Arile attivazione del recettore di idrocarburi via migliora gastrica invasività delle cellule tumorali probabilmente attraverso una induzione c-Jun-dipendente della metalloproteinasi della matrice-9

attivazione del recettore arilico percorso migliora gastrica invasività delle cellule tumorali probabilmente attraverso una induzione c-Jun-dipendente della metalloproteinasi della matrice-9
Abstract
sfondo
Abberant recettore arilico (AhR) espressione e l'attivazione della via AhR sono coinvolti in carcinogenesi gastrica. Tuttavia, la relazione tra l'attivazione della via AhR e la progressione del cancro gastrico è ancora chiaro. Nel presente studio, abbiamo utilizzato 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-para-diossina (TCDD), un ligando classico e più potente di AhR, per attivare AhR percorso e studiato l'effetto del percorso di attivazione AhR sul cancro gastrico umano cellule AGS invasione e esplorato il meccanismo corrispondente.
Risultati
Per determinare se AhR percorso può essere attivata nelle cellule AGS, abbiamo esaminato l'espressione di CYP1A1, un gene bersaglio classico della AhR percorso, a seguito di esposizione TCDD. RT-PCR e western blot hanno dimostrato che sia CYP1A1 mRNA e l'espressione della proteina sono stati aumentati in modo dose-dipendente in seguito al trattamento TCDD e AhR antagonista resveratrolo (RSV) potrebbe invertire questa espressione CYP1A1 TCDD-indotta. Per determinare se il trattamento TCDD di AGS cellule risultati in una induzione di MMP-9 espressione, abbiamo rilevato MMP-9 mRNA con RT-PCR e rilevata MMP-9 attività enzimatica utilizzando la gelatina zimografia. I risultati hanno mostrato che sia MMP-9 espressione di mRNA e l'attività enzimatica sono state gradualmente aumentata con l'aumento della concentrazione TCDD in media e tali cambiamenti potrebbero essere invertiti mediante trattamento RSV in modo dose-dipendente. Per esaminare se AhR attivazione-indotta MMP-9 espressione e l'attività in cellule AGS si traduce in aumento della migrazione e l'invasione, abbiamo eseguito la guarigione della ferita test di migrazione e transwell saggio di migrazione e l'invasione. Dopo il trattamento TCDD, la distanza di migrazione e la migrazione e l'invasione capacità delle cellule AGS sono stati aumentati con un modo dose-dipendente. Per dimostrare AhR attivazione indotta MMP-9 espressione è mediata da c-Jun, siRNA trasfezione è stata eseguita per mettere a tacere c-Jun mRNA nelle cellule AGS. I risultati hanno mostrato che MMP-9 espressione di mRNA e l'attività nelle cellule AGS controllo non trattato erano molto deboli; Dopo TCDD (10 nmol /L) trattamento, MMP-9 espressione e l'attività di mRNA erano significativo aumento; Questo MMP-9 espressione e l'attività aumento TCDD-indotta potrebbe essere abolito da c-Jun siRNA transfection.
Conclusione
attivazione della via AhR migliora gastrica invasività delle cellule tumorali probabilmente attraverso una induzione c-Jun-dipendente di MMP-9. I nostri risultati forniscono informazioni nel meccanismo e la funzione della via AhR e il suo impatto sulla progressione del cancro gastrico.
Sfondo
arilico recettore (AhR) è un fattore di trascrizione ligando-attivato del elica-ansa-elica /per-Arnt-Sim famiglia. In assenza di ligando, Ahr è presente nel citosol in forma di un complesso con due chaperone Hsp90s, una proteina Smal (p23), e una proteina immunofillina-like (XAP2) [1, 2]. Su legante come la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-para-diossina (TCDD, il più potente e classica esogeno AhR ligando) vincolante, le proteine ​​chaperon dissociano e AhR traslocano nel nucleo per formare un eterodimero con il suo partner di arile molecola recettore idrocarburi traslocatore nucleare (ARNT) [3, 4]. Questo eterodimero si lega alla regione DNA specifico elemento definito risposta diossina (DRE), che ha una sequenza nucleo di 5'-TNGCGTG-3 ', e quindi attiva una batteria di espressione geni [5-7].
