Aryl carbonhydrid receptor-aktivering forøger gastrisk cancercellelinie invasionsevne sandsynligvis gennem en c-Jun-afhængig induktion af matrixmetalloproteinase-9

Aryl kulbrinte receptor-aktivering øger gastrisk kræft celle invasionsevne sandsynligvis gennem en c-Jun-afhængige induktion af matrixmetalloproteinase-9
Abstract
Baggrund
Abberant aryl hydrocarbon receptor (AhR) udtryk og AhR-aktivering er involveret i gastrisk carcinogenese. Forholdet mellem AhR pathway aktivering og gastrisk cancer progression er stadig uklar. I nærværende undersøgelse, brugte vi 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-para-dioxin (TCDD), en klassisk og mest potente ligand af AhR, at aktivere AhR vej og undersøgte effekten af ​​AhR pathway aktivering på human mavekræft AGS celle invasion og udforsket den tilsvarende mekanisme.
Resultater
at bestemme om AhR pathway kan aktiveres i AGS celler, undersøgte vi udtryk for CYP1A1, en klassisk target gen af ​​AhR vej, efter TCDD eksponering. RT-PCR og Western blot-analyse viste, at både CYP1A1 mRNA og proteinekspression blev forøget på en dosis-afhængig måde efter TCDD behandling og AhR antagonist resveratrol (RSV), kunne ændre denne TCDD-induceret CYP1A1 ekspression. For at bestemme om TCDD behandling af AGS celler resulterer i en induktion af MMP-9-ekspression, vi har registreret MMP-9 mRNA under anvendelse af RT-PCR og detekteret MMP-9 enzymatisk aktivitet under anvendelse af gelatinezymografi. Resultaterne viste, at både MMP-9 mRNA-ekspression og enzymatisk aktivitet gradvist blev forøget med koncentrationen forøgelse af TCDD i medier, og disse ændringer kan vendes ved RSV behandling på en dosis-afhængig måde. For at undersøge om AhR aktivering-induceret MMP-9-ekspression og aktivitet i AGS celler resulterer i øget migration og invasion, udføres vi sårheling migration assay og transwell migration og invasion assay. Efter TCDD behandling blev migreringen afstand og migrationen og invasion evner af AGS-celler steg med en dosis-afhængig måde. For at demonstrere AhR aktivering-induceret MMP-9-ekspression medieres af c-Jun, blev siRNA transfektion udført for at lukke munden på c-Jun mRNA i AGS celler. Resultaterne viste, at MMP-9-mRNA-ekspression og aktivitet i ubehandlet kontrol AGS celler var meget svag; Efter TCDD (10 nmol /l) behandling, MMP-9 mRNA-ekspression og aktivitet var signifikant øget; Denne TCDD-induceret MMP-9-ekspression og aktivitet stigning kunne afskaffes ved c-Jun siRNA transfektion.
Konklusion
AhR-aktivering øger gastrisk kræft celle invasionsevne sandsynligvis gennem en c-Jun-afhængige induktion af MMP-9. Vores resultater giver indsigt i den mekanisme og funktion AhR vej og dens indvirkning på mavekræft progression.
Baggrund
Aryl kulbrinte receptor (AhR) er en ligand-aktiverede transkriptionsfaktor af den grundlæggende helix-loop-helix /Per-Arnt-Sim familie. I fravær af ligand, AhR er til stede i cytosolen i form af et kompleks med to chaperone Hsp90s, en smal protein (p23) og en immunophilin-lignende protein (XAP2) [1, 2]. Efter ligand, såsom 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-para-dioxin (TCDD, den mest potente og klassisk exogent AhR ligand) binding, de Chaperon proteiner dissocierer og AhR translokere ind i kernen for at danne en heterodimer med sin partner molekyle aryl carbonhydrid receptor nuklear translokatoren (Arnt) [3, 4]. Denne heterodimer binder til den specifikke DNA-region betegnes dioxin responselement (DRE), som har en kerne sekvens af 5'-TNGCGTG-3 ', og derved aktiverer et batteri af gener udtryk [5-7].
Historisk undersøgelser Ahr pathway har fokuseret på den transkriptionelle regulering af gener, der koder xenobiotiske enzymer såsom cytochrom P450-enzymer [8]. Nylige undersøgelser viste en tæt sammenhæng mellem AhR og mælkekirtler tumorigenese [7, 9]. AHR gen-polymorfier er blevet forbundet med en øget risiko for lunge- og brystcancer [10, 11]. Forøget ekspression af AhR er blevet rapporteret i lunge, bryst, og pancreascancer hos mennesker [7, 12, 13]. Undersøgelser tyder også, at konstitutivt aktiv AhR kan fremme hepatocarcinogenese i mus [14]. Disse data viste en tæt sammenhæng mellem AhR og tumorigenese. Forholdet mellem AhR og tumorprogression er ikke klart.
