pacientes com GC distal, pelo menos, 8 biópsias foram obtidas a partir do tumor para avaliação histológica. Biópsias de casos e controles foram fixados, embebidos em parafina e corados com hematoxilina-eosina. Um patologista experiente examinou todas as lâminas histológicas.
H. pylori
estatuto
O H. pylori
estado da população de controlo foi determinada por histologia, o teste rápido da urease (RUT), sorologia e cultura . Para o RUT, uma biópsia antral foi analisada por um teste não-comercial validado [12]. A biópsia foi colocada num tubo de ensaio, incubadas a 37 ° C e lida dentro de 24 h. Uma mudança de cor de laranja para magenta indicado um resultado positivo. Para sorologia, foi utilizado um-ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para demonstrar a presença de anticorpos IgG como descrito anteriormente [13].
A cultura foi realizada em dois corpus e duas biópsias antro por métodos padrão. As biópsias foram colocados em agar de sangue a 10% (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) e incubou-se a 37 ° C durante, pelo menos, uma semana sob condições microaeróbias. Cepas foram identificados pela coloração de Gram, oxidase, testes de catalase e urease.
Pacientes do grupo controle foram considerados H. pylori
infectado quando pelo menos dois dos testes de diagnóstico foram positivos.
A prevalência de H. pylori
infecção em doentes com cancro gástrico foi determinada pelo resultado da histologia única.
Genotipagem
o ADN genómico foi extraído a partir de sangue periférico por o álcool-fenol-clorofórmio isoamílico e precipitação com etanol método. Um sistema de amplificação de mutação refractário (ARMS) -PCR método foi utilizado para genotipar o IL8-251
polimorfismo tal como descrito anteriormente [14]. Of the RST4 Thr399Ile
polimorfismo foi determinada por PCR-RFLP [15] e a RST4 Asp299Gly
polimorfismo foi determinada por um método pyrosequencing concebido para este estudo. Inicialmente, foi realizada uma PCR com os iniciadores M-TAG GAT CAT TAG ACT ACT ACT TCC ACC ATG e R-CCC CAA TTT TAG TCA CAC TCA CCA GG com o iniciador inverso biotinilado. As condições de PCR foram: 94 ° C durante 5 min e 40 ciclos de 94 ° C, 59 ° C e 72 ° C durante 30 s cada um, e uma extensão final a 72 ° C durante 5 min. Para pyrosequencing, moldes de PCR biotinilados foram imobilizados em contas de Sepahrose paramagnéticas revestidas com estreptavidina em tampão de ligação. Os complexos do grânulo-molde foram lavadas por imersão em álcool a 70% e NaOH 0,5 M e, em seguida, adicionado a 45 ul de tampão de recozimento contendo 15 pmol do iniciador de sequenciação 5'-CAT TAG ACT ACT ACT ACC TC 3 '. O recozimento teve lugar a 80 ° C durante 2 min. pyrosequencing em tempo real foi realizada em um de 96 poços pirossequenciador PSQ SNP 96 (pirossequenciao AB, Uppsala, Suécia) utilizando as enzimas e os substratos recomendados pelo fabricante. A análise estatística
automatizado
Hardy-Weinberg de alelos em loci individuais foi avaliada pela estatística qui-quadrado. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste t de Student
, qui-quadrado ou teste exato de Fisher, bicaudal. A probabilidade (p) valor < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. odds ratio (OR) com intervalo de confiança de 95% (IC) foram calculados utilizando o software Epi-Info 2000 (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Três análises foram realizadas, uma em que todos os casos e controles foram incluídos, uma segunda em que casos foram comparados apenas com H. pylori controles
+ e uma terceira análise na qual os controles de base populacional foram pareados por idade de 5 anos grupo e de gênero com os casos de câncer.

resultados características grupos de estudo e H. pylori
estado
a distribuição dos genótipos de acordo com os achados histológicos é mostrada na Tabela 1.Table 1 genótipo e alelo frequências de a IL-8 251
a /T e TLR-299 Comprar e -399
loci na não-câncer e grupos de câncer de acordo com os achados histológicos

