Arylkolvätereceptor vägsaktivering förbättrar magcancer cell invasiv troligen genom en c-Jun-beroende induktion av matrix metalloproteinas-9

Arylkolvätereceptor vägsaktivering förbättrar magcancer cell invasiv troligen genom en c-Jun-beroende induktion av matrix metalloproteinas-9 Bild Sammanfattning
Bakgrund
Abberant arylkolvätereceptor (AhR) uttryck och AhR vägsaktivering är involverade i gastric carcinogenesis. Det är dock fortfarande oklart förhållandet mellan AhR vägen aktivering och magcancer progression. I denna studie använde vi 2,3,7,8-tetraklor-para-dioxin (TCDD), en klassisk och mest potenta ligand Ahr att aktivera AhR vägen och undersökte effekten av AhR väg aktivering på människors magcancer AGS cell invasion och utforskade motsvarande mekanism.
Resultat
att bestämma huruvida AhR vägen kan aktiveras i AGS celler, undersökte vi uttrycket av CYP1A1, en klassisk målgen Ahr vägen, efter TCDD exponering. RT-PCR och Western blot-analys visade att både CYP1A1 mRNA och proteinuttryck ökades i en dosberoende sätt efter TCDD behandling och AhR antagonist resveratrol (RSV) kan vända denna TCDD-inducerad CYP1A1 uttryck. För att bestämma huruvida TCDD behandling av AGS-celler resulterar i en induktion av MMP-9 uttryck, detekterade vi MMP-9-mRNA med användning av RT-PCR och detekterades MMP-9 enzymatisk aktivitet med användning av gelatin zymografi. Resultaten visade att både MMP-9-mRNA-expression och enzymatisk aktivitet gradvis ökade med koncentrationsökningen av TCDD i media och dessa förändringar kan vändas genom RSV behandling i en dosberoende sätt. För att undersöka huruvida AhR aktiveringsinducerat MMP-9 uttryck och aktivitet i AGS celler resulterar i ökad migration och invasion, genomförde vi sårläkningsmigrationsanalys och transwell migration och invasion analys. Efter TCDD behandlingen ades migrationsavstånd och migration och invasion förmåga AGS-celler ökade med en dosberoende sätt. För att demonstrera AhR aktiveringsinducerat MMP-9 uttryck medieras av c-Jun, var siRNA transfektion utfördes för att tysta c-Jun mRNA i AGS celler. Resultaten visade att MMP-9-mRNA-expression och aktivitet i obehandlade kontroll AGS celler var mycket svag; Efter TCDD (10 nmol /L) behandling, var signifikant ökad MMP-9-mRNA-expression och aktivitet; Detta TCDD-inducerad MMP-9 uttryck och aktivitetsökning skulle kunna avskaffas genom c-Jun siRNA transfektion.
Slutsats
AhR vägsaktivering förbättrar magcancer cell invasiv troligen genom en c-Jun-beroende induktion av MMP-9. Våra resultat ger en inblick i mekanismen och funktion AhR vägen och dess inverkan på magcancer progression.
Bakgrund
arylkolvätereceptor (AhR) är en ligand-aktiverade transkriptionsfaktor i den grundläggande helix-loop-helix /per-Arnt-Sim familj. I frånvaro av ligand, är AhR närvarande i cytosolen i form av ett komplex med två kaperon Hsp90s, en smal protein (p23), och en immunofilin-liknande protein (XAP2) [1, 2]. Vid ligand såsom 2,3,7,8-tetraklor-para-dioxin (TCDD, den mest potenta och klassisk exogena AhR ligand) bindning, de chaperon proteiner dissociera och AhR translokeras in i kärnan för att bilda en heterodimer med sin partner molekyl aryl kolväte receptor nukleär transloka (Arnt) [3, 4]. Denna heterodimer binder till den specifika DNA-region benämnd dioxin responselement (DRE), som har en kärnsekvens av 5'-TNGCGTG-3 ', och därmed aktiverar ett batteri av gener uttryck [5-7].
Historiskt studier av AhR pathway har fokuserat på transkriptionell reglering av gener som kodar xenobiotiska metaboliserande enzymer såsom cytokrom P450-enzymer [8]. Nya studier har visat en nära relation mellan AhR och bröstkörteltumörbildning [7, 9]. AhR gen polymorfismer har kopplats till en ökad risk för lung- och bröstcancer [10, 11]. Ökat uttryck av AhR har rapporterats i lung-, bröst-, och pankreascancer hos människor [7, 12, 13]. Studier tyder också på att konstitutivt aktiv AhR kan främja hepatocarcinogenesis i möss [14]. Dessa data indikerade en nära relation mellan AhR och tumörbildning. Dock är inte klart förhållandet mellan AhR och tumörprogression.