Storicamente, studi di AhR percorso si sono concentrati sulla regolazione della trascrizione di geni che codificano enzimi del metabolismo xenobiotici come gli enzimi del citocromo P450 [8]. Recenti studi hanno dimostrato una stretta relazione tra AhR e della ghiandola mammaria tumorigenesi [7, 9]. polimorfismi del gene AhR sono stati collegati ad un aumento del rischio di polmone e della mammella [10, 11]. Aumentata espressione di AhR stato segnalato nel polmone, della mammella e del pancreas negli esseri umani [7, 12, 13]. Gli studi suggeriscono anche che costitutivamente attivo AhR può promuovere epatocarcinogenesi nei topi [14]. Questi dati hanno indicato una stretta relazione tra AhR e tumorigenesi. Tuttavia, il rapporto tra AhR e la progressione del tumore non è chiaro. Le cellule tumorali
invasione e metastasi è un processo complicato, tra cui il degrado della matrice extracellulare (ECM) e membrana basale è un passo cruciale. Tumore invasione e metastasi si basa sull'espressione delle metalloproteinasi di matrice (MMP) per distruggere la membrana ECM e cantina per consentire la migrazione delle cellule. MMP sono un gruppo di metallopeptidasi zinco dipendente [15-17]. Metalloproteinasi della matrice-9 (MMP-9) è uno dei collagenasi del IV tipo /gelatinasi, che degradano collagene membrana basale e gelatine [16]. MMP-9 è generalmente associata con l'invasione del tumore e metastasi [17]. La sintesi di MMP-9 è regolata da diversi fattori di crescita, citochine e ormoni [16, 18]. studio lesioni TCDD-associata recenti collegate con il metabolismo matrice aberrante [8]. dati microarray dimostrano che TCDD /AhR alterare l'espressione di geni coinvolgere nel metabolismo della matrice e la deposizione [8]. Villano et al [19] e Haque et al [18] hanno riferito che AhR agonista TCDD potrebbe indurre MMP-9 espressione in cellule di melanoma huamn e le cellule di cancro alla prostata. Questi studi suggeriscono che l'espressione di MMP-9 può essere un endpoint comune per l'attivazione della via AhR [8, 19].
Cancro gastrico è la quarta neoplasia più comune e la seconda causa più frequente di morte per cancro nel mondo [20]. Gastrico cellule tumorali invasione e metastasi spesso portano ad una prognosi sfavorevole. Diversi studi legati attivazione della via AhR di carcinogenesi gastrica. Chen et al trovato un aumento di espressione AhR in due linee di cellule di cancro gastrico umano (RF1 e RF48) mediante analisi microarray [21]. Ma et al ha riportato che l'espressione simultanea di AhR e CYP1A1 è correlata con lo sviluppo del cancro gastrico [22]. Andersson et al hanno scoperto che costitutivamente attivato AhR potrebbe indurre tumori allo stomaco in un modello di topo transgenico [23]. In un altro dei nostri studi, abbiamo scoperto che l'espressione AhR e traslocazione nucleare erano significativamente più alta nel carcinoma gastrico che nelle lesioni precancerose e normale mucosa gastrica [24]. Tuttavia, la relazione tra l'attivazione della via AhR e gastrica invasione del cancro e metastasi non è ancora chiaro. Pertanto, abbiamo studiato l'effetto di attivazione della via AhR su cellule di cancro gastrico umano. I nostri dati qui presentati dimostrano che AhR percorso può essere attivato nelle cellule di cancro gastrico AGS e via di attivazione AhR nelle cellule AGS induce MMP-9 espressione e migliora le cellule AGS migrazione e l'attività invasione. Inoltre, i nostri dati mostrano che questa attivazione indotta MMP-9 espressione AhR è mediata da c-giugno
Risultati e discussione
attivazione della via AhR nelle cellule AGS