Tumorceller invasion og metastase er en kompliceret proces blandt hvilke nedbrydning af ekstracellulær matrix (ECM) og basalmembranen er et afgørende skridt. Tumorinvasion og metastase er afhængig af ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP'er) at ødelægge ECM og basalmembranen at tillade cellemigrering. MMP'er er en gruppe af zink afhængige metallopeptidaser [15-17]. Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) er en af ​​de type IV collagenase /gelatinaser, der nedbryder basalmembran collagener og gelatiner [16]. MMP-9 er almindeligt forbundet med tumorinvasion og metastase [17]. Syntesen af ​​MMP-9 reguleres af flere vækstfaktorer, cytokiner og hormoner [16, 18]. Nylig undersøgelse forbundne TCDD-associerede læsioner med afvigende matrix metabolisme [8]. Microarray data viser, at TCDD /AhR ændre ekspression af gener inddrage i matrix metabolisme og aflejring [8]. Villano et al [19] og Haque et al [18] rapporterede, at AhR agonist TCDD kunne inducere MMP-9-ekspression i huamn melanomceller og prostatacancerceller. Disse undersøgelser antyder, at MMP-9-ekspression kan være en fælles endepunkt for aktivering af AhR pathway [8, 19].
Mavekræft er den fjerde mest almindelige malignitet og den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i verden [20]. Gastrisk cancerceller invasion og metastase ofte føre til en dårlig prognose. Flere undersøgelser forbundet AhR pathway aktivering til gastrisk carcinogenese. Chen et al fundet forøget ekspression af AhR i to humane gastriske cancercellelinier (RF1 og RF48) ved microarray analyse [21]. Ma et al rapporterede, at samtidig ekspression af AhR og CYP1A1 er korreleret med gastrisk cancerudvikling [22]. Andersson et al fandt, at konstitutivt aktiveret AhR kunne inducere mavetumorer i en transgen musemodel [23]. I en anden af ​​vores studier, fandt vi, at AhR udtryk og nuklear translokation var signifikant højere i mavekræft end i præmaligne læsioner og normal gastrisk mucosa [24]. Forholdet mellem AhR pathway aktivering og gastrisk cancer invasion og metastase er stadig ikke klar. Derfor undersøgte vi effekten af ​​AhR pathway aktivering på humane gastriske kræftceller. Vores data præsenteret her viser, at AhR pathway kan aktiveres i gastrisk cancer AGS celler og AhR pathway aktivering i AGS celler inducerer MMP-9-ekspression og forbedrer AGS celler migration og invasion aktivitet. Desuden vores data viser, at denne AhR aktivering-induceret MMP-9-ekspression medieres af c-Jun,.
Resultater og diskussion
AhR-aktivering i AGS celler
I et andet af vore undersøgelser, vi har vist, at der var en høj grad af AhR ekspression i AGS celler [24]. For at bestemme om AhR pathway kan aktiveres i denne cellelinie, undersøgte vi ekspressionen af ​​cytochrom P-450 1A1 (CYP1A1), en klassisk målgen af ​​AhR pathway, efter AhR agonist TCDD eksponering. RT-PCR og Western blot-analyse viste, at både CYP1A1 mRNA (fig. 1A) og protein (fig. 1B) ekspression i AGS celler blev forøget på en dosis-afhængig måde efter TCDD behandling. For at afgøre, om dette TCDD-induceret CYP1A1 udtryk er AhR-afhængig, blev AhR antagonist resveratrol (RSV), der anvendes til at blokere AhR vej. Som vist i fig. 1C og 1D, RSV kunne ændre TCDD-induceret CYP1A1 ekspression i en dosis-afhængig måde. Disse data viste, at AhR pathway kan aktiveres i AGS celler ved TCDD. Figur 1 AhR agonisten TCDD og AhR antagonist RSV reguleret CYP1A11 ekspression i AGS-celler. Efter forskellige koncentrationer (som vist ovenfor) af TCDD behandling i 24 timer, (A) RT-PCR-analyse af CYP1A1 mRNA-ekspression i en koncentration-respons. (B) Western blot-analyse af CYP1A1-protein ekspression i en koncentration-respons. Efter co-behandling med TCDD (1 nM) og RSV (ved forskellige koncentrationer som vist ovenfor) i 24 timer, (C) mRNA-ekspression af CYP1A1 blev påvist ved RT-PCR. (D) Protein ekspression af CYP1A1 blev detekteret ved Western blot.
