Évaluation du récepteur Toll-like 4 Asp299Gly, Thr399Ile et l'interleukine-8 -251 polymorphismes dans le risque pour le développement du cancer gastrique distal

Évaluation du récepteur Toll-like 4 Asp299Gly, Thr399Ile et l'interleukine-8 -251 polymorphismes dans le risque pour le développement du cancer gastrique distal
Résumé de l'arrière-plan
L'intensité de l'inflammation induite par Helicobacter pylori
la colonisation est associée au développement du cancer gastrique distal (GC). La réponse de l'hôte à H
. pylori
a été liée à des polymorphismes génétiques qui influencent les réponses immunitaires innées et adaptatives.
Notre objectif était de déterminer si la présence de la
TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile
et IL-8-251
a /T polymorphismes ont eu une influence dans le développement de GC distal dans une population mexicaine
Méthodes
Nous avons étudié 337 patients qui ont été divisés en deux groupes:. 78 patients avec histologiquement confirmé GC distale et 259 non-cancer contrôles. La présence de H. pylori
dans la population témoin a été défini par des résultats positifs d'au moins deux des quatre tests de diagnostic: sérologie, histologie, test rapide à l'uréase et la culture. On a purifié l'ADN humain et génotypés pour le polymorphisme de TLR4 Asp299Gly par pyroséquençage, pour TLR4 Thr399Ile
par PCR-RFLP et IL8-251
par le système d'amplification de mutation réfractaire (ARMS) -PCR.
Résultats
le groupe témoin non-cancer a été trouvé en équilibre Hardy-Weinberg au locus polymorphes étudiés (chi carré HW = 0,58 pour IL8-251
, 0,42 pour TLR4 Asp299Gly
et 0,17 pour TLR4 Thr399Ile
). Les fréquences des allèles mutés (homozygotes, plus hétérozygotes) ont été comparés entre les cas et les témoins. Nous avons trouvé aucune différence significative pour [7,7% des patients du GC distales et 7,7% des contrôles non-cancéreuses (p = 0,82)] de TLR4 Asp299Gly et pour TLR4 Thr399Ile
[1,3% des patients du GC et les 5 % de la population témoin (p = 0,2)]. En revanche, pour l'IL-8-251
A /T, 80,77% des patients du GC et 66,4% à l'âge de groupe témoin et le sexe appariés avaient au moins une copie de l'allèle muté (OR = 2,12, IC à 95% = 1,1-4,2) (p = 0,023).
Conclusion
cette étude a montré que le IL8-251 * Un
allèle pourrait être lié au développement du cancer gastrique distal dans cette population mexicaine.
fond
Helicobacter pylori
presque exclusivement coloniser la couche muqueuse de l'estomac humain et de séjourner dans l'hôte pendant des années, des décennies ou peut-être à vie. Dans environ 10% des cas, l'organisme est associé à des résultats cliniques diverses, y compris la dyspepsie non ulcéreuse, la maladie de l'ulcère gastro-duodénal, et le cancer gastrique distal [1].
Deux hôte et les facteurs environnementaux ont été associés à cette diversité clinique. facteurs hôte sont principalement liés à la reconnaissance des bactéries par le système immunitaire et de la variation du niveau de réponse des cytokines [2, 3].
reconnaissance des pathogènes est médiée par un ensemble de récepteurs germinales codés qui sont désignés comme récepteurs de reconnaissance des formes (PRR). Ces récepteurs reconnaissent conservés les modèles moléculaires, qui sont partagées par de grands groupes de micro-organismes. Un PRR important est le récepteur de type Toll 4 (TLR4), un récepteur transmembranaire qui reconnaît une gamme de ligands, y compris le lipopolysaccharide (LPS), qui se trouve dans la paroi cellulaire des bactéries Gram-négatives telles que H. pylori
[3 ]. Deux polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) dans le gène de TLR4, Asp-299 → Gly et Thr-399 → transitions Ile, ont été montré pour mener à hyporéactivité au LPS, réduit la densité épithéliale TLR4 et réduit la réponse de cytokine inflammatoire à LPS [ ,,,0],4]. En outre, des variants génétiques de cytokines sont également essentiels pour la réponse inflammatoire, et plusieurs gènes provenant de différentes voies ont été associés au cancer de l'estomac, y compris interleukine (IL) -1B
, le TNF
, l'IL-10 et
IL-8
[5-7] IL-8 fonctions de cytokine
. comme un chimiotactique puissant pour les neutrophiles et les lymphocytes. Il a été rapporté que IL-8 a augmenté de 10 fois dans les échantillons de cancer de l'estomac en comparaison avec les tissus gastriques normaux. Un SNP T /A bien caractérisé dans le locus -251 a été décrite et associée à une plus grande production d'IL-8 et plusieurs maladies [8-11].
Notre objectif était de déterminer si le
TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile
et les polymorphismes du IL8-251 a /T sont associés à un cancer gastrique distal dans une population mexicaine bien définie.
population des patients de méthodes