In un altro dei nostri studi abbiamo dimostrato che non ci era un alto livello di espressione in cellule AhR AGS [24]. Per determinare se AhR percorso può essere attivata in questa linea cellulare, abbiamo esaminato l'espressione del citocromo P-450 1A1 (CYP1A1), un gene bersaglio classico della AhR percorso, a seguito di esposizione AhR agonista TCDD. RT-PCR e analisi western blot hanno dimostrato che sia espressione CYP1A1 mRNA (Fig. 1A) e proteine ​​(Fig. 1B) in cellule AGS sono stati aumentati in modo dose-dipendente dopo il trattamento TCDD. Per determinare se questa espressione CYP1A1 TCDD-indotta è Ahr-dipendente, Ahr antagonista resveratrolo (RSV) è stato utilizzato per bloccare AhR percorso. Come mostrato in Fig. 1C e 1D, RSV potrebbe invertire espressione CYP1A1 TCDD indotta in maniera dose-dipendente. Questi dati hanno dimostrato che AhR percorso può essere attivato nelle cellule AGS di TCDD. Figura 1 AhR agonisti TCDD e AhR antagonista RSV CYP1A11 regolata espressione in cellule AGS. Dopo diverse concentrazioni (come mostrato sopra) di trattamento TCDD per 24 ore, (A) analisi RT-PCR dell'espressione CYP1A1 mRNA in concentrazione-risposta. (B) Analisi Western Blot di espressione della proteina CYP1A1 in una concentrazione-risposta. Dopo co-trattamento con TCDD (1 nM) e RSV (a differenti concentrazioni come mostrato sopra) per 24 ore, (C) espressione di mRNA di CYP1A1 è stata rilevata mediante RT-PCR. (D) l'espressione della proteina del CYP1A1 è stato rilevato dal Western Blot.
AhR via di attivazione nelle cellule AGS indurre MMP-9 espressione
Studi precedenti hanno dimostrato che in diversi cellule tumorali, Ahr esposizione agonista TCDD attiva MMP-9 espressione genica [18, 19]. Al fine di determinare se il trattamento TCDD di AGS cellule risultati in una induzione di MMP-9 espressione, abbiamo rilevato MMP-9 mRNA mediante RT-PCR dopo l'esposizione TCDD. Come mostrato in fig. 2A, MMP-9 mRNA è stata indotta in maniera dose-dipendente dopo il trattamento TCDD. Per esaminare il ruolo della via AhR nel mediare TCDD-indotta MMP-9 espressione in cellule AGS, le culture sono stati co-trattati con TCDD e l'antagonista resveratrolo AhR. Co-trattamento con resveratrolo abolita TCDD indotta MMP-9 (fig. 2C) dimostrarono che TCDD-attivazione di MMP-9 espressione dipende dal percorso AhR. dati di cui sopra indicano che l'attivazione AhR percorso in cellule AGS induce MMP-9 espressione di mRNA. Nella maggior parte dei tipi di cellule, la trascrizione del gene di MMP-9 è inducibile, e dopo la traduzione l'enzima viene subito secreta e attivato attraverso il meccanismo cisteina-interruttore [25]. Per determinare se questi cambiamenti nell'espressione genica seguente risultato attivazione AhR percorso a cambiamenti nella MMP-9 attività enzimatica, abbiamo eseguito la gelatina zimografia. I risultati hanno mostrato che MMP-9 attività multimediale viene gradualmente aumentata con l'aumento della concentrazione TCDD in mezzi (fig. 2B) e questi cambiamenti potrebbe essere invertita mediante trattamento resveratrolo in modo dose-dipendente (fig. 2D). Questi dati dimostrano che AhR pathway attivazione indotta aumento MMP-9 espressione correla con un aumento di MMP-9 attività. Figura 2 AhR agonisti TCDD e AhR RSV antagonista regolati MMP-9 espressione e l'attività in cellule AGS. Dopo diverse concentrazioni (come mostrato sopra) di trattamento TCDD per 24 ore, (A) analisi RT-PCR di MMP-9 espressione di mRNA in concentrazione-risposta. (B) Analisi gelatina zimografia di attività della proteina MMP-9 in una concentrazione-risposta. Dopo co-trattamento con TCDD (1 nM) e RSV (a differenti concentrazioni come mostrato sopra) per 24 ore, (C) mRNA espressione di MMP-9 è stato rilevato mediante RT-PCR. (D) l'attività della proteina di MMP-9 è stato rilevato da gelatina zimografia.