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Group (n)
genótipo
alelo
genótipo
alelo
genótipo
alelo
AA
AT
TT
* A * T

1,1
1,2
* 1 | * 2
1 , 1 | 1,2
* 1 | * 2
Gastrite (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29) 4
14
11
0,38
0,62
29
0
1 | 0
27 Página 2
0,97
0,03
AG + IM (23)
5
10
8
0,43
0,57
20
3
0,93
0,07
23
0
1 | 0
gástrica câncer (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal digite
8
21
7
0,51
0,49
34 Página 2
0,97
0,03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age e sexo pareados (n = 189)
33
87
69
0,4 ​​
0,6
175
14
0,96
0,04
179
10
0,97
0,03
PUD: úlcera péptica; AG, gastrite atrófica; IM: metaplasia intestinal
As freqüências genotípicas no loci individuais estudados estavam em Hardy-Weinberg, com valores não significativos qui-quadrado (0,58 para IL8-251
, 0,42 para TLR4 Asp299Gly
e 0,17 para o
TLR4 Thr399Ile). Entre o grupo de controlo, 80% tiveram gastrite crónica (Tabela 1), 11,2% dos pacientes tinham doença ulcerosa péptica e 8,8% dos pacientes tinham gastrite atrófica e /ou metaplasia intestinal. A proporção de câncer gástrico difuso e intestinal foi de 1,2:. 1
A prevalência de H. pylori
no grupo controle foi de 73,7%. Isto é semelhante ao valor relatado para esta população de estudo [16]. A prevalência de H. pylori
entre os pacientes com câncer gástrico foi de 53,8%.
Avaliação do risco de IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly Comprar e TLR4 Thr399Ile
genótipos
Nós comparamos todos os genótipos específicos para IL8-251
(AA, AT e TT), para TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 e 2,2) e TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 e 2,2) (Tabela 1). A frequência do IL8-251
AT genótipo foi maior nos casos de câncer gástrico do que em todos os controles, apenas a H. pylori
controles positivos e idade e sexo controles pareados (Tabela 2) .table 2 odds ratio e 95 intervalos% de confiança para a análise dos genótipos de casos de câncer gástrico distal vs
todos os controles não-cancerosas.

