activation de la voie du récepteur des hydrocarbures aryliques améliore gastrique invasivité des cellules cancéreuses probablement par une induction de c-Jun-dépendante de l'activation de la métalloprotéinase matricielle-9

Aryle voie du récepteur des hydrocarbures augmente gastrique invasivité des cellules cancéreuses probablement par une induction de c-Jun dépendant de la métalloprotéinase matricielle-9
Résumé de l'arrière-plan
récepteur d'hydrocarbures aryle aberrante (AhR) expression et voie AhR activation sont impliqués dans la carcinogenèse gastrique. Cependant, la relation entre AhR activation de la voie et la progression du cancer de l'estomac est encore peu clair. Dans cette étude, nous avons utilisé la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-para-dioxine (TCDD), un ligand classique et le plus puissant de AhR, pour activer la voie AhR et étudié l'effet de AhR activation de la voie sur le cancer gastrique humain cellules AGS Résultats de l'invasion et exploré le mécanisme correspondant.
Pour déterminer si la voie AhR peut être activée dans les cellules AGS, nous avons examiné l'expression de CYP1A1, un gène cible classique de voie AhR, après exposition à la TCDD. RT-PCR et l'analyse western blot ont montré que les deux CYP1A1 ARNm et l'expression des protéines ont été augmentés d'une manière dose-dépendante après traitement TCDD et AhR antagoniste resvératrol (RSV) pourrait inverser cette CYP1A1 expression induite de TCDD. Pour déterminer si le traitement de cellules AGS de la TCDD entraîne une induction de l'expression de MMP-9, on a détecté l'ARNm de MMP-9 en utilisant une RT-PCR et la détection de la MMP-9 en utilisant une activité enzymatique zymographie sur gélatine. Les résultats ont montré que les deux MMP-9 expression de l'ARNm et l'activité enzymatique ont été progressivement augmenté avec l'augmentation de la concentration en TCDD dans les milieux et ces changements pourraient être inversées par traitement du VRS d'une manière dépendante de la dose. Pour examiner si AhR activation induite par MMP-9 expression et l'activité dans les cellules AGS entraîne une augmentation de la migration et de l'invasion, nous avons effectué la guérison des plaies test de migration et Transwell test de migration et de l'invasion. Après le traitement TCDD, la distance de migration et de la migration et l'invasion des capacités des cellules AGS ont été augmentées d'une manière dose-dépendante. Pour démontrer AhR induite par activation de MMP-9 expression est médiée par c-Jun, siRNA transfection a été effectuée pour faire taire c-Jun ARNm dans les cellules AGS. Les résultats indiquent que MMP-9 expression de l'ARNm et l'activité dans les cellules AGS témoins non traités ont été très faibles; Après avoir TCDD (10 nmol /L), le traitement, la MMP-9 expression et l'activité de l'ARNm ont été significatives augmenté; Cette MMP-9 expression et l'activité induite par augmentation de TCDD pourrait être abolie par c-Jun transfection de siRNA.
Conclusion
activation de la voie AhR gastrique augmente l'invasivité des cellules cancéreuses probablement par une induction de c-Jun dépendant de MMP-9. Nos résultats permettent de mieux comprendre le mécanisme et la fonction de la voie AhR et son impact sur la progression du cancer gastrique.
Contexte
Aryle récepteur des hydrocarbures (AhR) est un facteur de transcription activés par des ligands de l'hélice-boucle-hélice basique /Per-Arnt-Sim famille. En l'absence de ligand, AhR est présent dans le cytosol sous la forme d'un complexe avec deux chaperon Hsp90s, une protéine smal (p23), et une protéine immunophilin-like (XAP2) [1, 2]. Sur ligand tel que la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-para-dioxine (TCDD, exogène AhR ligand le plus puissant et classique) de liaison, les protéines chaperonnes se dissocient et AhR translocation dans le noyau pour former un hétérodimère avec son aryl molécule partenaire translocation du récepteur d'hydrocarbures nucléaire (ARNT) [3, 4]. Cet hétérodimère se lie à la région d'ADN spécifique appelée élément de réponse à la dioxine (DRE), qui a une séquence de base de TNGCGTG 5'-3 ', et par conséquent déclenche une batterie de gènes d'expression [5-7].