Attivazione della via AhR migliora la migrazione delle cellule AGS e l'invasione
MMP-9 è uno di tipo IV collagenasi /gelatinasi che possono degradare le componenti ECM. MMP-9 è generalmente associata con l'invasione del tumore e metastasi [17]. Gli studi hanno dimostrato una correlazione significativa tra MMP-9 espressione e di invasività e metastasi linfonodali di carcinomi gastrici [26-28]. Per esaminare se AhR attivazione-indotta MMP-9 espressione e l'attività in cellule AGS si traduce in aumento della migrazione e l'invasione, abbiamo eseguito la guarigione della ferita test di migrazione e transwell saggio di migrazione e l'invasione. Dopo il trattamento TCDD, la distanza di migrazione delle cellule AGS era significativamente aumentata con modo dose-dipendente rispetto alle cellule di controllo (P < 0.01) (fig. 3A). Risultati Transwell mostrato un aumento significativo della migrazione (fig. 3b) e l'invasione (fig 3C.) capacità di cellule AGS quando le cellule sono state incubate con TCDD in concentrazioni da 0,1 nmol /L (P < 0,01) a 100 nmol /l ( p < 0,01). nessun effetto significativo sulla migrazione e l'invasione è stata trovata a TCDD concentrazione < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Questi risultati hanno dimostrato che l'attivazione AhR percorso aumenta il cancro gastrico AGS cellule migrazione e l'invasione. Degradazione della ECM e membrana basale è un passo essenziale per l'invasione del tumore e metastasi. Esso comporta l'azione della metalloproteinasi della matrice (MMP). Il nostro studio ha dimostrato che l'attivazione della via AhR potrebbe indurre MMP-9 espressione e l'attività enzimatica, e promuovere AGS cellule migrazione e l'invasione. Altri studi hanno indicato che l'attivazione della via AhR potrebbe indurre una varietà di espressione MMP [19, 29]. attivazione della via AhR migliora cancro gastrico AGS migrazione delle cellule e l'invasione può essere dovuta anche ad altre MMP espressione oltre MMP-9 espressione. Figura 3 L'effetto della AhR agonisti TCDD su AGS cellule migrazione e l'invasione. (A) Ferita guarigione test di migrazione. test di migrazione (B) Transwell. (C) saggio di invasione Transwell.
C-Jun mediata MMP-9 espressione indotta da attivazione della via AhR
Il meccanismo delle variazioni TCDD-indotta in MMP-9 espressione non è del tutto chiaro. Recenti studi hanno riportato che TCDD può indurre l'espressione di c-Jun [30, 31] e c-Jun è un gene bersaglio di AhR percorso [8]; la sequenza del promotore nella regione 5'-flanking di MMP-9 gene umano contiene c-Jun siti di legame [16] e c-Jun può indotta MMP-9 espressione [32]; l'attività di trascrizione di c-Jun è significativa maggiore di cancro gastrico [33]. Sulla base di questi risultati dello studio, abbiamo proposto una ipotesi che TCDD-indotta MMP-9 espressione in cellule AGS è mediata da c-giugno Per dimostrare questa ipotesi, in primo luogo abbiamo rilevato l'espressione c-Jun nelle cellule AGS in seguito al trattamento TCDD, verificando che sia c-Jun mRNA (fig. 4A e 4C) e di proteine ​​(fig. 4B e 4D) espressione in cellule AGS sono stati aumentati in una dose (fig. 4A e 4B) ed il tempo (fig. 4C e 4D) modo dipendente dopo il trattamento TCDD, e questa espressione c-Jun TCDD indotta potrebbero essere riservati AhR antagonista resveratrolo (fig. 4E e 4F). Sopra i dati hanno dimostrato che c-Jun è un gene bersaglio della via AhR nelle cellule AGS. Per dimostrare ulteriormente che c-Jun può mediare MMP-9 espressione TCDD-indotta, siRNA trasfezione è stata eseguita per