Aktivácia Aryl uhľovodíkový receptor cesta zvyšuje žalúdočné rakovinové bunky šíria rýchlejšie pravdepodobne prostredníctvom indukcie c-Jun-závislé aktivácia matrix metaloproteinázy-9

Aryl uhľovodíkový receptor dráhy zvyšuje žalúdočné rakovinové bunky šíria rýchlejšie pravdepodobne prostredníctvom c-Jun-závislú indukciu matrix metaloproteinázy-9
abstraktné
pozadia
Abberant aryl uhľovodíkového receptora (AHR) prejavu a AhR dráhy aktivácie sú zapojené do žalúdka rakoviny. Avšak, vzťah medzi AhR dráhy aktiváciou a progresie rakoviny žalúdka je stále nejasná. V tejto štúdii sme použili 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-para-dioxínov (TCDD), klasické a najsilnejší ligand AhR, k aktivácii AhR dráhu a skúmala účinok AHR dráhy aktivácie na ľudské rakoviny žalúdka AGS bunky invázie a preskúmanú príslušný mechanizmus.
Výsledky
Ak chcete zistiť, či AhR cesta môže byť aktivovaný v AGS bunkách, sme skúmali expresiu CYP1A1, klasický cieľový gén AHR dráhy, po expozícii TCDD. RT-PCR a western blot analýza ukázala, že ako CYP1A1 mRNA a expresie proteínu sa v spôsobom závislým od dávky zvyšuje po ošetrení TCDD a Ahr antagonistu resveratrolu (RSV) by zabránilo tomuto TCDD indukovanú expresiu CYP1A1. Na určenie, či TCDD liečba AGS buniek vedie k indukcii expresie MMP-9, sme zistili, MMP-9 mRNA pomocou RT-PCR a detekované MMP-9 enzymatickú aktivitu za použitia želatíny zymografie. Výsledky ukázali, že ako MMP-9 mRNA expresie a enzymatická aktivita sa postupne zvyšuje so zvýšením koncentrácie TCDD v médiách a tieto zmeny by mohli byť obrátený pôsobením RSV v spôsobom závislým od dávky. Preskúmať, či AhR aktiváciou indukované MMP-9 expresiu a aktivitu v AGS bunkách vedie k zvýšenej migrácii a invázii sme vykonali hojenie rán migračnej test a transjamkových migrácie a invázie testu. Po ošetrení TCDD, migrácia vzdialenosť a migrácie a invázie schopnosti AGS buniek sa zvyšuje s spôsobom, ktorý je závislý od dávky. Demonštrovať AhR aktiváciou indukovanej expresie MMP-9 je sprostredkovaná c-Jun, siRNA transfekcia bola vykonaná na umlčanie c-Jun mRNA v bunkách AGS. Výsledky ukázali, že MMP-9 mRNA expresie a aktivita u neošetrených kontrolných AGS bunky boli veľmi slabé; Po ošetrení TCDD (10 nmol /l), MMP-9 mRNA expresie a aktivita bola značne predĺžená; Tento TCDD indukované MMP-9 Expresia a aktivita zvýšenie mohlo byť zrušené c-Jun siRNA transfekcia.
Záver
aktivácia AhR cesta zvyšuje žalúdočné rakovinové bunky šíria rýchlejšie pravdepodobne prostredníctvom c-Jun-závislú indukciu MMP-9. Naše výsledky poskytujú vhľad do mechanizmu a funkcií AHR dráhy a jej vplyv na progresiu rakoviny žalúdka.
Pozadie
aryl uhľovodíkového receptora (AHR) je transkripčný faktor ligand-aktivoval základného skrutkovice-slučka-závitnice /per-Arnt-Sim rodiny. V neprítomnosti ligandu, AhR je prítomný v cytosolu vo forme komplexu s dvoma chaperonu Hsp90s, smal proteín (P23), a imunofilín-like proteín (XAP2) [1, 2]. Na ligandu, ako je napríklad 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-para-dioxínov (TCDD, najsilnejší a klasické exogénne AhR ligand) viazanie, chaperonového proteíny disociujú a Ahr premiestni do jadra za vzniku heterodiméry s partnerskou molekulou aryl uhľovodík receptor nukleárna translokátoru (Arnt) [3, 4]. Tento heterodiméry sa viaže na špecifické DNA oblasti nazývanej dioxín reakcie element (DRE), ktorý má základnú sekvenciu 5'-TNGCGTG-3 ', a tým aktivuje batériu génov expresie [5-7].