Historiquement, les études de la voie AhR ont mis l'accent sur la régulation de la transcription des gènes codant pour des enzymes métabolisant des xénobiotiques tels que les enzymes du cytochrome P450 [8]. Des études récentes ont démontré une relation étroite entre AhR et glande mammaire tumorigenèse [7, 9]. polymorphismes du gène AhR ont été liés à un risque accru de cancer du poumon et les cancers du sein [10, 11]. L'expression accrue de AhR a été rapporté dans le poumon, du sein et les cancers du pancréas chez l'homme [7, 12, 13]. Des études suggèrent également que AhR constitutivement active peut favoriser hépatocarcinogenèse chez la souris [14]. Ces données indiquent une relation étroite entre AhR et la tumorigenèse. Cependant, la relation entre AhR et la progression de la tumeur est pas claire.
Cellules tumorales invasion et la métastase est un processus complexe dont la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM) et la membrane basale est une étape cruciale. l'invasion tumorale et les métastases repose sur l'expression de métalloprotéases matricielles (MMPs) pour détruire la membrane d'ECM et la sous-sol pour permettre la migration des cellules. MMP sont un groupe de dépendants zinc métallopeptidases [15-17]. Matrice métalloprotéinase-9 (MMP-9) est l'un des collagénase de type IV /gélatinases qui dégradent sous-sol collagènes membranaires et gélatines [16]. MMP-9 est largement associée à une invasion tumorale et les métastases [17]. La synthèse de MMP-9 est régulée par plusieurs facteurs de croissance, cytokines et hormones [16, 18]. étude liées lésions récentes TCDD associées avec le métabolisme de la matrice aberrante [8]. les données de biopuces démontrent que TCDD /AhR modifier l'expression des gènes impliquent dans le métabolisme de la matrice et dépôt [8]. Villano et al [19] et Haque et al [18] ont rapporté que l'agoniste AhR TCDD pourrait induire l'expression de MMP-9 dans des cellules de mélanome huamn et des cellules cancéreuses de la prostate. Ces études suggèrent que l'expression de MMP-9 peut être un critère commun pour l'activation de la voie AhR [8, 19].
Le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde [20]. Des cellules de cancer gastrique invasion et la métastase conduisent souvent à un mauvais pronostic. Plusieurs études liées activation de la voie AhR à la cancérogenèse gastrique. Chen et al ont trouvé une expression accrue de AhR dans deux lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses (RF1 et RF48) par l'analyse des microréseaux [21]. Ma et al ont rapporté que l'expression simultanée de AhR et CYP1A1 est en corrélation avec le développement du cancer gastrique [22]. Andersson et al ont constaté que constitutivement activé AhR pourrait induire des tumeurs de l'estomac dans un modèle de souris transgénique [23]. Dans un autre de nos études, nous avons constaté que l'expression AhR et la translocation nucléaire étaient significativement plus élevée dans le cancer gastrique que dans les lésions précancéreuses et de la muqueuse gastrique normale [24]. Cependant, la relation entre AhR activation de la voie et l'invasion de cancer de l'estomac et des métastases est pas encore clair. Par conséquent, nous avons étudié l'effet de l'activation de la voie AhR sur les cellules cancéreuses gastriques humaines. Nos données présentées ici démontrent que la voie AhR peut être activée dans les cellules AGS gastriques cancéreuses et AhR activation de la voie dans les cellules AGS induit l'expression de MMP-9 et améliore la migration des cellules AGS et de l'activité d'invasion. Résultats et discussion En outre, nos données montrent que cette activation induite-MMP-9 expression AhR est médiée par c-juin
activation de la voie AhR dans les cellules AGS