Nous avons étudié 78 patients non apparentés avec histologiquement confirmés GC distale (âge moyen = 58.6y, âge médian = 60, tranche d'âge: 22-84, F: M = 0,56). Nous avons également étudié 259 patients sans signes histologiques de GC (moyenne d'âge = 57.1y, âge médian = 54, tranche d'âge = 18-92, F: M = 1,17). Cette population a été décrit précédemment [7]. Tous les patients ont été inscrits à l'hôpital Universitario "Dr. José Eleuterio González", Universidad Autónoma de Nuevo León. Le comité d'éthique local a approuvé l'étude et le consentement éclairé a été obtenu à partir de tous les sujets.
Examens histopathologiques
De tous les patients témoins, huit échantillons de biopsie ont été obtenus pour l'évaluation histologique, deux de la petite courbure, deux de la grande courbure , deux des angularis de incisura, et deux de la région prépylorique. Des patients atteints de GC distale, au moins 8 biopsies ont été obtenues à partir de la tumeur pour une évaluation histologique. Les biopsies de cas et les témoins ont été fixés, enrobés de paraffine et colorées avec l'hématoxyline-éosine. Un pathologiste expérimenté a examiné toutes les lames histologiques.
H. pylori
état
Le statut du H. pylori de la population de contrôle a été déterminé par l'histologie, le test rapide à l'uréase (RUT), la sérologie et la culture . Pour la RUT, une biopsie antrale a été analysé par un test non commercial validé [12]. La biopsie est placée dans un flacon d'essai, mis à incuber à 37 ° C et à lire dans les 24 h. Un changement de couleur de l'orange au magenta indique un résultat positif. Pour les tests sérologiques, on a utilisé une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) pour démontrer la présence d'anticorps IgG comme décrit précédemment [13] de. La culture a été réalisée sur deux corps et deux biopsies de antre par des procédés classiques. Les biopsies ont été placées dans 10% de gélose au sang (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) et mis à incuber à 37 ° C pendant au moins une semaine dans des conditions microaérobies. Les souches ont été identifiées par la coloration de Gram, oxydase, tests catalase et uréase patients de contrôle
. H. pylori ont été considérés comme infectés
quand au moins deux des tests de diagnostic ont été positifs.
La prévalence de H. pylori
l'infection chez les patients atteints d'un cancer gastrique a été déterminée par le résultat de l'histologie seule génotypage
l'ADN génomique de. On extrait à partir du sang périphérique par l'alcool au phénol-chloroforme et précipitation-isoamilic avec la méthode de l'éthanol. Une amplification système de mutation réfractaire (ARMS) -PCR méthode a été utilisée pour le génotype du IL8-251
polymorphisme comme décrit précédemment [14].
Polymorphisme du TLR4 Thr399Ile a été déterminée par PCR-RFLP [15] et le polymorphisme du TLR4 Asp299Gly a été déterminée par un procédé de pyroséquençage conçu pour cette étude. Initialement, une PCR a été réalisée avec les amorces ACT TAG CAT F-GAT TAG ACT LOI ACC TCC ATG et R-CCC TTT CAA TAG TCA CAC TCA CCA GG avec l'amorce inverse biotinylé. Les conditions de PCR étaient les suivantes: 94 ° C pendant 5 min et 40 cycles de 94 ° C, 59 ° C et 72 ° C pendant 30 secondes chacune et une extension finale à 72 ° C pendant 5 min. Pour pyroséquençage, les modèles de PCR biotinylés ont été immobilisés sur des billes Sepahrose paramagnétiques revêtues de streptavidine dans un tampon de liaison. Les complexes de perles modèle ont été lavés par immersion dans l'alcool à 70% et du NaOH 0,5 M et ensuite ajoutés à 45 pi de tampon d'hybridation contenant 15 pmoles de l'amorce de séquençage 5'-CAT GCT ACT ACT ACT ACC TC 3 '. Recuit a eu lieu à 80 ° C pendant 2 min. pyroséquençage en temps réel a été réalisée dans un 96 puits pyrosequencer PSQ SNP 96 (Pyroséquençage AB, Uppsala, Suède) en utilisant des enzymes et des substrats recommandés par le fabricant.
analyse statistique automatisé
Hardy-Weinberg des allèles à des loci particuliers a été évaluée par les statistiques du chi carré. Des différences statistiquement significatives ont été déterminées par t
test de Student, chi-carré ou test exact de Fisher, deux queues. Une probabilité (p) Valeur < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Les odds ratios (OR) avec des intervalles de confiance à 95% (IC) ont été calculés en utilisant le logiciel Epi-Info 2000 (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga.). Trois analyses ont été effectuées, dans laquelle tous les cas et les témoins ont été inclus, un second cas dans lesquels ont été comparés uniquement avec H. pylori
+ contrôles et une troisième analyse dans laquelle les contrôles basés sur la population ont été appariés par âge de 5 ans les groupes d'étude des caractéristiques des résultats du groupe et de genre avec les cas de cancer. et H. pylori
état
La distribution des génotypes selon les résultats histologiques est indiquée sur le tableau 1.Table 1 génotype et allèles de fréquences l'IL-8 251
A /T et TLR-299
et -399
loci dans le non-cancer et des groupes de cancer selon les résultats histologiques