Historicky, štúdie AHR dráhy sa zamerali na reguláciu transkripcie génov kódujúcich cudzorodé enzýmov metabolizujúcich, ako sú enzýmy cytochrómu P450 [8]. Nedávne štúdie preukázali úzky vzťah medzi AhR a mliečne žľazy vzniku nádorov [7, 9]. polymorfizmy génu AhR boli spojené s zvýšeného rizika pľúc a prsníka [10, 11]. Zvýšená expresia AhR bola hlásená u pľúc, prsníka, pankreasu a rakoviny u ľudí [7, 12, 13]. Štúdie tiež naznačujú, že konštitutívne aktívny AhR môže podporovať hepatokarcinogeneze u myší [14]. Tieto údaje naznačujú úzky vzťah medzi AhR a vzniku nádorov. Avšak, vzťah medzi AhR a progresie nádoru, nie je jasné.
Nádorové bunky invázie a metastázy, je komplikovaný proces, medzi ktorými degradácia extracelulárnej matrix (ECM) a bazálnej membráne je dôležitý krok. Nádorové invázie a metastázy sa opiera o expresiu matrixových metaloproteinázy (MMP), zničiť ECM a bazálnu membránu, aby migráciu buniek. MMP sú skupinou zinok závislé metallopeptidases [15-17]. Matrix metaloproteinázy-9 (MMP-9), je jedným z kolagenázy typu IV /gelatináz, ktoré degradujú kolagény bazálnej membrány a želatíny [16]. MMP-9 je široko spojená s invázie tumoru a metastáz [17]. Syntéza MMP-9 je upravené viac rastovými faktormi, cytokíny a hormóny [16, 18]. Nedávne štúdie spojené TCDD asociované lézie s metabolizmom odchylnú matice [8]. Microarray dáta preukazujú, že TCDD /AhR zmeniť expresiu génov zapojiť do metabolizmu matrice a ukladanie [8]. Villano et al [19] a Haque et al [18] uvádzajú, že AhR agonista TCDD by mohlo vyvolať MMP-9 expresiu v huamn melanómu buniek a buniek rakoviny prostaty. Tieto štúdie naznačujú, že expresia MMP-9 môže byť spoločný koncový bod pre aktiváciu dráhy AhR [8, 19].
Žalúdočné rakovina je štvrtou najčastejšou zhubné bujnenie a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia v world [20]. Žalúdočné rakovinové bunky invázie a metastázy často vedú k zlou prognózou. Niekoľko štúdií spojené aktiváciu AhR dráhy žalúdočné karcinogenéze. Chen et al našli zvýšené expresiu AhR v dvoch rakovina žalúdka u bunkových línií (RF1 a RF48) pomocou microarray analýzy [21]. Ma et al uvádzajú, že súbežné expresie AhR a CYP1A1 je v korelácii s vývojom rakoviny žalúdka [22]. Andersson et al zistili, že konštitutívne aktivovaný AhR by mohlo vyvolať žalúdočné nádory v transgénnym myšiam modeli [23]. V ďalšej z našich štúdiách sme zistili, že expresia a AhR nukleárnej translokácie boli významne vyššie u karcinómu žalúdka, než v premalígnych lézií a normálne žalúdočnej sliznice [24]. Avšak, vzťah medzi AhR dráhy aktiváciou a rakovinou žalúdka invázie a metastázy je stále ešte nie je jasné. Preto sme skúmali účinok aktivácie AhR dráhy na ľudských buniek karcinómu žalúdka. Naše údaje tu prezentované ukazujú, že AhR cesta môže byť aktivovaný v žalúdku rakovinových buniek AGS a Ahr aktiváciu dráhy v AGS bunkách vyvoláva MMP-9 expresiu a zvyšuje AGS bunky migrácie a invázie aktivitu. Okrem toho, naše dáta ukazujú, že tento AhR aktivácia indukovanej expresie MMP-9 je sprostredkovaná c-Jun.