Dans un autre de nos études, nous avons démontré qu'il y était un haut niveau d'expression AhR dans les cellules AGS [24]. Pour déterminer si la voie AhR peut être activée dans cette lignée cellulaire, nous avons examiné l'expression de cytochrome P-450 1A1 (CYP1A1), un gène cible classique de voie AhR, après AhR exposition agoniste TCDD. RT-PCR et analyse par transfert de Western a montré que les deux ARNm CYP1A1 (fig. 1A) et de la protéine (Fig. 1B) expression dans les cellules AGS ont augmenté d'une manière dépendante de la dose après un traitement TCDD. Pour déterminer si cette CYP1A1 expression induite de TCDD-est AhR dépendante, AhR antagoniste resvératrol (RSV) a été utilisé pour bloquer la voie AhR. Comme on le voit sur la Fig. 1C et 1D, RSV pourrait inverser CYP1A1 expression induite de TCDD dans une manière dose-dépendante. Ces données ont démontré que la voie AhR peut être activée dans les cellules AGS de la TCDD. Figure 1 AhR agoniste TCDD et AhR RSV antagoniste expression CYP1A11 régulée dans les cellules AGS. Après différentes concentrations (comme indiqué ci-dessus) de traitement TCDD pendant 24 heures (A) Analyse par RT-PCR de l'expression de l'ARNm de CYP1A1 dans une concentration-réponse. (B) Analyse par transfert Western de l'expression de la protéine CYP1A1 dans une concentration-réponse. Après co-traitement avec TCDD (1 nM) et le RSV (à diverses concentrations, comme indiqué ci-dessus) pendant 24 heures, (C) l'expression d'ARNm de CYP1A1 a été détectée par RT-PCR. (D) L'expression des protéines de CYP1A1 a été détectée par Western blot.
AhR activation de la voie dans les cellules AGS induire MMP-9 expression
Des études antérieures ont montré que, dans plusieurs cellules cancéreuses, AhR exposition agoniste TCDD active MMP-9 expression génique [18, 19]. Afin de déterminer si le traitement de TCDD des cellules AGS entraîne une induction de MMP-9 expression, nous avons détecté MMP-9 ARNm par RT-PCR après une exposition à la TCDD. Comme on le voit sur la fig. 2A, la MMP-9 expression de l'ARNm a été induite d'une manière dépendante de la dose après un traitement TCDD. Pour examiner le rôle de la voie AhR dans la médiation de TCDD induite MMP-9 expression dans les cellules AGS, les cultures ont été co-traités avec TCDD et l'antagoniste du resvératrol AhR. Le co-traitement avec du resvératrol a supprimé induite par TCDD-MMP-9 expression (fig. 2C) ont démontré que l'activation TCDD de MMP-9 expression est dépendante de la voie de la procréation assistée. les données ci-dessus indiquent que l'activation de la voie AhR dans les cellules AGS induit la MMP-9 expression de l'ARNm. Dans la plupart des types de cellules, la transcription du gène de MMP-9 est inductible, et après la traduction de l'enzyme sécrétée est immédiatement activée et à travers le mécanisme cystéine commutateur [25]. Pour déterminer si ces changements dans l'expression des gènes suivants résultat de l'activation de la voie AhR des changements dans la MMP-9 activité enzymatique, nous avons effectué zymographie sur gélatine. Les résultats indiquent que MMP-9 activité dans les milieux augmente progressivement avec l'augmentation de la concentration en TCDD dans le support (fig. 2B), et ces modifications pourrait être inversée par un traitement resveratrol d'une manière dose-dépendante (Fig. 2D). Ces données démontrent que l'augmentation de la voie AhR activation induite par l'expression de MMP-9 est corrélée avec une augmentation de l'activité de MMP-9. Figure 2 AhR agoniste TCDD et AhR RSV antagoniste réglementés MMP-9 expression et l'activité dans les cellules AGS. Après différentes concentrations (comme indiqué ci-dessus) de traitement TCDD pendant 24 heures (A) Analyse par RT-PCR de la MMP-9 expression de l'ARNm dans une concentration-réponse. (B) Analyse Gélatine zymographie de la MMP-9 activité de la protéine en une concentration-réponse. Après co-traitement avec TCDD (1 nM) et le RSV (à diverses concentrations, comme indiqué ci-dessus) pendant 24 heures, (C) l'expression d'ARNm de la MMP-9 a été détectée par RT-PCR. (D) une activité de protéine de MMP-9 a été détecté par zymographie sur gélatine.