AhR pathway aktivering i AGS-celler inducerer MMP-9-ekspression
Tidligere undersøgelser har vist, at i flere cancerceller, AhR agonist TCDD eksponering aktiverer MMP-9-genekspression [18, 19]. For at afgøre, om TCDD behandling af AGS celler resulterer i en induktion af MMP-9 udtryk, vi har registreret MMP-9 mRNA ved hjælp af RT-PCR efter TCDD eksponering. Som vist i fig. 2A, MMP-9 mRNA-ekspression blev induceret i en dosisafhængig måde efter TCDD behandling. For at undersøge den rolle, som AhR pathway ved mediering TCDD-induceret MMP-9-ekspression i AGS-celler, kulturer blev co-behandlet med TCDD og Ahr antagonisten resveratrol. Samtidig behandling med resveratrol afskaffet TCDD-induceret MMP-9-ekspression (fig. 2C) viste, at TCDD-aktivering af MMP-9-ekspression er afhængig af AhR pathway. Ovenstående data viser, at AhR pathway aktivering i AGS-celler inducerer MMP-9-mRNA-ekspression. I de fleste celletyper, genet transkription af MMP-9 er inducerbar, og efter translation enzymet straks udskilles og aktiveres gennem cystein-kontaktmekanismen [25]. For at bestemme om disse ændringer i genekspression følgende AhR pathway aktivering resultere i ændringer i MMP-9 enzymatisk aktivitet, udførte vi gelatinezymografi. Resultaterne viste, at MMP-9-aktivitet i medier gradvist øges med koncentrationen forøgelse af TCDD i medier (fig. 2B), og disse ændringer kan vendes ved resveratrol behandling på en dosis-afhængig måde (fig. 2D). Disse data viser, at AhR pathway aktiverings-induceret stigning i MMP-9-ekspression korrelerer med en stigning i MMP-9-aktivitet. Figur 2 AhR agonist TCDD og AhR antagonist RSV reguleret MMP-9-ekspression og aktivitet i AGS celler. Efter forskellige koncentrationer (som vist ovenfor) af TCDD behandling i 24 timer, (A) RT-PCR-analyse af MMP-9 mRNA-ekspression i en koncentration-respons. (B) gelatinezymografi analyse af MMP-9-protein-aktivitet i en koncentration-respons. Efter co-behandling med TCDD (1 nM) og RSV (ved forskellige koncentrationer som vist ovenfor) i 24 timer, (C) mRNA-ekspression af MMP-9 blev påvist ved RT-PCR. (D) Protein aktivitet af MMP-9 blev detekteret ved gelatinezymografi.
AhR baneaktivering forbedrer AGS migration og invasion celler
MMP-9 er en af ​​type IV collagenase /gelatinaser, der kan nedbryde ECM komponenter. MMP-9 er almindeligt forbundet med tumorinvasion og metastase [17]. Undersøgelser har vist en signifikant korrelation mellem MMP-9-ekspression og invasionsevne og lymfeknudemetastase af gastriske carcinomer [26-28]. For at undersøge om AhR aktivering-induceret MMP-9-ekspression og aktivitet i AGS celler resulterer i øget migration og invasion, udføres vi sårheling migration assay og transwell migration og invasion assay. Efter TCDD behandling blev migration afstand af AGS celler signifikant forøget med en dosisafhængig måde sammenlignet med kontrolceller (P < 0,01) (. Figur 3A). Transwell Resultaterne viste en signifikant stigning i migration (fig 3B.) Og invasion (fig 3C.) Evner af AGS-celler, når cellerne blev inkuberet med TCDD i koncentrationer fra 0,1 nmol /l (P < 0,01) til 100 nmol /l ( p < 0,01). ingen signifikant effekt på den migration og invasion blev fundet i TCDD koncentration < 0,1 nmol /l (p 0,05). Disse resultater viste, at AhR baneaktivering forbedrer gastrisk cancer AGS celler migration og invasion. Nedbrydning af ECM og basalmembranen er et vigtigt skridt i tumor invasion og metastase. Det involverer virkningen af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP'er). Vores undersøgelse viste, at AhR pathway aktivering kan fremkalde MMP-9-ekspression og enzymatisk aktivitet, og fremme AGS celler migration og invasion. Andre undersøgelser viste, at AhR-aktivering kunne fremkalde en række MMP'er udtryk [19, 29]. AhR baneaktivering forbedrer gastrisk cancer AGS celler migration og invasion kan også skyldes andre MMP'er ekspression udover MMP-9-ekspression. Figur 3 Virkningen af ​​AhR agonist TCDD på AGS celler migration og invasion. (A) sårheling migration assay. (B) Transwell migration assay. (C) Transwell invasion assay.
