Aryl hydrokarbon reseptor pathway aktivering forbedrer magekreft celle invasivitet sannsynlig gjennom en c-Jun-avhengig induksjon av matriksmetalloproteinase-9

Aryl hydrokarbon reseptor pathway aktivering forbedrer magekreft celle invasivitet sannsynlig gjennom en c-Jun-avhengig induksjon av matriksmetalloproteinase-9
Abstract
Bakgrunn
Abberant aryl hydrokarbon reseptor (AhR) uttrykk og AhR sti aktivering er involvert i magekreftutvikling. Imidlertid er forholdet mellom AhR sti aktivering og magekreft progresjon fortsatt uklart. I denne studien har vi brukt 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioksin (TCDD), en klassisk og mest potente ligand av AhR, for å aktivere AhR sti og undersøkte effekten av AhR pathway aktivering på menneskelig magekreft AGS celle invasjon og utforsket den tilsvarende mekanisme.
Resultater
for å avgjøre om AhR veien kan aktiveres i AGS celler, undersøkte vi uttrykket av CYP1A1, en klassisk target gen av AhR vei, etter TCDD eksponering. RT-PCR og western blot-analyse viste at både CYP1A1 mRNA og protein ekspresjon ble øket på en doseavhengig måte etter TCDD behandling og AhR antagonist resveratrol (RSV) kunne reversere denne TCDD-indusert ekspresjon CYP1A1. For å avgjøre om TCDD behandling av AGS cellene resulterer i en induksjon av MMP-9 uttrykk, vi har oppdaget MMP-9 mRNA ved hjelp av RT-PCR og oppdaget MMP-9 enzymatisk aktivitet ved hjelp av gelatin zymografi. Resultatene viste at både MMP-9-mRNA-ekspresjon og enzymatisk aktivitet ble gradvis økt med økningen av konsentrasjonen av TCDD i media, og disse endringene kan bli reversert ved RSV behandling på en doseavhengig måte. For å undersøke om AhR aktivisering-indusert MMP-9 uttrykk og aktivitet i AGS celler fører til økt migrasjon og invasjon, utførte vi sårheling migrasjon analysen og transwell migrasjon og invasjon analysen. Etter TCDD behandling, ble overføringen avstand og migrasjons og invasjons evner av AGS celler økt med en doseavhengig måte. For å demonstrere AhR aktivisering-indusert MMP-9 uttrykk er mediert av c-Jun, ble siRNA transfeksjon utført til taushet c-Jun mRNA i AGS celler. Resultatene viste at MMP-9-mRNA-ekspresjon og aktivitet i ubehandlet kontroll AGS-celler var meget svak; Etter TCDD (10 nmol /L) behandling, MMP-9 mRNA uttrykk og aktivitet var signifikant økt; Dette TCDD-indusert MMP-9 uttrykk og aktivitetsøkning kan bli avskaffet av c-Jun siRNA transfeksjon.
Konklusjon
AhR pathway aktivering forbedrer magekreft celle invasivitet sannsynlig gjennom en c-Jun-avhengig induksjon av MMP-9. Våre resultater gir innsikt i mekanismen og funksjon av AhR sti og dens innvirkning på magekreft progresjon.
Bakgrunn
Aryl hydrokarbon reseptor (AhR) er en ligand-aktiverte transkripsjonsfaktor av den grunnleggende helix-loop-helix /per-Arnt-Sim familie. I fravær av ligand, er AhR til stede i cytosol i form av et kompleks med to anstand Hsp90s, en smal protein (p23), og et immunofilin-lignende protein (XAP2) [1, 2]. Ved ligand såsom 2,3,7,8-tetraklordibenzo-para-dioksin (TCDD, den mest potente og klassisk eksogen AhR ligand) binding, er chaperon proteinene dissosiere og AhR translocate inn i kjernen for å danne et heterodimer med sin partner molekyl aryl hydrokarbon-reseptor atom Translocator (ARNT) [3, 4]. Dette heterodimer binder seg til den spesifikke DNA-regionen betegnet dioksin responselement (DRE), som har en kjerne av sekvens 5'-TNGCGTG-3 ', og derved aktiverer et batteri av gener uttrykk [5-7].