Activation de la voie AhR améliore la migration des cellules AGS et l'invasion
MMP-9 est l'un des collagénase de type IV /gélatinases qui peuvent dégrader les composants de l'ECM. MMP-9 est largement associée à une invasion tumorale et les métastases [17]. Des études ont démontré une corrélation significative entre la MMP-9 expression et l'invasivité et métastase ganglionnaire des carcinomes gastriques [26-28]. Pour examiner si AhR activation induite par MMP-9 expression et l'activité dans les cellules AGS entraîne une augmentation de la migration et de l'invasion, nous avons effectué la guérison des plaies test de migration et Transwell test de migration et de l'invasion. Après traitement TCDD, la distance de migration des cellules AGS a été significativement augmentée par une manière dépendante de la dose par comparaison avec des cellules témoins (P < 0,01) (fig. 3A). les résultats transwell ont montré une augmentation significative de la migration (figure 3B.) et l'invasion (figure 3C). capacités des cellules AGS lorsque les cellules ont été incubées avec TCDD dans des concentrations allant de 0,1 nmol /L (P < 0,01) à 100 nmol /l ( p < 0,01). aucun effet significatif sur la migration et l'invasion a été trouvée à concentration TCDD < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Ces résultats ont démontré que l'activation de la voie AhR améliore le cancer gastrique cellules AGS de la migration et de l'invasion. La dégradation de l'ECM et la membrane basale est une étape essentielle dans l'invasion tumorale et les métastases. Il implique l'action des métalloprotéinases de matrice (MMP). Notre étude a démontré que l'activation de la voie AhR pourrait induire la MMP-9 expression et l'activité enzymatique, et de promouvoir les cellules AGS migration et l'invasion. D'autres études ont indiqué que l'activation de la voie AhR pourrait induire une variété de MMP expression [19, 29]. activation de la voie AhR améliore le cancer gastrique AGS cellules migration et l'invasion peut être également due à d'autres MMP expression en plus MMP-9 expression. Figure 3 L'effet de AhR agoniste TCDD sur les cellules AGS de la migration et de l'invasion. (A) Cicatrisation test de migration. essai de migration (B) Transwell. (C) Transwell essai d'invasion.
C-Jun médiation MMP-9 expression induite par l'activation de la voie AhR
Le mécanisme des changements induits par la TCDD dans MMP-9 expression est pas tout à fait claire. Des études récentes ont rapporté que TCDD peut induire l'expression c-Jun [30, 31] et c-Jun est un gène cible de AhR voie [8]; la séquence de promoteur dans la région flanquante 5 'du gène de la MMP-9 humain contient des sites de c-Jun [16] et la liaison c-Jun induit peut MMP-9 expression [32]; l'activité de transcription de c-Jun est important accrue dans le cancer gastrique [33]. Fondant sur ces résultats de l'étude, nous avons proposé une hypothèse que TCDD induite par MMP-9 expression dans les cellules AGS est médiée par c-juin Pour démontrer cette hypothèse, nous avons d'abord détecté l'expression de c-Jun dans les cellules AGS après le traitement TCDD, et nous avons trouvé que les deux c-Jun ARNm (fig. 4A et 4C) et de protéines (figure 4B. Et 4D) expression dans les cellules AGS ont augmenté dans un (4A et 4B fig.) et le temps dose (fig. 4C et 4D) de manière dépendante de la suite du traitement TCDD, et ce c-Jun expression induite TCDD peuvent être réservés par AhR antagoniste resvératrol (fig. 4E et 4F). Au-dessus des données a démontré que c-Jun est un gène cible de AhR voie dans les cellules AGS. Pour démontrer en outre que c-Jun peut servir de médiateur induite par TCDD-MMP-9 expression, siRNA transfection a été effectuée pour faire taire c-Jun ARNm dans les cellules AGS. Les