IL8-251 A /T

TLR4 Asp299Gly
TLR4Thr399Ile
Groupe (n)
génotype
allèle
génotype
allèle
génotype
allèle
AA
AT
TT
* A * T

1,1
1,2
* 1 * 2

1 , 1
1,2
* 1 * 2

Gastrite (207)
42
97
68
0.44
0.56
190
17
0.96
0.04
196
11
0.97
0.03
PUD (29) 4
14
11
0,38
0,62
29
0 1
0
27 2
0,97
0,03
AG + IM (23)
5
10 8
0,43
0,57
20 3
0,93
0,07
23
0 1
0
cancer gastrique (78)
16
47
15
0.51
0.49
72
6
0.96
0.04
77
1
0.99
0.01
diffuse type
8
26
8
0.5
0.5
38
4
0.95
0.05
41
1
0.99
0.01
intestinal tapez 8
21
7
0,51
0,49
34 2
0,97
0,03
36
0
1
0
H. pylori
+ (191)
37
90
64
0.43
0.57
175
16
0.96
0.04
181
10
0.97
0.03
Age et le sexe adapté (n = 189)
33
87
69
0.4
0.6
175
14
0,96
0,04
179
10
0,97
0,03
PUD: maladie de l'ulcère gastro-duodénal; AG, gastrite atrophique; IM: métaplasie intestinale
Les fréquences des génotypes au locus individuels étudiés étaient en équilibre Hardy-Weinberg, avec des valeurs de chi carré non significatifs (0,58 pour IL8-251
, 0,42 pour TLR4 Asp299Gly
et 0,17 pour
TLR4 Thr399Ile). Parmi le groupe de contrôle, les 80% avaient une gastrite chronique (tableau 1), 11,2% des patients avaient PUD et 8,8% des patients avaient une gastrite atrophique et /ou métaplasie intestinale. La proportion de l'intestin diffus et le cancer gastrique était de 1,2: 1.
La prévalence de H. pylori dans le
groupe témoin était de 73,7%. Ceci est similaire à la valeur précédemment rapportées pour cette population d'étude [16]. La prévalence de H. pylori
parmi les patients atteints de cancer gastrique était de 53,8% de. L'évaluation du risque de IL8-251
A /T, TLR4 Asp299Gly
et les génotypes de TLR4 Thr399Ile
Nous avons comparé tous les génotypes particuliers pour IL8-251
(AA, AT et TT), pour TLR4 Asp299Gly
(1,1, 1,2 et 2,2) et TLR4 Thr399Ile
(1,1, 1,2 et 2,2) (tableau 1). La fréquence de la IL8-251
AT génotype était plus élevé dans les cas de cancer de l'estomac que dans tous les contrôles, que H. pylori
contrôles positifs et l'âge et le sexe témoins appariés (tableau 2) .Table 2 Odds ratios et 95 intervalles% de confiance pour l'analyse des génotypes des cas de cancer gastrique distal vs
tous les contrôles non-cancéreuses.

IL8-251 * A
IL8-251 AT
TLR-299 * 2
TLR-399 * 2
Tous les cas vs
OR (IC à 95%)
p
OR (IC à 95%)
p
OU 95% CI
p
OU 95% CI
p
Tous les contrôles (n = 259)
2.12 (1,1-4,2)
0,023
1,73 (1-3)
0,049
1 (0,3 à 2,8)
0,82
0,25 (0,01 à 1,8) 0,2