C-Jun-medieret MMP-9-ekspression induceret af AhR pathway aktivering
Mekanismen for TCDD-inducerede ændringer i MMP-9-ekspression er ikke helt klar. Nylige undersøgelser rapporteret, at TCDD kan inducere c-Jun-ekspression [30, 31] og c-Jun er et målgen af ​​AhR pathway [8]; promotorsekvensen i 5'-flankerende region af humant MMP-9 genet indeholder c-Jun bindingssteder [16] og c-Jun kan induceret MMP-9-ekspression [32]; transskriptionen aktivitet af c-Jun er signifikant forbedret i gastrisk cancer [33]. Basere på disse forsøgsresultater, foreslog vi en hypotese om, at TCDD-induceret MMP-9-ekspression i AGS celler medieres af c-jun. For at demonstrere denne hypotese, først påvist vi c-Jun-ekspression i AGS celler efter TCDD behandling, og fandt, at både c-Jun-mRNA (fig. 4A og 4C) og protein (fig. 4B og 4D) ekspression i AGS celler blev forøget i en dosis (fig. 4A og 4B) og tid (fig. 4C og 4D) afhængig måde efter TCDD behandling, og dette TCDD-induceret c-Jun-ekspression kunne reserveres af AhR antagonist resveratrol (fig. 4E og 4F). Ovenstående data viste, at c-Jun er et målgen af ​​AhR pathway i AGS celler. For yderligere at demonstrere, at c-Jun kan mediere TCDD-induceret MMP-9 udtryk, blev siRNA transfektion udført for at lukke munden på c-Jun mRNA i AGS celler. Resultaterne viste, at c-Jun siRNA (slutkoncentration 50 nmol /l) transfektion næsten helt ophævet c-Jun-ekspression i AGS celler både i mRNA-niveau (fig. 4G) og i proteinniveau (fig. 4H). Derfor, efter c-Jun siRNA transfektion i 48 timer blev AGS celler behandlet med TCDD ved koncentration 10 nmol /l i 24 timer, cellepellet og kulturmedier blev opsamlet, og MMP-9 mRNA-ekspression og aktivitet blev målt. Som vist i fig. 4I og 4J, MMP-9 mRNA-ekspression og aktivitet i ubehandlet kontrol AGS celler var meget svag; Efter TCDD (10 nmol /l) behandling, MMP-9 mRNA-ekspression og aktivitet var signifikant øget; Denne TCDD-induceret MMP-9-ekspression og aktivitet stigning kunne afskaffes ved c-Jun siRNA transfektion og ikke være påvirket af kontrol siRNA transfektion. Ovenstående data viste, at c-Jun-medieret MMP-9-ekspression induceret af AhR pathway aktivering i AGS celler. Figur 4 c-Jun medierer TCDD-induceret MMP-9-ekspression og aktivitet. (A) TCDD inducerer c-Jun-mRNA ekspression i en dosis-afhængig måde. (B) TCDD inducerer c-Jun-protein ekspression i en dosis-afhængig måde. (C) TCDD inducerer c-Jun-mRNA ekspression i en tidsafhængig måde. (D) TCDD inducerer c-Jun-protein ekspression i en tidsafhængig måde. (E) RSV reverserer TCDD-induceret c-Jun-mRNA-ekspression. (F) RSV reverserer TCDD-induceret c-Jun-protein-ekspression. (G) c-Jun siRNA tavshed c-Jun-mRNA-ekspression. (H) c-Jun siRNA tavshed c-Jun proteinekspression. (I) c-Jun siRNA inhiberer TCDD-induceret MMP-9 mRNA-ekspression. (J) c-Jun siRNA inhiberer TCDD-induceret MMP-9-aktivitet stigning.