Historisk studier av AhR veien har fokusert på den transkripsjonelle regulering av gener som koder for xenobiotiske metaboliserende enzymer så som cytokrom P450-enzymer [8]. Nyere studier viste en nær sammenheng mellom AhR og melkekjertlene tumorigenesis [7, 9]. Ahr genet polymorfismer har vært knyttet til en økt risiko for lunge- og brystkreft [10, 11]. Øket ekspresjon av AhR har blitt rapportert i lunge, bryst, og bukspyttkjertel kreft hos mennesker [7, 12, 13]. Studier tyder også på at konstitutivt aktiv AhR kan fremme hepatocarcinogenesis hos mus [14]. Disse data indikerte et nært forhold mellom AhR og tumorigenesis. Imidlertid er forholdet mellom AhR og tumorprogresjon ikke klart.
Tumorceller invasjon og metastase er en komplisert prosess som blant degradering av ekstracellulær matriks (ECM) og basalmembran er et avgjørende trinn. Tumorinvasjon og metastase er avhengig av ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser (MMP) for å ødelegge den ECM og grunnmembranen for å tillate cellemigrering. MMP'er er en gruppe av sinkavhengig metallopeptidases [15-17]. Matrise-metalloproteinase-9 (MMP-9) er en av type IV kollagenase /gelatinaser, som nedbryter basalmembran kollagener og gelatiner [16]. MMP-9 er allment forbundet med tumorinvasjon og metastase [17]. Syntesen av MMP-9 er regulert av flere vekstfaktorer, cytokiner og hormoner [16, 18]. Nyere studier knyttet TCDD-forbundet lesjoner med avvikende matrise metabolisme [8]. Microarray data viser at TCDD /AhR endre uttrykket av gener involvere i matrisen metabolisme og deponering [8]. Villano et al [19] og Haque et al [18] rapporterte at AhR agonist TCDD kan indusere MMP-9 uttrykk i huamn melanom celler og prostata kreft celler. Disse studiene tyder på at MMP-9 uttrykk kan være en felles endepunkt for aktivering av AhR veien [8, 19].
Magekreft er den fjerde vanligste kreftformen og den nest hyppigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall i verden [20]. Gastric kreftceller invasjon og metastase ofte føre til en dårlig prognose. Flere studier knyttet AhR vei aktivering til magekreftutvikling. Chen et al fant økt uttrykk av AhR i to menneskelige mage kreft cellelinjer (RF1 og RF48) av microarray analyse [21]. Ma et al rapporterte at samtidig uttrykk for AhR og CYP1A1 er korrelert med magekreft utvikling [22]. Andersson et al fant at konstitutivt aktivert AhR kan indusere mage svulster i en transgen musemodell [23]. I en annen av våre studier, fant vi at AhR uttrykk og kjernefysisk trans var betydelig høyere i magekreft enn i premaligne lesjoner og normal mageslimhinnen [24]. Imidlertid er forholdet mellom AhR sti aktivering og magekreft invasjon og metastase fortsatt ikke klart. Derfor undersøkte vi effekten av AhR pathway aktivering på menneskelige mage kreftceller. Våre data som presenteres her viser at AhR veien kan aktiveres i magekreft AGS celler og AhR sti aktivering i AGS celler induserer MMP-9 uttrykk og forbedrer AGS celler migrasjon og invasjon aktivitet. Diskusjonen i AGS celler Videre våre data viser at dette AhR aktivisering-indusert MMP-9 uttrykk er mediert av c-juni
Resultater og
AhR sti aktivering