résultats ont démontré que l'ARNsi c-Jun (concentration finale de 50 nmol /L) transfection presque complètement aboli l'expression de c-Jun dans les cellules AGS à la fois dans le niveau de l'ARNm (fig. 4G) et du niveau de la protéine (fig. 4 H). Par conséquent, après c-Jun transfection de siRNA pendant 48 heures, les cellules ont été traitées avec AGS TCDD, à une concentration de 10 nmol /L pendant 24 heures, culot de cellules et les milieux de culture ont été collectés, et MMP-9 expression et l'activité de l'ARNm ont été mesurés. Comme on le voit sur la fig. 4E et 4J, MMP-9 expression de l'ARNm et l'activité dans les cellules AGS de contrôle non traitées étaient très faibles; Après avoir TCDD (10 nmol /L), le traitement, la MMP-9 expression et l'activité de l'ARNm ont été significatives augmenté; Ce MMP-9 expression et l'activité augmentation induite par TCDD pourrait être abolie par c-Jun siRNA transfection et ne pas être influencé par le contrôle siRNA transfection. Au-dessus des données a démontré que c-Jun médiée MMP-9 expression induite par l'activation de la voie AhR dans les cellules AGS. Figure 4 c-Jun médiatise induite par TCDD-MMP-9 expression et l'activité. (A) TCDD induit l'expression de l'ARNm de c-Jun d'une manière dépendante de la dose. (B) TCDD c-Jun induit l'expression des protéines d'une manière dépendante de la dose. (C) TCDD induit l'expression de l'ARNm de c-Jun d'une manière dépendante du temps. (D) TCDD c-Jun induit l'expression des protéines d'une manière dépendante du temps. (E) RSV inverse induite par TCDD-c-Jun expression de l'ARNm. (F) RSV inverse c-Jun expression de la protéine induite par TCDD. (G) c-Jun siRNA taire c-Jun expression de l'ARNm. (H) c-Jun siRNA taire c-Jun expression de la protéine. (I) c-Jun siRNA inhibe la MMP-9 expression de l'ARNm induite par TCDD. (J) c-Jun siRNA inhibe la MMP-9 augmentation de l'activité induite par la TCDD.
Conclusion
En conclusion, la présente étude démontrent que la voie AhR peut être activée dans les cellules AGS gastriques cancéreuses et activation de la voie AhR induit la MMP-9 l'expression et l'activité qui contribue finalement à la migration AGS et l'invasion in vitro. En outre, nos données montrent que cette activation induite par MMP-9 expression AhR est médiée par c-juin Parce que la dégradation de l'ECM et la membrane basale est une étape essentielle dans l'invasion tumorale et les métastases, nos résultats permettent de mieux comprendre le mécanisme et la fonction de la voie AhR et son impact sur ces processus au cours de la progression du cancer gastrique.
Méthodes
culture cellulaire
gastrique lignée cellulaire de cancer AGS a été obtenu à partir de la American type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) et a été maintenue dans du milieu RPMI 1640 (Hyclone) supplémenté avec de la glutamine 2 mM, 10% de sérum de fœtus bovin (Hyclone), 100 unités /ml de pénicilline et 100 pg /ml de gentamycine. environnement cellulaire a été maintenue à 5% de CO 2 et 37 ° C. Les cellules ont été récoltées à partir de la phase de croissance exponentielle et l'ARN total et de protéines ont été préparés comme décrit ci-dessous Le traitement des cellules de TCDD de. Et resvératrol ont été achetés chez Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Après une incubation de 24 heures, les cellules ont été traitées avec TCDD à différentes concentrations (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) ou de TCDD (1 nM) plus Resvératrol (0, 1, 5, 10, 20 pM) pour 24 heures, ou traitées avec TCDD (1 nM) pendant un temps différentes (0, 1, 6, 24, 48, 72 heures), respectivement. Tous les médicaments ont été dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Les cellules témoins ont reçu 0,1% de DMSO seulement.