Konklusion
Som konklusion den foreliggende undersøgelse viser, at AhR pathway kan aktiveres i gastrisk cancer AGS celler og AhR baneaktivering inducerer MMP-9 ekspression og aktivitet som i sidste ende bidrager til AGS migration og invasion in vitro. Endvidere vore data viser, at denne AhR aktiverings-induceret MMP-9-ekspression medieres af c-Jun. Fordi nedbrydning af ECM og basalmembranen er et vigtigt skridt i tumor invasion og metastase, vores resultater giver indsigt i den mekanisme og funktion AhR vej og dens indvirkning på disse processer under mavekræft progression.
Metoder
Celledyrkning
Gastrisk cancercellelinie AGS blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Hyclone) suppleret med 2 mM glutamin, 10% føtalt bovint serum (Hyclone), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml gentamycin. Cellulære miljø blev holdt ved 5% CO 2 og 37 ° C. Celler blev høstet fra den eksponentielle vækstfase og totalt RNA og protein blev fremstillet som beskrevet nedenfor.
Behandling af celler Salg TCDD og Resveratrol blev indkøbt fra Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Efter inkubation i 24 timer blev cellerne behandlet med TCDD ved forskellige koncentrationer (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) eller TCDD (1 nM) plus Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 pM) til 24 timer, eller behandlet med TCDD (1 nM) i forskellige tidsrum (0, 1, 6, 24, 48, 72 timer) hhv. Alle lægemidler blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Kontrol celler modtog 0,1% DMSO alene.
Små interfererende RNA-syntese
Små interfererende RNA (siRNA) blev syntetiseret og højtydende renset (Ribo Biotechnology, Guangzhou). c-Jun siRNAs (sense, CCAAGAACGUGACAGAUGA-DTDT, antisense, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-DTDT) og kontrol siRNA'er (forstand, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-DTDT, antisense, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-DTDT), idet ingen homologi med nogen kendte humane gener, blev opløst i RNase-frit Hedeselskabet 2O til en endelig koncentration på 20 pmol /L.
Lille interfererende RNA transfektion
Celler (5 x 10 5) blev udpladet på brønde i seks-brønds cellekulturplader og fik lov at adhærere i 24 timer. Fire mikroliter lipofectamin 2000 (Invitrogen) per brønd blev tilsat til serumfrit Opti MEM (Invitrogen) til en endelig kompleksdannende volumen på 250 pi, blandet forsigtigt og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter. Fem mikroliter siRNA opløsning pr brønd blev fortyndet med 250 pi serumfrit Opti MEM. Bland den fortyndede siRNA opløsning og den fortyndede lipofectamin 2000 forsigtigt, og der inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Den lipofectamin 2000 /siRNA-komplekset blev tilsat til brøndene indeholdende 1500 pi RPMI 1640 med 10% FBS og inkuberet i normale cellekulturbetingelser. Alle assays blev udført efter 48 timer.
RNA-isolering og RT-PCR
Totalt RNA af celler blev ekstraheret under anvendelse af Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) i overensstemmelse med producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret med 1 ug totalt RNA under anvendelse af revers transkriptase, ReverTra AceTM (Toyobo Co., Osaka, Japan) under følgende betingelse: 30 ° C i 10 minutter, 42 ° C i 20 min, 99 ° C i 5 minutter, og 4 ° C i 5 min. PCR af cDNA blev udført i en reaktionsblanding (30 pi) indeholdende 2 pi template cDNA, 2,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP'er, 0,3 uM primer 1 og 2, og 1 enhed Taq-DNA-polymerase (New England Biolabs). Amplifikation blev udført under anvendelse af følgende betingelse: 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 25-32 cyklusser (denaturere i 45 s ved 94 ° C, udglødning i 30 s, og strækker sig i 30 s ved 72 ° C), og derefter 72 ° C i 7 min. Detaljerne i primere, annealingstemperatur, amplifikationscykler, og PCR-produktet størrelse for hvert gen er anført i tabel 1. PCR-produkter blev elektroforesebehandlet på 1,5% agarosegel, farvet med ethidiumbromid og visualiseret med en ultraviolet (UV) transilluminator. Båndintensiteter i RT-PCR blev kvantificeret under anvendelse Mængde One imaging analyse software. Band intensiteter af CYP 1A1, MMP-9 og c-Jun-mRNA blev normaliseret med tilsvarende band intensiteter af beta-actin. Dataene blev rapporteret som middelværdi ± SD.Table 1 Primer sekvenser og PCR amplifikationsbetingelserne
Gene
Primere (5 '→ 3')

Annealing temperatur (° C)
Cycles
Produkt størrelse (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta-actin
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Forkortelser: S, fornemmer primer; A, antisense-primer