I en annen av våre studier har vi vist at det var et høyt nivå av ekspresjon AhR i AGS-celler [24]. For å avgjøre om AhR veien kan aktiveres i denne cellelinjen, undersøkte vi uttrykket av Cytokrom P-450 1A1 (CYP1A1), en klassisk target gen av AhR vei, etter AhR agonist TCDD eksponering. RT-PCR og western blot-analyse viste at både CYP1A1 mRNA (fig. 1A) og protein (Fig. 1B) ekspresjon i AGS-celler ble øket på en doseavhengig måte etter TCDD behandling. For å finne ut om denne TCDD-indusert CYP1A1 uttrykk er AhR avhengig, ble AhR antagonist resveratrol (RSV) brukes til å blokkere AhR veien. Som vist på fig. 1C og 1D, RSV kunne reversere TCDD-indusert CYP1A1 uttrykk på en doseavhengig måte. Disse dataene viste at AhR veien kan aktiveres i AGS celler ved TCDD. Figur 1 AhR agonist TCDD og AhR antagonist RSV regulert CYP1A11 uttrykk i AGS celler. Etter forskjellige konsentrasjoner (som vist ovenfor) av TCDD behandling i 24 timer, (A) RT-PCR-analyse av CYP1A1 mRNA ekspresjon i en konsentrasjon-respons. (B) Western blot-analyse av CYP1A1 protein ekspresjon i en konsentrasjon-respons. Etter ko-behandling med TCDD (1 nM) og RSV (ved forskjellige konsentrasjoner, som vist ovenfor) i 24 timer, (C) mRNA-ekspresjon av CYP1A1 ble påvist ved RT-PCR. (D) Protein ekspresjon av CYP1A1 ble påvist ved Western blot.
AhR bane aktivering i AGS-celler induserer MMP-9 uttrykk
Tidligere studier har vist at i mange kreftceller, aktiverer AhR agonist TCDD eksponering MMP-9-genekspresjon [18, 19]. For å bestemme hvorvidt TCDD behandling av AGS celler resulterer i en induksjon av MMP-9 uttrykk, vi har oppdaget MMP-9-mRNA ved hjelp av RT-PCR følgende TCDD eksponering. Som vist i fig. 2A, MMP-9-mRNA-ekspresjon ble indusert på en doseavhengig måte etter TCDD behandling. For å undersøke rollen til AhR sti i formidling TCDD-indusert MMP-9 uttrykk i AGS celler, kulturer samtidig var behandlet med TCDD og AhR antagonist resveratrol. Samtidig behandling med resveratrol opphevet TCDD-indusert MMP-9 uttrykket (fig. 2C) viste at TCDD-aktivering av MMP-9 ekspresjon er avhengig av AhR pathway. Ovennevnte data indikerer at AhR bane aktivering i AGS-celler induserer MMP-9-mRNA-ekspresjon. I de fleste celletyper, er det gentranskripsjon av MMP-9 induserbar, og etter translasjon enzymet umiddelbart utskilt og aktivert gjennom cystein-brytermekanismen [25]. For å avgjøre hvorvidt disse endringene i genuttrykk følgende AhR pathway aktivering resultat i endringer i MMP-9 enzymatisk aktivitet, vi utførte gelatin zymografi. Resultatene viste at MMP-9 aktivitet i mediet gradvis øket med konsentrasjonen økning av TCDD i media (fig. 2B), og at slike endringer kan bli reversert ved resveratrol behandling på en doseavhengig måte (fig. 2D). Disse data viser at AhR bane aktivering-indusert økning av MMP-9 korrelerer uttrykk med en økning i MMP-9 aktivitet. Figur 2 AhR agonist TCDD og AhR antagonist RSV regulert MMP-9 uttrykk og aktivitet i AGS celler. Etter forskjellige konsentrasjoner (som vist ovenfor) av TCDD behandling i 24 timer, (A) RT-PCR-analyse av MMP-9-mRNA-ekspresjon i en konsentrasjon-respons. (B) Gelatin zymografi analyse av MMP-9 proteinaktivitet i en konsentrasjon-respons. Etter ko-behandling med TCDD (1 nM) og RSV (ved forskjellige konsentrasjoner, som vist ovenfor) i 24 timer, (C) mRNA ekspresjon av MMP-9 ble påvist ved RT-PCR. (D) Protein aktiviteten av MMP-9 ble påvist ved zymografi gelatin.