mettere a tacere c-Jun mRNA nelle cellule AGS. I risultati hanno dimostrato che c-Jun siRNA (concentrazione finale 50 nmol /L) trasfezione quasi completamente abolita l'espressione di c-Jun nelle cellule AGS, sia a livello di mRNA (fig. 4G) e del livello delle proteine ​​(fig. 4H). Pertanto, dopo c-Jun siRNA transfection per 48 ore, le cellule AGS sono stati trattati con TCDD in concentrazione del 10 nmol /L per 24 ore, pellet e terreni di coltura sono stati raccolti, e MMP-9 espressione e l'attività di mRNA sono stati misurati. Come mostrato in fig. 4I e 4J, MMP-9 espressione di mRNA e l'attività delle cellule AGS di controllo non trattati erano molto deboli; Dopo TCDD (10 nmol /L) trattamento, MMP-9 espressione e l'attività di mRNA erano significativo aumento; Questo MMP-9 espressione e l'attività aumento TCDD-indotta potrebbe essere abolito da c-Jun siRNA transfection e non essere influenzato dal controllo siRNA trasfezione. Sopra i dati hanno dimostrato che c-Jun mediata MMP-9 espressione indotta da attivazione della via AhR nelle cellule AGS. Figura 4 c-Jun media MMP-9 espressione e l'attività TCDD-indotta. (A) TCDD induce l'espressione c-Jun mRNA in modo dose-dipendente. (B) TCDD induce l'espressione della proteina c-Jun in modo dose-dipendente. (C) TCDD induce l'espressione c-Jun mRNA in un modo dipendente dal tempo. (D) TCDD induce l'espressione della proteina c-Jun in modo dipendente dal tempo. (E) RSV inverte l'espressione di c-Jun mRNA TCDD-indotta. (F) RSV inverte l'espressione della proteina c-Jun TCDD-indotta. (G) c-Jun siRNA silenzi espressione di mRNA c-giugno (H) c-Jun siRNA tacere l'espressione della proteina c-giugno (I) c-Jun siRNA inibisce MMP-9 espressione dell'mRNA TCDD-indotta. (J) c-Jun siRNA inibisce l'aumento di attività di MMP-9 TCDD-indotta.
Conclusione
In conclusione, questo studio dimostrano che AhR percorso può essere attivato nelle cellule AGS cancro gastrico e l'attivazione della via AhR induce MMP-9 espressione e l'attività che in ultima analisi contribuisce alla migrazione AGS e l'invasione in vitro. Inoltre, i nostri dati mostrano che questa attivazione indotta MMP-9 espressione AhR è mediata da c-giugno A causa di degrado ECM e membrana basale è un passo essenziale per l'invasione del tumore e metastasi, i nostri risultati forniscono informazioni nel meccanismo e la funzione della via AhR e il suo impatto sui processi di trasformazione durante la progressione del cancro gastrico.
Metodi
cultura cellulare
gastrico linea cellulare di cancro AGS è stata ottenuta dalla American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), ed è stato mantenuto in terreno RPMI 1640 (Hyclone) supplementato con 2 mM glutammina, 10% di siero fetale bovino (Hyclone), 100 unità /ml di penicillina, e 100 mg /ml di gentamicina. ambiente cellulare è stata mantenuta a 5% CO 2 e 37 ° C. Le cellule sono state raccolte dalla fase di crescita esponenziale e RNA totale e proteine ​​sono state preparate come descritto di seguito
. Il trattamento delle cellule
TCDD e resveratrolo sono stati acquistati da Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Dopo incubazione per 24 ore, le cellule sono state trattate con TCDD a differenti concentrazioni (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) o TCDD (1 nM) più resveratrolo (0, 1, 5, 10, 20 pM) per 24 ore, o trattate con TCDD (1 nM) per diverso tempo (0, 1, 6, 24, 48, 72 ore), rispettivamente. Tutti i farmaci sono stati sciolti in dimetilsolfossido (DMSO). Le cellule di controllo ricevuto 0,1% DMSO solo.