Western blot-analyse
Cellepellets blev homogeniseret i en lysebuffer indeholdende 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 50 mM β-glycerophosphat, 2 mM natriumorthovanadat, 10% glycerol, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT og 1 × Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Lysatet blev centrifugeret ved 13000 rpm og 4 oC i 10 minutter. Supernatanten var den totale cellelysat. Proteinkoncentration blev målt under anvendelse af BCA protein assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Tredive mikrogram protein blev påsat pr bane, adskilt af 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese, og overført til ækvilibreret polyvinylidendifluoridmembran ved elektroblotting. Membraner blev blokeret med TBS-T puffer indeholdende 5% (w /v) fedtfri tørmælk. Ahr CYP1A1, c-Jun og beta-actin blev påvist i 2 timer ved hjælp af antistoffer mod AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, arbejder fortynding 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, der arbejder fortynding 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, arbejder fortynding 1: 200) og beta-actin (DZ0, Cell Signaling Technology, arbejder fortynding 1: 1000). Efter sekundært antistof inkubation (arbejdsfortynding 1: 2000), forøget kemiluminescens (Pierce Biotechnology, Inc.) bestemtes ved eksponering for røntgenfilm. Båndintensiteter i Western-blot blev kvantificeret under anvendelse Mængde One imaging analyse software. Band intensiteter af CYP 1A1 og c-Jun blev normaliseret med tilsvarende band intensiteter af beta-actin. Data blev rapporteret som middelværdi ± SD.
Gelatinezymografi
Medier fra TCDD behandlede kulturer blev elektroforeret på SDS-PAGE, hvor gelen indeholder 0,1% (vægt /volumen) gelatine. Gelen blev inkuberet natten over i en Zn 2+ og Ca 2+ buffer for at tillade de MMP'er at genvinde deres rette struktur og nedbrydes gelatinen i gelen. Klare hvide bånd på Coomassie farvede gel er indikative for MMP-aktivitet. Båndintensiteter blev kvantificeret under anvendelse Mængde One imaging analyse software.
Sårheling migration assay
Til måling af cellemigrering under sårheling blev AGS celler podet i individuelle brønde i en 6-brønds dyrkningsplade. Når cellerne nåede en sammenflydende tilstand, blev cellelag såret med en plast mikropipette spids med en stor åbning. Mediet og debris blev aspireret væk og erstattet med 2,5 ml frisk serumfrit medium, som indeholdt forskellige koncentrationer af TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). Celler blev fotograferet hver 12. timer efter sårdannelse ved fasekontrastmikroskopi. For evaluering af "sårlukning," fem tilfældigt udvalgte punkter langs hvert sår blev markeret, og den vandrette afstand migrere celler fra den indledende sår blev målt. Data blev rapporteret som middelværdi ± SD.
Transwell migration og invasion assay
behandlede eller ubehandlede kontrolceller blev podet tredobbelt i det øverste kammer af en Transwell indsætte (Corning, New York, NY, USA) i serumfrit medium ved en densitet på 1 x 10 5 per brønd. For Migration assays, blev medium indeholdende 5% serum anbragt i det nedre kammer til at virke som en kemoattraktant, og cellerne blev yderligere inkuberet i 18 timer. Nonmigratory celler blev fjernet fra det øverste kammer ved skrabning, og cellerne forbliver på den nedre overflade af indsatsen blev farvet under anvendelse af 0,1% krystalviolet i 15 minutter. Celler blev talt under et mikroskop. Invasion assays blev udført som for migrationen ovenfor beskrevne assays, undtagen inserter blev forud belagt med den ekstracellulære matrix (ECM) erstatning Matrigel (BD Biosciences) og inkuberet over en 24-timers periode. Hver klon blev udpladet i tredobbeltbestemmelse i hvert forsøg og hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Cell migration (eller invasion) evne = (celle antal behandlede gruppe /celle antal kontrolgruppe) x 100%.
Noter
Tie-Li Peng, Jie Chen bidraget ligeligt til dette arbejde.
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.670.949, No. 30.671.904 og No.30871145), et tilskud til ny lærer fra kinesiske ministerium for Uddannelse (No.20070558288), et tilskud til ph.d. vejleder fra kinesiske undervisningsministerium (nr 20060558010), tilskud fra Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (No.5300767 og No.7001641).
Forfatternes original indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 4

• Betinget overlevelse analyse koreanske patienter med mavekræft gennemgår helbredende gastrektomi
• Feasibility af forbedret bedring efter operation i gastrisk kirurgi: en retrospektiv study