Tumörceller invasion och metastas är en komplicerad process, bland vilka nedbrytning av extracellulär matrix (ECM) och basalmembranet är ett avgörande steg. Tumörinvasion och metastas är beroende av expressionen av matrismetalloproteinaser (MMP: er) för att förstöra ECM och basalmembranet för att tillåta cellmigration. MMP är en grupp av zinkberoende metallopeptidases [15-17]. Matrismetalloproteinas-9 (MMP-9) är en av de typ IV kollagenas /gelatinaser, som bryter ned basalmembrankollagener och gelatin [16]. MMP-9 är allmänt associerade med tumörinvasion och metastas [17]. Syntesen av MMP-9 regleras av flera tillväxtfaktorer, cytokiner och hormoner [16, 18]. Färsk studie kopplade TCDD-associerade lesioner med avvikande matrismetabolism [8]. Microarray data visar att TCDD /AhR förändra uttryck av gener involverar i matrismetabolism och deponering [8]. Villano et al [19] och Haque et al [18] rapporterade att AhR agonisten TCDD kunde inducera MMP-9-expression i huamn melanomceller och prostatacancerceller. Dessa studier tyder på att MMP-9 uttryck kan vara en gemensam slutpunkt för aktivering av AHR vägen [8, 19].
Gastric cancer är den fjärde vanligaste malignitet och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i värld [20]. Gastric cancerceller invasion och metastas leder ofta till en dålig prognos. Flera studier kopplat AhR väg aktivering till gastric cancer. Chen m.fl. fann ökat uttryck av AhR i två humana gastriska cancercellinjer (RF1 och RF48) genom microarray analys [21]. Ma et al rapporterade att samtidig expression av AhR och CYP1A1 är korrelerad med magcancer utveckling [22]. Andersson et al fann att konstitutivt aktiverad AhR kunde framkalla magen tumörer i en transgen musmodell [23]. I en annan av våra studier fann vi att AhR uttryck och nukleär translokation var signifikant högre i magcancer än i premaligna lesioner och normal magslemhinna [24]. Emellertid är förhållandet mellan AhR vägen aktivering och magcancer invasion och metastaser fortfarande oklart. Därför undersökte vi effekten av AhR vägsaktivering på humana gastriska cancerceller. Våra data som presenteras här visar att AhR vägen kan aktiveras i magcancer AGS celler och AhR väg aktivering i AGS celler inducerar MMP-9 uttryck och förbättrar AGS celler migration och invasion aktivitet. Vidare våra data visar att denna AhR aktiveringsinducerat MMP-9 expression medieras av c-juni
Resultat och diskussion
AhR vägsaktivering i AGS-celler
I en annan av våra studier har vi visat att det var en hög nivå av AhR uttryck i AGS celler [24]. För att bestämma huruvida AhR vägen kan aktiveras i denna cellinje, undersökte vi uttrycket av cytokrom P-450 1A1 (CYP1A1), en klassisk målgen Ahr vägen, efter AhR agonist TCDD exponering. RT-PCR och Western blot-analys visade att både CYP1A1-mRNA (Fig. 1 A) och protein (Fig. 1B) expression i AGS-celler ökas på ett dosberoende sätt efter TCDD behandling. För att avgöra om detta TCDD-inducerad CYP1A1 uttryck är AhR beroende var AhR antagonist resveratrol (RSV) används för att blockera AhR väg. Såsom visas i fig. 1C och 1D, RSV kunde vända TCDD-inducerad CYP1A1 uttryck i en dosberoende sätt. Dessa data visade att AhR vägen kan aktiveras i AGS-celler med TCDD. Figur 1 AhR agonisten TCDD och AhR antagonist RSV regleras CYP1A11 expression i AGS-celler. Efter olika koncentrationer (som visas ovan) av TCDD behandling under 24 timmar, (A) RT-PCR-analys av CYP1A1-mRNA-uttryckning i en koncentration-respons. (B) Western blot-analys av CYP1A1 proteinuttryck på ett koncentrationssvar. Efter samtidig behandling med TCDD (1 nM) och RSV (vid olika koncentrationer såsom visas ovan) under 24 timmar, (C) mRNA-expression av CYP1A1 detekterades genom RT-PCR. (D) Protein expression av CYP1A1 detekterades med Western blöt.