small interfering RNA sintesi
piccoli RNA interferenti (siRNA) sono stati sintetizzati e ad alte prestazioni purificato (Ribo Biotecnologie, Guangzhou). c-Jun siRNA (senso, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antisenso, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) e di controllo siRNA (senso, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; antisenso, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), privi di omologia con eventuali geni umani noti, sono stati sciolti in RNase-free DDH 2O ad una concentrazione finale di 20 micromol /L.
small interfering RNA trasfezione
Cells (5 × 10 5) sono stati placcati su pozzetti di piastre a sei pozzetti di coltura cellulare e ha permesso di aderire per 24 ore. Quattro microlitri Lipofectamine2000 (Invitrogen) per pozzetto sono stati aggiunti privo di siero Opti MEM (Invitrogen) per un volume complessante finale di 250 microlitri, delicatamente mescolati, e incubate a temperatura ambiente per 5 minuti. Cinque microlitri di soluzione di siRNA per pozzetto sono stati diluiti con 250 microlitri senza siero Opti MEM. Mescolare la soluzione diluita siRNA e la diluito Lipofectamine2000 delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Il complesso Lipofectamine2000 /siRNA stato aggiunto nei pozzetti contenenti 1500 ml RPMI 1640 con 10% FBS e incubato in normali condizioni di coltura cellulare. Tutti i test sono stati eseguiti dopo 48 ore. Isolamento
RNA e RT-PCR
RNA totale di cellule è stato estratto utilizzando il kit RNeasy Mini Quiagen (Quiagen) secondo le istruzioni del produttore. cDNA è stato sintetizzato con 1 mg di RNA totale mediante trascrittasi inversa, ReverTra AceTM (Toyobo Co., Osaka, Giappone) in condizione seguente: 30 ° C per 10 min, 42 ° C per 20 min, 99 ° C per 5 minuti e 4 ° C per 5 min. PCR di cDNA è stata effettuata in una miscela di reazione (30 pl) contenente 2 ml di cDNA, 2,5 mM MgCl 2, 200 mM dNTP, 0,3 mM di primer 1 e 2, e 1 unità di polimerasi Taq DNA (New England Biolabs). L'amplificazione è stata eseguita utilizzando la seguente condizione: 94 ° C per 5 minuti, seguito da 25-32 cicli (denaturare per 45 s a 94 ° C, ricottura per 30 s, e si estendono per 30 s a 72 ° C), e poi 72 ° C per 7 min. I dettagli di primer, temperatura di ricottura, cicli di amplificazione, e PCR formato del prodotto per ogni gene sono elencati nella Tabella 1. Il prodotti di PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi su gel di agarosio 1,5%, colorati con bromuro di etidio, e visualizzati con ultravioletti (UV) transilluminatore. intensità di banda in RT-PCR sono stati quantificati utilizzando Quantity One software di analisi delle immagini. intensità banda di CYP 1A1, MMP-9 e C-Jun mRNA sono stati normalizzati con le corrispondenti intensità di banda di beta-actina. I dati sono stati riportati come media ± SD.Table 1 sequenze primer e condizioni di amplificazione PCR
Gene
Primer (5 '→ 3')
temperatura di ricottura (° C)
cicli
formato del prodotto (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: Beta-actina CTGCGTTAGCATGAGTTGG
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Abbreviazioni: S, il senso di fondo; Un primer antisenso
analisi Western Blot
pellet cellulari sono stati omogeneizzati in un buffer di lisi contenente 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 50 mM β-glicerofosfato, orthovanadate 2 mM di sodio, 10% glicerolo, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT, e 1 × inibitore della proteasi Cocktail (Roche, Mannheim, Germania). Lisato è stata centrifugata a 13000 rpm e 4 oC per 10 minuti. Il supernatante è stato lisato cellulare totale. La concentrazione di proteine ​​è stata misurata usando il BCA kit di analisi delle proteine ​​(Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Trenta microgrammi di proteine ​​è stato caricato per corsia, separate da 10% elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide, e trasferite su membrana di difluoruro di polivinilidene equilibrato per elettroblotting. Le membrane sono state bloccate con TBS-T tampone contenente 5% (w /v) di latte secco non grasso. AhR, CYP1A1, sono