AhR bane aktivering forbedrer AGS-celler migrering og invasjon
MMP-9 er ett av den type IV collagenase /gelatinaser som kan degradere ECM komponenter. MMP-9 er allment forbundet med tumorinvasjon og metastase [17]. Studier har vist en signifikant korrelasjon mellom MMP-9 uttrykk og invasivitet og lymfeknutemetastase av mage karsinom [26-28]. For å undersøke om AhR aktivisering-indusert MMP-9 uttrykk og aktivitet i AGS celler fører til økt migrasjon og invasjon, utførte vi sårheling migrasjon analysen og transwell migrasjon og invasjon analysen. Etter TCDD behandling ble migrering avstand fra AGS-celler i betydelig grad øket med en doseavhengig måte sammenlignet med kontrollceller (p 0,01) (Fig. 3A). Transwell Resultatene viste en signifikant økning av migrasjon (figur 3B.) Og invasjon (figur 3C). Evner av AGS-celler når cellene ble inkubert med TCDD i konsentrasjoner fra 0,1 nmol /L (p 0,01) til 100 nmol /l ( p < 0,01). ingen signifikant virkning på migrering og invasjon ble funnet ved TCDD-konsentrasjon < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Disse resultatene viste at AhR bane aktivering forbedrer magekreft AGS-celler migrering og invasjon. Nedbrytning av ECM og basalmembran er et viktig skritt i tumorinvasjon og metastasering. Det innebærer virkningen av matriks-metalloproteinaser (MMP). Vår studie viste at AhR pathway aktivering kan indusere MMP-9 uttrykk og enzymatisk aktivitet, og fremme AGS celler migrasjon og invasjon. Andre studier indikerte at AhR pathway aktivering kan indusere en rekke MMP uttrykk [19, 29]. AhR pathway aktivering forbedrer magekreft AGS-celler migrering og invasjon kan også skyldes andre MMP'er ekspresjon i tillegg til MMP-9 uttrykk. Figur 3 Effekten av AhR agonist TCDD på AGS-cellemigrering og invasjon. (A) sårtilheling migrasjon analysen. (B) Transwell migrasjon assay. (C) Transwell invasjon assay.
C-Jun mediert MMP-9-ekspresjon indusert med AhR bane aktivering
mekanismen for TCDD-induserte endringer i MMP-9 uttrykk er ikke helt klart. Nyere studier har rapportert at TCDD kan indusere c-Jun uttrykk [30, 31] og c-Jun er et mål gen av AhR pathway [8]; promotersekvensen i den 5'-flankerende region av human MMP-9-genet inneholder c-Jun-bindingssetene [16] og c-Jun kan induseres MMP-9 uttrykk [32]; transkripsjonen aktivitet til c-Jun er betydelig forbedret i magekreft [33]. Basere på disse studiene, foreslo vi en hypotese om at TCDD-indusert MMP-9 uttrykk i AGS celler er mediert av c-juni For å demonstrere denne hypotesen, vi først oppdaget c-Jun-ekspresjon i AGS celler etter TCDD behandling, og fant at både c-Jun-mRNA (fig. 4A og 4C) og protein (fig. 4B og 4D) ekspresjon i AGS-celler ble øket i en dose (fig. 4A og 4B) og tid (fig. 4C og 4D) avhengig måte etter TCDD behandling, og dette TCDD-indusert c-Jun uttrykket kan bli forbeholdt AhR antagonist resveratrol (fig. 4E og 4F). Over data viste at c-Jun er et mål gen av AhR sti i AGS celler. For ytterligere å demonstrere at c-Jun kan megle TCDD-indusert MMP-9 uttrykk, ble siRNA transfeksjon utført til taushet c-Jun mRNA i AGS celler. Resultatene