AhR vägsaktivering i AGS-celler inducerar MMP-9 expression
Tidigare studier har visat att det i flera cancerceller, aktiverar AhR agonist TCDD exponering MMP-9-genexpression [18, 19]. För att bestämma huruvida TCDD behandling av AGS-celler resulterar i en induktion av MMP-9 uttryck, detekterade vi MMP-9-mRNA med användning av RT-PCR efter TCDD-exponering. Såsom visas i fig. 2A, var MMP-9-mRNA-expression induceras i ett dosberoende sätt efter TCDD behandling. Att undersöka betydelsen av Ahr vägen i att medla TCDD-inducerad MMP-9 uttryck i AGS-celler, var co-behandlad med TCDD och Ahr antagonisten resveratrol kulturer. Samtidig behandling med resveratrol avskaffas TCDD-inducerad MMP-9-expression (fig. 2C) visade att TCDD-aktivering av MMP-9 uttryck är beroende av AhR reaktionsvägen. Ovanstående data indikerar att AhR väg aktivering i AGS-celler inducerar MMP-9-mRNA-expression. I de flesta celltyper, är genen transkription av MMP-9 inducerbar, och efter translation enzymet omedelbart utsöndras och aktiverats genom cystein-omkopplingsmekanismen [25]. För att avgöra om dessa förändringar i genuttryck efter AhR vägsaktivering resulterar i förändringar i MMP-9 enzymatisk aktivitet, utförde vi gelatin zymografi. Resultaten visade att MMP-9-aktivitet i media gradvis ökas med koncentrationsökningen av TCDD i media (fig. 2B) och dessa förändringar kan vändas genom resveratrol behandling i en dosberoende sätt (fig. 2D). Dessa data visar att AhR vägsaktivering-inducerad ökning av MMP-9 expression korrelerar med en ökning av MMP-9-aktivitet. Figur 2 AhR agonist TCDD och AhR antagonist RSV regleras MMP-9 uttryck och aktivitet i AGS celler. Efter olika koncentrationer (som visas ovan) av TCDD behandling under 24 timmar, (A) RT-PCR-analys av MMP-9-mRNA-expression i en koncentration-respons. (B) Gelatin zymografi analys av MMP-9-protein-aktivitet på ett koncentrationssvar. Efter samtidig behandling med TCDD (1 nM) och RSV (vid olika koncentrationer såsom visas ovan) under 24 timmar, (C) mRNA-uttryck av MMP-9 detekterades med RT-PCR. (D) Protein aktivitet av MMP-9 detekterades genom gelatin-zymografi.
AhR vägsaktivering förbättrar AGS celler migration och invasion
MMP-9 är en av den typ IV-kollagenas /gelatinaser som kan försämra ECM-komponenter. MMP-9 är allmänt associerade med tumörinvasion och metastas [17]. Studier har visat en signifikant korrelation mellan MMP-9 uttryck och invasiv och lymfkörtel metastas av gastric karcinom [26-28]. För att undersöka huruvida AhR aktiveringsinducerat MMP-9 uttryck och aktivitet i AGS celler resulterar i ökad migration och invasion, genomförde vi sårläkningsmigrationsanalys och transwell migration och invasion analys. Efter TCDD behandlingen bedömdes migreringsavstånd från AGS-celler ökade signifikant med en dos-beroende sätt vid jämförelse med kontrollceller (P < 0,01) (fig. 3A). Transwell Resultaten visade en signifikant ökning av migration (fig 3B.) Och invasion (fig 3C.) Förmågor av AGS-celler när cellerna inkuberades med TCDD i koncentrationer från 0,1 nmol /L (P < 0,01) och 100 nmol /l ( p < 0,01). ingen signifikant effekt på migrationen och invasion hittades på TCDD koncentration < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Dessa resultat visade att AhR vägsaktivering förbättrar magcancer AGS celler migration och invasion. Nedbrytning av ECM och basalmembranet är ett väsentligt steg vid tumörinvasion och metastas. Den involverar verkan av matrix-metalloproteinaser (MMP). Vår studie visade att AhR vägsaktivering kan inducera MMP-9 uttryck och enzymatisk aktivitet, och främja AGS celler migration och invasion. Andra studier tyder på att AhR vägsaktivering kan inducera en mängd MMP uttryck [19, 29]. AhR vägsaktivering förbättrar magcancer AGS celler migration och invasion kan också vara på grund av andra MMP uttryck förutom MMP-9 uttryck. Figur 3 Effekten av AhR agonist TCDD på AGS celler migration och invasion. (A) sårläkning migrationsanalys. (B) Transwell migration analys. (C) Transwell invasionsanalys.