Petit interférant synthèse de l'ARN
petits ARN interférents (siRNA) ont été synthétisés et haute performance purifié (Ribo biotechnologie, Guangzhou). c-Jun siRNA (sens, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antisens, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) et de contrôle siRNA (sens, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; antisens, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), ne portant aucune homologie avec des gènes humains connus, ont été dissous dans RNase ddH 2 O jusqu'à une concentration finale de 20 pmol /L.
petit ARN interférent
transfection de cellules (5 x 10 5) ont été étalées sur des puits de plaques à six puits de culture cellulaire et on les laisse adhérer pendant 24 heures. Quatre microlitres Lipofectamine2000 (Invitrogen) par puits ont été ajoutés sans sérum Opti MEM (Invitrogen) pour un volume final de 250 complexant ul, mélangé doucement et mis en incubation à température ambiante pendant 5 minutes. Cinq microlitres de solution siRNA par puits ont été dilués avec 250 pi sans sérum Opti MEM. Mélanger la solution diluée de siRNA et la Lipofectamine2000 dilué avec précaution et laisser incuber à la température ambiante pendant 30 minutes. Le complexe Lipofectamine2000 /ARNsi ont été ajoutés dans les puits contenant 1500 ul de RPMI 1640 avec 10% FBS et mis à incuber dans des conditions de culture cellulaire normales. Toutes les analyses ont été effectuées au bout de 48 heures.
L'isolement de l'ARN et l'ARN total de RT-PCR de cellules a été extrait en utilisant le kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. L'ADNc a été synthétisé avec 1 pg d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse, ReverTra ACETM (Toyobo Co., Osaka, Japon) sous la condition suivante: 30 ° C pendant 10 min, 42 ° C pendant 20 min, 99 ° C pendant 5 min et 4 ° C pendant 5 min. PCR de l'ADNc a été effectuée dans un mélange réactionnel (30 ul) contenant 2 ul de matrice d'ADNc mM MgCl 2,5 2, 200 uM de dNTP, 0,3 uM d'amorces 1 et 2 et 1 unité de Taq ADN polymerase (New England Biolabs). L'amplification a été réalisée en utilisant les conditions suivantes: 94 ° C pendant 5 min, puis 25-32 cycles (45 s pour dénaturant à 94 ° C, annelage pendant 30 s, et de prolonger pendant 30 secondes à 72 ° C), puis 72 ° C pendant 7 min. Les détails des amorces, la température de recuit, les cycles d'amplification, et la PCR taille du produit pour chaque gène sont indiqués dans le Tableau 1. Les produits de la PCR ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5% colorés avec du bromure d'éthidium, et visualisés avec un ultra-violet (UV), transilluminateur. l'intensité de la bande de RT-PCR ont été quantifiés à l'aide Quantity One logiciel d'analyse d'imagerie. l'intensité de la bande du CYP 1A1, MMP-9 et l'ARNm de c-Jun ont été normalisées avec des intensités de bandes de ß-actine correspondante. Les données ont été rapporté en moyenne ± SD.Table 1 séquences d'amorces et des conditions d'amplification par PCR
Gene
Amorces (5 '→ 3')
température de recuit (° C)
Cycles
taille du produit (pb)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: MMP-9
les S de ACAGTGCCAGGTGCGGGTT: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: Beta-actine
S de CTGCGTTAGCATGAGTTGG: 52
30
256
A de CTCGCTGTCCACCTTCCA: GCTGTCACCTTCACCGTTC
abréviations: S, amorce sens; A, amorce anti-sens
analyse par transfert de Western
Les culots cellulaires ont été homogénéisés dans un tampon de lyse contenant 20 mM Hepes, 1 mM d'EGTA mM β-glycerophosphate 50 mM orthovanadate de sodium 2, 10% de glycerol, 1% de Triton X- 100, 1 mM de DTT et 1 × Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Allemagne). Lysat a été centrifugé à 13000 tpm et 4 o C pendant 10 minutes. Le surnageant a été le lysat cellulaire totale. La concentration en protéine a été mesurée en utilisant le kit de dosage de protéine BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Trente microgrammes de protéine ont été chargés par couloir, séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS à 10% et transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène équilibrée par électrotransfert. Les membranes ont été bloquées avec du tampon TBS-T contenant 5% (p /v) de lait écrémé en poudre. AhR, CYP1A1, c-Jun et la bêta-actine ont été détectés pendant 2 heures en utilisant des anticorps contre AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, la dilution de travail 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, dilution de travail 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, la dilution de travail 1: 200) et la bêta-actine (DZ0, Cell Signaling Technology, travaillant dilution 1: 1000). Après incubation de l'anticorps secondaire (dilution de travail de 1: 2000), le renforcement de la chimiluminescence (Pierce Biotechnology, Inc.) a été déterminée par exposition à un film radiographique. intensités de bande en Western blot ont été quantifiées à l'aide Quantité Un logiciel d'analyse d'imagerie. intensités de bande de CYP 1A1 et c-Jun ont été normalisées avec des intensités de bande de bêta-actine correspondante. Les données ont été signalé comme support de moyenne ± écart type Gélatine zymographie.