viste at c-Jun siRNA (sluttkonsentrasjon 50 nmol /L) transfeksjon nesten fullstendig opphevet c-Jun-ekspresjon i AGS-celler både i mRNA nivå (fig. 4G) og på proteinnivå (fig. 4 H). Derfor, etter c-Jun siRNA transfeksjon i 48 timer, ble AGS-celler behandlet med TCDD-konsentrasjon på 10 nmol /l i 24 timer, cellepellet og kulturmedia ble oppsamlet, og MMP-9-mRNA-ekspresjon og aktivitet ble målt. Som vist i fig. 4I og 4J, MMP-9 mRNA uttrykk og aktivitet i ubehandlet kontroll AGS celler var veldig svak; Etter TCDD (10 nmol /L) behandling, MMP-9 mRNA uttrykk og aktivitet var signifikant økt; Dette TCDD-indusert MMP-9-ekspresjon og aktivitet økningen kan oppheves ved c-Jun siRNA transfeksjon og ikke bli påvirket av styre siRNA transfeksjon. Over data viste at c-Jun mediert MMP-9 uttrykk indusert av AhR sti aktivering i AGS celler. Figur 4 c-Jun formidler TCDD-indusert MMP-9 uttrykk og aktivitet. (A) TCDD induserer c-Jun-mRNA-ekspresjon i en doseavhengig måte. (B) TCDD induserer c-Jun-protein ekspresjon i en doseavhengig måte. (C) TCDD induserer c-Jun-mRNA-ekspresjon i en tidsavhengig måte. (D) TCDD induserer c-Jun-protein ekspresjon i en tidsavhengig måte. (E) RSV reverserer TCDD-indusert c-Jun mRNA uttrykk. (F) RSV reverserer TCDD-indusert c-Jun protein uttrykk. (G) c-Jun siRNA demper c-Jun mRNA uttrykk. (H) c-Jun siRNA demper c-Jun protein uttrykk. (I) c-Jun siRNA hemmer TCDD-indusert MMP-9 mRNA uttrykk. (J) c-Jun siRNA hemmer TCDD-indusert MMP-9 aktivitetsøkning.
Konklusjon
Konklusjonen denne studien viser at AhR veien kan aktiveres i magekreft AGS celler og AhR sti aktivering induserer MMP-9 ekspresjon og aktivitet som til slutt bidrar til AGS migrering og invasjon in vitro. Videre våre data viser at denne AhR aktiveringen-indusert MMP-9 uttrykk er mediert av c-juni Fordi nedbrytning av ECM og basalmembran er et viktig skritt i tumorinvasjon og metastase, våre resultater gir innsikt i mekanismen og funksjon av AhR sti og dens innvirkning på disse prosessene i løpet av magekreft progresjon.
Metoder
Cellekultur
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP cellelinje AGS ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), og ble opprettholdt i RPMI 1640-medium (Hyclone) supplert med 2 mM glutamin, 10% føtalt bovint serum (Hyclone), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml gentamycin. Cellulært miljø ble opprettholdt ved 5% CO 2 og 37 ° C. Celler ble høstet fra den eksponensielle vekstfase, og total RNA og protein, ble fremstilt som beskrevet nedenfor.
Behandling av celler
TCDD og resveratrol ble innkjøpt fra Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Etter inkubering i 24 timer ble cellene behandlet med TCDD ved forskjellige konsentrasjoner (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) eller TCDD (1 nM) pluss resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 pM) for 24 timer, eller behandles med TCDD (1 nM) for henholdsvis forskjellig tid (0, 1, 6, 24, 48, 72 timer). Alle legemidler ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO). Kontrollceller fikk 0,1% DMSO bare.