H. pylori
+ contrôles (n = 191)
2.12 (1,1-4,2)
0,029
1,7 (0,96 à 3)
0,068
0,91 (0,3 à 2,6)
0,95
0,24 (0 à 1,8)
0,19
âge et le sexe des contrôles appariés (n = 189)
2,42 (01.02 à 04.08)
0,009
1,78 (1-3.2
0,035
1,04 (0,3 à 3,1)
0,86
0,23 (0 à 1,8)
0,1
évaluation du risque de IL8-251
* A, TLR4 Asp299Gly * 2
et TLR4 Thr399Ile * 2
allèles
Nous avons ensuite comparé les transports de la IL8-251 * A
allèle (homozygote, plus hétérozygote) pour les cas de GC et tout gastrite ainsi que des contrôles normaux. Nous avons trouvé une association de l'IL8 -251 * A
allèle et le développement de GC (OR = 2,12, IC à 95% = 1,1-4,2, p = 0,023) (tableau 2). Lorsque nous avons comparé tous les gastrites, plus normaux contrôles vs types de cancer histologiques
, les risques pour les diffuse et les types de cancer de l'estomac intestinaux étaient similaires mais non significative (OR = 2,15, p = 0,08 et OR = 2,1, p = 0,13 respectivement).
Lorsque nous avons comparé les cas de cancer gastrique avec le H. pylori
+ contrôles nous avons trouvé une valeur similaire (OR = 2,12, IC à 95% = 1,1-4,2, p = 0,029).
ensuite, nous avons comparé la fréquence dans le withage groupe de cancer de l'estomac et de l'égalité des témoins appariés et nous avons trouvé un association plus forte (OR: 2,42, IC à 95% = 01/02 à 04/08, p = 0.0.009).
Nous n'a trouvé aucune association pour TLR4 Asp299Gly * 2
et TLR4 Thr399Ile * 2
Les allèles hyporéactifs.
Discussions et conclusion
la diversité en réponse à l'infection par H. pylori
a été attribuée à plusieurs facteurs. La réponse immunitaire régulée génétiquement semble jouer un rôle crucial dans la détermination de l'intensité des dommages causés à l'hôte [1-3].
Plusieurs auteurs ont décrit la production accrue de IL-8 au cours de H. pylori
infection. Un convertisseur A /T du polymorphisme à la position -251 dans le gène a été associée à une activité plus élevée de cette interleukine récemment, cet allèle a été lié dans deux études sur le développement d'un cancer gastrique chez la population japonaise [10, 11]. Dans une de ces études, le IL8-251 AA
génotype tenu un risque plus élevé de gastrite atrophique (OR = 2,35; 95% CI = 1,12 à 4,94) et le cancer gastrique (OR = 2,22; IC à 95% = 1.08- 4,56) par comparaison avec le génotype TT. Ils ont étudié 252 contrôles sains, 215 personnes souffrant de gastrite atrophique, et 396 patients atteints de cancer gastrique. L'AA et AT génotypes étaient significativement associés à des niveaux plus élevés de protéines IL8, plus sévère infiltration de neutrophiles par rapport au génotype TT. Dans l'autre étude, l'IL-8 -251
* Un allèle a été associée à un risque plus élevé de cancer gastrique (OR = 2,1, IC à 95% = 1,38 à 2,92). Nos résultats ont montré aucune association entre les taux plus élevés de GC et le génotype AA, mais une association positive a été trouvée pour le génotype AT et le transport d'au moins une copie de l'allèle * A (hétérozygote homozygote plus). Il est remarquable que la valeur de ORs observée dans notre étude (2.12) était tout à fait similaire à celle observée dans la population japonaise (2.1).
L'IL-1B-31 C /T
polymorphisme a été associée au développement du cancer gastrique et une différence géographique ethnique a été décrit pour ce locus, avec une association plus forte du polymorphisme occidentale que dans la population orientale. Les résultats pour l'IL-8-251
A /T polymorphisme en corrélation avec les données antérieures présentées pour la population japonaise, montrant aucune tendance à la variation géographique ou ethnique.
Il est actuellement en suspens si un LPS hyporéactifs voie de signalisation est bénéfique ou nuisible à l'hôte. Les personnes ayant des polymorphismes de l'hyporéactifs TLR4 ont montré des niveaux réduits de circulation des cytokines inflammatoires, un risque accru d'infections bactériennes aiguës et une tendance à la hausse de la mortalité. D'autres études récentes soutiennent l'hypothèse que les polymorphismes peu fonctionnels TLR4
peuvent entraîner une réponse inflammatoire réduite associée à une infection à faible endommagement qui favorisera une infection persistante [17-20]. Dans cette étude, on n'a pas trouvé d'association entre GC et polymorphismes TLR4, ce qui suggère qu'ils ne contribuent pas au développement du cancer gastrique distal. Les deux TLR4 Asp299Gly
et Thr399Ile de les polymorphismes ont été rapportés en déséquilibre de liaison (LD) [21, 22], mais nous avons décidé de génotype la fois parce que nous ne savions pas si elles étaient en LD dans notre population.
En conclusion, nos résultats préliminaires suggèrent que IL8-251
est un polymorphisme modificateur de la maladie biologiquement plausible. Déclarations de cas confirmés dans plusieurs populations, comme cela a été en japonais, et maintenant des groupes mexicains, ce site polymorphique, en conjonction avec d'autres, pourrait être utilisé pour identifier les patients à risque plus élevé de GC, qui peuvent avoir besoin une surveillance plus étroite.
intérêts concurrents
L'auteur (s) déclarent avoir aucun conflit d'intérêts.

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