De TCDD cultures traitées a subi une électrophorèse sur SDS-PAGE, où le gel contient 0,1% (p /v) de gélatine. Le gel a été mis en incubation pendant une nuit dans un alliage de Zn + et Ca2 2+ contenant un tampon pour permettre MMPs de retrouver leur structure propre et dégrader la gélatine dans le gel. bandes blanches claires sur le gel coloré au Coomassie sont révélateurs de l'activité MMP. intensités de bande ont été quantifiés à l'aide Quantité Un logiciel d'analyse d'imagerie.
Cicatrisation test de migration
Pour la mesure de la migration cellulaire pendant la cicatrisation des plaies, les cellules AGS ont été ensemencées dans des puits individuels d'une plaque de culture à 6 puits. Lorsque les cellules ont atteint un état confluentes, des couches de cellules ont été blessés avec une pointe de micropipette plastique ayant un grand orifice. Le milieu et les débris ont été aspirés et remplacés par 2,5 ml de milieu sans sérum frais qui contiennent différentes concentrations de TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nm). Les cellules ont été photographiées toutes les 12 h après la lésion par microscopie à contraste de phase. Pour l'évaluation de la "fermeture de la plaie," cinq points sélectionnés de manière aléatoire le long de chaque plaie furent marqués, et la distance horizontale de cellules provenant de la plaie initiale de la migration a été mesurée. Les données ont été rapporté en moyenne ± SD.
Transwell migration et l'invasion analyse
traitée ou cellules témoins non traitées ont été ensemencées en triple dans la chambre supérieure d'un Transwell insert (Corning, New York, NY, USA) en sans sérum milieu à une densité de 1 x 10 5 par puits. Pour les essais de migration, un milieu contenant 5% de sérum a été placé dans la chambre inférieure pour agir en tant que facteur chimiotactique et les cellules ont été encore incubées pendant 18 heures. les cellules non migratrices ont été retirées de la chambre supérieure par grattage, et les cellules restantes sur la surface inférieure de l'insert ont été colorées avec 0,1% de cristal violet pendant 15 minutes. Cellules ont été comptées sous un microscope. des essais d'invasion ont été réalisés comme pour les essais de migration décrits ci-dessus, à l'exception des inserts ont été pré-revêtues avec la matrice extracellulaire (ECM) en remplacement du Matrigel (BD Biosciences) et on incube pendant une période de 24 heures. Chaque clone a été étalé en triple exemplaire dans chaque expérience et chaque expérience a été répétée au moins trois fois. Notes de migration cellulaire (ou invasion) capacité = (le nombre de cellules du groupe traité /le nombre de cellules du groupe témoin) x 100%.
Tie-Li Peng, Jie Chen a contribué également à ce travail.
Déclarations
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: les subventions de la national science Foundation naturelles de la Chine (n ° 30670949, n ° 30671904 et No.30871145), une subvention accordée aux nouveaux enseignants du ministère chinois de la Education (No.20070558288), une subvention accordée au directeur de thèse du ministère chinois de l'Education (n ° 20060558010), les subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (No.5300767 et No.7001641).
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