Liten interfering RNA syntese
Små interfererende RNA (siRNAs) ble syntetisert og høy ytelse renset (Ribo Bioteknologi, Guangzhou). c-Jun sirnas (sanse, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT, antisense, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) og kontroll sirnas (følelse, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT, antisense, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), bærer ingen homologi med noen kjente menneskelige gener, ble oppløst i RNase-fritt DDH 2o til en sluttkonsentrasjon på 20 umol /L.
Lie interfererende RNA-transfeksjon
Celler (5 x 10 5) ble utsådd på brønner i seks-brønners cellekulturplater og tillatt å følge etter 24 timer. Fire mikroliter Lipofectamine2000 (Invitrogen) per brønn ble tilsatt til serumfritt MEM Opti (Invitrogen) for en endelig kompleksvolum på 250 pl, forsiktig blandet og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter. Fem mikroliter siRNA løsning per brønn ble fortynnet med 250 mL serum-free Opti MEM. Blande den fortynnede oppløsningen siRNA og den fortynnede Lipofectamine2000 forsiktig og inkuber ved værelsestemperatur i 30 minutter. Den Lipofectamine2000 /siRNA-kompleks ble tilsatt til brønnene som inneholdt 1 500 pl RPMI 1640 med 10% FBS og inkubert i cellekulturbetingelser normale. Alle analyser ble utført etter 48 timer.
RNA isolering og RT-PCR
Totalt RNA fra celler som ble ekstrahert ved bruk av Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert med 1 ug total RNA ved å bruke revers transkriptase, ReverTra AceTM (Toyobo Co., Osaka, Japan) under følgende betingelse: 30 ° C i 10 min, 42 ° C i 20 min, 99 ° C i 5 minutter, og 4 ° C i 5 min. PCR av cDNA ble utført i en reaksjonsblanding (30 ul) inneholdende 2 pl templat cDNA, 2,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP, 0,3 pM primer 1 og 2, og en enhet av Taq DNA-polymerase (New England Biolabs). Amplifikasjon ble utført ved anvendelse av følgende betingelse: 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 25-32 cykler (denaturering i 45 s ved 94 ° C, gløding i 30 s, og strekker seg i 30 sek ved 72 ° C), og deretter 72 ° C i 7 min. Detaljene i primere, glødetemperatur, amplifiseringscykluser, og PCR produktstørrelse for hvert gen er oppført i tabell 1. PCR-produktene ble underkastet elektroforese på 1,5% agarosegel farget med etidiumbromid, og visualisert med en ultrafiolett (UV) transilluminator. Band intensiteter i RT-PCR ble kvantifisert ved hjelp Antall En bildeanalyse programvare. Band intensiteter av CYP 1A1, MMP-9 og c-Jun mRNA ble normalisert med tilsvarende bandet intensiteter av beta-aktin. Data ble rapportert som gjennomsnitt ± SD.Table en Primer sekvenser og PCR forsterkning vilkår
Gene
Grunning (5 '→ 3') <.no> annealing temperatur (° C)
Cycles
Produkt størrelse (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55.2
30
292
A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta-aktin
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Forkortelser: S, sanse primer; A, antisense-primer
Western blot-analyse
Cellepelleter ble homogenisert i en lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 50 mM β-glycerofosfat, 2 mM natriumortovanadat, 10% glyserol, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT og 1 × proteasehemmer Cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Lysatet ble sentrifugert ved 13 000 rpm og 4 ° C i 10 minutter. Supernatanten ble det totale cellelysat. Proteinkonsentrasjonen ble målt ved anvendelse av BCA proteinanalysesettet (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Tretti mikrogram protein ble applisert per bane, separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til ekvilibrert polyvinylidendifluorid-membran ved elektroblotting. Membranene ble blokkert med TBS-T-buffer inneholdende 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk. AhR, CYP1A1, c-Jun og beta-aktin ble påvist i 2 timer ved bruk av antistoffer mot AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, arbeider fortynning 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, arbeider fortynning 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, arbeider fortynning 1: 200) og beta-aktin (DZ0, Cell Signaling Technology, arbeider fortynning 1: 1000). Etter inkubasjon sekundært antistoff (arbeids fortynning 1: 2000), forbedret kjemiluminescens (Pierce Biotechnology, Inc.) ble bestemt ved eksponering for røntgenfilm. Band intensiteter i Western blot ble kvantifisert ved hjelp Antall En bildeanalyse programvare. Band intensiteter av CYP 1A1 og c-Jun ble normalisert med tilsvarende bandet intensiteter av beta-aktin. Data ble rapportert som gjennomsnitt ± SD.