C-Jun-medierad MMP-9 expression inducerad av AhR vägsaktivering
Mekanismen för TCDD-inducerade förändringar i MMP-9 uttryck är inte helt klar. Nyligen genomförda studier rapporterade att TCDD kan inducera c-Jun uttryck [30, 31] och c-Jun är en målgen av AhR väg [8]; promotorsekvensen i 5'-flankerande regionen av humant MMP-9-genen innehåller c-Jun bindningsställen [16] och c-Jun kan induceras MMP-9 uttryck [32]; transkriptionsaktiviteten för c-Jun är signifikant förbättrad i magcancer [33]. På basis av dessa studieresultat föreslog vi en hypotes att TCDD-inducerad MMP-9 uttryck i AGS celler medieras av c-juni För att demonstrera denna hypotes, först detekterade vi c-Jun-expression i AGS-celler efter TCDD behandling, och fann att expression i AGS-celler både c-Jun-mRNA (fig. 4A och 4C) och protein (fig. 4B och 4D) ökades i en dos (fig. 4A och 4B) och tid (fig. 4C och 4D) beroende sätt efter TCDD behandling, och denna TCDD-inducerad c-Jun uttryck kan reserveras av AhR antagonist resveratrol (fig. 4E och 4F). Ovanstående data visar att c-Jun är en målgen av AhR väg i AGS celler. För att ytterligare demonstrera att c-Jun kan förmedla TCDD-inducerad MMP-9 uttryck, var siRNA transfektion utfördes för att tysta c-Jun mRNA i AGS celler. Resultaten visade att c-Jun-siRNA (slutlig koncentration 50 nmol /L) transfektion nästan fullständigt avskaffas c-Jun-expression i AGS-celler både i mRNA-nivå (fig. 4G) och i proteinnivån (fig. 4H). Därför, efter c-Jun siRNA transfektion i 48 timmar, fick AGS celler behandlade med TCDD vid koncentration 10 nmol /L under 24 timmar, cellpelleten och odlingsmedia uppsamlades, och MMP-9-mRNA-expression och aktivitet mättes. Såsom visas i fig. 4I och 4J, MMP-9-mRNA-expression och aktivitet i obehandlade kontroll AGS celler var mycket svag; Efter TCDD (10 nmol /L) behandling, var signifikant ökad MMP-9-mRNA-expression och aktivitet; Detta TCDD-inducerad MMP-9 uttryck och aktivitetsökning skulle kunna avskaffas genom c-Jun siRNA transfektion och inte påverkas av kontroll siRNA transfektion. Ovanstående data visar att c-Jun-medierad MMP-9 uttryck induceras av AhR väg aktivering i AGS celler. Figur 4 c-Jun förmedlar TCDD-inducerad MMP-9 uttryck och aktivitet. (A) TCDD inducerar c-Jun mRNA-expression på ett dos-beroende sätt. (B) TCDD inducerar c-Jun-proteinuttryck på ett dos-beroende sätt. (C) TCDD inducerar c-Jun mRNA-expression på ett tidsberoende sätt. (D) TCDD inducerar c-Jun-proteinuttryck på ett tidsberoende sätt. (E) RSV vänder TCDD-inducerad c-Jun mRNA-expression. (F) RSV vänder TCDD-inducerad c-Jun-proteinuttryck. (G) c-Jun siRNA tystar c-Jun-mRNA-expression. (H) c-Jun siRNA tystar c-Jun-proteinexpression. (I) c-Jun siRNA hämmar TCDD-inducerad MMP-9-mRNA-expression. (J) c-Jun siRNA hämmar TCDD-inducerad MMP-9 aktivitet ökar.
Slutsats
Sammanfattningsvis den aktuella studien visar att AhR vägen kan aktiveras i magcancer AGS celler och AhR väg aktivering inducerar MMP-9 uttryck och aktivitet som i slutändan bidrar till AGS migration och invasion in vitro. Vidare visar våra data att denna AhR aktiveringsinducerat MMP-9 expression medieras av c-juni Eftersom nedbrytning av ECM och basalmembranet är ett viktigt steg i tumörinvasion och metastas, våra resultat ge insikt i mekanismen och funktion AhR vägen och dess inverkan på dessa processer under magcancer progression.
Metoder
Cellodling
Magcancer cellinjen AGS erhölls från American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) och upprätthölls i RPMI 1640-medium (Hyclone) kompletterat med 2 mM glutamin, 10% fetalt bovint serum (Hyclone), 100 enheter /ml penicillin och 100

• Villkorlig överlevnadsanalys i koreanska patienter med magcancer genomgår botande gastrektomi
• Genomförbarheten av förbättrad återhämtning efter kirurgi i magoperationer: en retrospektiv study