IL8-251 * A
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
Todos os casos vs
OU
(95% CI)
p
OR (95% CI)
p
OR IC 95%
p
ou 95% CI
p
Todos os controles (n = 259)
2,12 (1,1-4,2)
0,023
1,73 (1-3)
0,049
1 (0,3-2,8)
0,82
0,25 (0,01-1,8)
0,2
H. pylori
+ controles (n = 191)
2,12 (1,1-4,2)
0,029
1,7 (0,96-3)
0,068
0,91 (0,3-2,6)
0,95
0,24 (0-1,8)
0,19
Idade e sexo controles pareados (n = 189)
2,42 (1,2-4,8)
0,009
1,78 (1-3,2
0,035
1,04 (0,3-3,1)
0,86
0,23 (0-1,8)
0,1
Avaliação do risco de IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
e TLR4 Thr399Ile * 2
alelos
Nós próxima compararam o transporte da IL8-251 * a
alelo (homozigoto mais heterozigotos) para casos de GC e todos gastrite além de controles normais. Encontramos uma associação da IL8 -251 * a
alelo eo desenvolvimento de GC (OR = 2,12, IC 95% = 1,1-4,2, p = 0,023) (Tabela 2). Quando comparamos todos os controles de gastrite mais normais vs tipos de câncer histológicos
, os riscos para difusa e tipos de câncer gástrico intestinal foram semelhantes, mas não significativa (OR = 2,15, p = 0,08 e OR = 2,1, p = 0,13, respectivamente).
Quando comparamos os casos de câncer gástrico com o H. pylori
+ controles encontramos um valor semelhante (OR = 2,12, IC 95% = 1,1-4,2, p = 0,029).
em seguida, foram comparadas as frequências na withage grupo câncer gástrico e sexo controles pareados e encontramos um forte associação (OR: 2,42, 95% CI = 1,2-4,8, p = 0.0.009).
Nós não encontrou qualquer associação de TLR4 Asp299Gly * 2
e TLR4 Thr399Ile * 2
alelos hyporeactive.
discussões e conclusão
a diversidade em resposta à infecção por H. pylori
tem sido atribuída a vários fatores. A resposta imune geneticamente regulada parece desempenhar um papel crucial na determinação da intensidade de danos para o hospedeiro [1-3].
Vários autores têm descrito o aumento da produção de IL-8 durante a infecção por H. pylori
. Um Um polimorfismo /T na posição -251 no gene tem sido associada a uma maior actividade de interleucina esta e, recentemente, esse alelo foi relacionado em dois estudos para o desenvolvimento de cancro gástrico em população japonesa [10, 11]. Em um desses estudos, o AA IL8-251
genótipo realizou um maior risco de gastrite atrófica (OR = 2,35; 95%, IC = 1,12-4,94) e câncer gástrico (OR = 2,22; IC95% = 1.08- 4,56) em comparação com o genótipo TT. Eles estudaram 252 controles saudáveis, 215 indivíduos com gastrite atrófica, e 396 pacientes com câncer gástrico. O AA e AT genótipos foram significativamente associados com níveis mais elevados de proteína IL8, infiltração de neutrófilos mais grave, em comparação com o genótipo TT. No outro estudo, a IL-8 -251
* alelo A foi associado a um maior risco de câncer gástrico (OR = 2,1; IC95% = 1,38-2,92). Nossos resultados mostraram nenhuma associação entre índices mais elevados de GC e do genótipo AA, mas uma associação positiva foi encontrada para o genótipo AT e ao transporte de pelo menos uma cópia do alelo * A (homozigoto mais heterozigoto). É notável que o valor RUP observada no nosso estudo (2,12) foi muito semelhante ao observado na população japonesa (2.1).
A IL-1B-31 C /T
polimorfismo tem sido associada com o desenvolvimento de câncer gástrico e uma diferença geográfica-étnica tem sido descrita para esse loco, com uma associação mais forte do polimorfismo no occidental do que na população oriental. Os resultados para o polimorfismo IL-8-251
A /T correlacionam com os dados anteriores apresentados para a população japonesa, mostrando nenhuma tendência na variação geográfica ou étnica.
É actualmente não resolvido se um LPS hiporresponsivos via de sinalização é benéfico ou prejudicial para o hospedeiro. Indivíduos com a hyporeactive TLR4
polimorfismos mostraram redução dos níveis de citocinas circulantes inflamatórios, um risco aumentado de infecções bacterianas agudas e uma tendência para o aumento da mortalidade. Outros estudos recentes suportam a hipótese de que os polimorfismos TLR4
de baixo funcionamento pode resultar numa resposta inflamatória reduzida associada com uma infecção de baixa danificar que vai promover uma infecção persistente [17-20]. Neste estudo, nós não encontramos nenhuma associação entre GC e polimorfismos de TLR4, sugerindo que eles não contribuem para o desenvolvimento de câncer gástrico distal. Ambos TLR4 Asp299Gly Comprar e Thr399Ile
polimorfismos têm sido relatados em desequilíbrio de ligação (LD) [21, 22], mas nós decidimos genótipo tanto porque não sabia se eles estavam em LD em nossa população.
em conclusão, nossos resultados preliminares sugerem que IL8-251
é um polimorfismo modificador da doença biologicamente plausível. Se confirmado em várias populações, como tem sido em grupos mexicanos japonês, e agora, este sítio polimórfico, em conjunto com os outros, poderiam ser usados ​​para identificar pacientes com maior risco de GC, que pode precisar de um acompanhamento mais próximo.
Declarações
Conflito de interesses
O autor (s) declaram que não têm interesses conflitantes.

• Gástrica Helicobacter pylori associados com um risco aumentado de pólipos colorretais em afro-americanos
• Fosforilada Smad2 em estágio avançado gástrica Carcinoma