Gelatin zymografi
Media fra TCDD-behandlede kulturer ble elektroforert på SDS-PAGE, hvor gelen inneholder 0,1% (w /v) gelatin. Gelen ble inkubert over natten i en Zn 2 + og Ca 2+ inneholdende buffer for å tillate MMP'er å gjenvinne sin riktige struktur og nedbryte gelatinen i gelen. Klare hvite bånd på Coomassie beiset gel er veiledende av MMP aktivitet. Båndintensitetene ble kvantifisert ved anvendelse av Mengde En bildeanalysesoftware.
Sårtilheling migrasjonsanalysen
For måling av cellemigrering under sårheling, ble AGS-celler sådd ut i individuelle brønner i en 6-brønners kulturplate. Når cellene nådde en konfluent tilstand, ble cellelagene såret med et plast mikropipette spissen ha en stor åpning. Mediet og debris ble sugd bort og erstattet med 2,5 ml friskt serum-fritt medium som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). Celler ble fotografert hver 12. time etter såret av fasekontrastmikroskop. For evaluering av "sårheling," fem tilfeldig utvalgte punkter langs hvert sår ble merket, og den horisontale avstanden fra trekkende celler fra den opprinnelige såret ble målt. Data ble rapportert som gjennomsnitt ± SD.
Transwell migrering og invasjon assay
behandlet eller ubehandlet kontroll-celler ble sådd ut i triplikat i det øvre kammer av en Transwell satt inn (Corning, New York, NY, USA) i serumfritt medium ved en tetthet på 1 x 10 5 per brønn. For migrerings assays, ble medium inneholdende 5% serum plassert i det nedre kammer for å virke som en kjemoattraktant, og cellene ble ytterligere inkubert i 18 timer. Nonmigratory celler ble fjernet fra det øvre kammer ved skraping, og de celler som var tilbake på den nedre overflate av innsatsen ble farget med 0,1% krystallfiolett i 15 min. Cellene ble tellet under et mikroskop. Invasjons analyser ble utført som for migrasjons analysene beskrevet ovenfor, bortsett fra innskudd ble forbelagt med den ekstracellulære matriks (ECM) erstatning Matrigel (BD Biosciences) og inkuberes i løpet av en 24-timers periode. Hver klon ble sådd ut i triplikat i hvert forsøk, og hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Cell migrasjon (eller invasjon) evne = (cellen antall behandlede gruppen /celle antall kontrollgruppe) x 100%.
Merknader
Tie-Li Peng, Jie Chen bidratt likt til dette arbeidet.
erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (No. 30670949, nr 30671904 og No.30871145), et stipend tildelt ny lærer fra kinesiske departementet for utdanning (No.20070558288), et stipend tildelt PhD veileder fra kinesiske utdanningsdepartementet (nr 20060558010), tilskudd fra stiftelsen i Guangdong-provinsen (No.5300767 og No.7001641) Natural Science.
Forfatter original innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Forfatteroriginalfilen for figur 4

• Betinget overlevelsesanalyse i koreansk pasienter med magekreft gjennomgår kurativ gastrectomy
• Gjennomførbarheten av økt utvinning etter operasjonen i gastrisk kirurgi: en retrospektiv study