stati rilevati c-Jun e beta-actina per 2 ore con anticorpi contro AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, la diluizione 1 di lavoro: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon internazionale, diluizione di lavoro 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, la diluizione 1 di lavoro: 200) e beta-actina (DZ0, Cell Signaling Tecnologia, lavoro di diluizione 1: 1000). Dopo l'incubazione secondaria di anticorpi (lavoro diluizione 1: 2000), chemiluminescenza (Pierce Biotechnology, Inc.) è stata determinata da esposizione a pellicola a raggi x. intensità di banda in Western Blot sono stati quantificati utilizzando Quantity One software di analisi delle immagini. intensità banda di CYP 1A1 e c-Jun sono stati normalizzati con le corrispondenti intensità di banda di beta-actina. I dati sono stati riportati come media ± SD
. Gelatina zimografia
media da TCDD colture trattate è stato elettroforesi su SDS-PAGE in cui il gel contiene 0,1% (w /v) di gelatina. Il gel è stato incubato durante la notte in un Zn 2 + e Ca 2+ contenente tampone per consentire le MMPs di recuperare la propria struttura adeguata e degradano la gelatina nel gel. Cancella bande bianche sul Coomassie macchiati gel sono indicativi di attività MMP. intensità della band sono stati quantificati utilizzando Quantity One software di analisi delle immagini.
ferita guarigione saggio di migrazione
Per la misurazione della migrazione delle cellule durante la guarigione della ferita, le cellule AGS sono state seminate in singoli pozzetti di una piastra di coltura 6-bene. Quando le cellule hanno raggiunto uno stato confluenti, strati di cellule sono stati feriti con una punta di plastica micropipetta avere una grande orifizio. Il mezzo e detriti sono stati aspirati via e sostituiti da 2,5 ml di mezzo fresco senza siero che contenevano concentrazioni diverse di TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 Nm). Le cellule sono state fotografate ogni 12 ore dopo il ferimento al microscopio a contrasto di fase. Per la valutazione di "chiusura della ferita," cinque punti selezionati in modo casuale lungo ogni ferita sono stati segnati, e la distanza orizzontale di migrazione di cellule dalla ferita iniziale è stata misurata. I dati sono stati riportati come media ± SD.
Saggio di migrazione e l'invasione Transwell
trattate o non trattate cellule di controllo sono state seminate in triplicato nella camera superiore di un inserto Transwell (Corning, New York, NY, USA) in senza siero media ad una densità di 1 × 10 5 per pozzetto. Per i saggi di migrazione, terreno contenente 5% di siero è stato collocato nella camera inferiore di agire come un fattore chemiotattico, e le cellule sono state ulteriormente incubate per 18 h. cellule non migranti sono stati rimossi dalla camera superiore raschiando, e le cellule rimanenti sulla superficie inferiore dell'inserto sono stati colorati con 0,1% cristalvioletto per 15 minuti. Le cellule sono state contate al microscopio. saggi Invasion stati fatti da per i saggi di migrazione descritti sopra, ad eccezione inserti sono stati fase solida con la matrice extracellulare (ECM) sostituto Matrigel (BD Biosciences) e incubate per un periodo di 24 ore. Ogni clone è stato placcato in triplicato in ogni esperimento e ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte. migrazione cellulare (o di invasione) capacità = (il numero delle cellule del gruppo trattato /il numero di cellulare del gruppo di controllo) × 100%.
Note
Tie-Li Peng, Chen Jie ha contribuito ugualmente a questo lavoro.
dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti contributi: i contributi da National Science Foundation naturale della Cina (n ° 30.670.949, n ° 30.671.904 e No.30871145), una sovvenzione concessa al nuovo insegnante dal Ministero cinese delle Istruzione (No.20070558288), una sovvenzione concessa al supervisore di dottorato dal Ministero cinese della Pubblica Istruzione (n 20.060.558,01 mila), le sovvenzioni della Fondazione di Scienze naturali della provincia di Guangdong (No.5300767 e No.7001641).
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