Výsledky a diskusia
aktivácia AhR dráhy v bunkách AGS
V ďalšej z našich štúdiách sme preukázali, že existuje vysoká miera AHR expresie v AGS buniek [24]. Ak chcete zistiť, či AhR cesta môže byť aktivovaný v tejto bunkovej línii, sme skúmali expresiu cytochrómu P-450 1A1 (CYP1A1), klasický cieľový gén AHR dráhy, po AhR agonista expozícii TCDD. RT-PCR a western blot analýza ukázala, že ako CYP1A1 mRNA (Obr. 1A) a proteín (obr. 1B) expresie v AGS bunky boli v spôsobom závislým od dávky zvýšil po liečbe TCDD. Ak chcete zistiť, či je tento TCDD indukovanej CYP1A1 výraz je AhR závislá AHR antagonista resveratrol (RSV) bola použitá na blokovanie AhR dráhu. Ako je znázornené na Obr. 1C a 1D, RSV by mohla zvrátiť TCDD indukovanej expresie CYP1A1 v spôsobom závislým od dávky. Tieto dáta ukázali, že AhR cesta môže byť aktivovaný v AGS bunkách TCDD. Obrázok 1 AhR agonista TCDD a Ahr antagonista RSV regulovaná CYP1A11 expresie v bunkách AGS. Po rôznych koncentráciách (ako je uvedené vyššie), liečby TCDD po ​​dobu 24 hodín, (A) RT-PCR analýzy expresie mRNA CYP1A1 v koncentračnom odozvy. (B) Analýza Western blot expresie CYP1A1 proteínu v koncentračnom odozvy. Po súčasného podávania TCDD (1 nM) a RSV (v rôznych koncentráciách, ako je uvedené vyššie) po dobu 24 hodín, (C), expresia mRNA CYP1A1 bola detekovaná pomocou RT-PCR. (D) Expresia proteínu CYP1A1 bol detekovaný Western Blot.
AhR aktiváciu dráhy v AGS bunkách indukovať expresiu MMP-9
Predchádzajúce štúdie ukázali, že v niektorých nádorových buniek, AhR expozície agonista TCDD aktivuje MMP-9 génovú expresiu [18, 19]. Na určenie, či je liečba TCDD AGS buniek vedie k indukcii expresie MMP-9, sme zistili, MMP-9 mRNA pomocou RT-PCR po expozícii TCDD. Ako je znázornené na obr. 2A, MMP-9 mRNA expresia bola indukovaná spôsobom závislým od dávky po liečbe TCDD. Skúmať úlohu dráhy AhR pri sprostredkovaní TCDD-indukovanú expresiu MMP-9 v AGS buniek, kultúry boli ko-reaguje s TCDD a antagonistu resveratrol AhR. Spoločná liečba s resveratrol zrušená TCDD indukovanej expresie MMP-9 (obr. 2C), preukázali, že TCDD-aktivácia MMP-9 expresie je závislá na AHR dráhy. Vyššie uvedené údaje ukazujú, že aktivácia dráhy AhR v AGS buniek indukuje expresia MMP-9 mRNA. Vo väčšine bunkových typov, gén transkripcie MMP-9 je indukovatelná, a po transláciu enzým je ihneď vylučovaný a aktivovaný cez cysteín-spínacieho mechanizmu [25]. Ak chcete zistiť, či sú tieto zmeny v génovej expresii nasledujúcej AhR dráhy aktivácia vedie k zmenám v MMP-9 enzymatickej aktivity, sme vykonali želatína zymografií. Výsledky ukázali, že MMP-9 aktivity v médiu postupne zvyšuje so zvýšením koncentrácie TCDD v médiu (obr. 2B), a tieto zmeny by mohli byť obrátený pôsobením resveratrol v spôsobom závislým od dávky (obr. 2D). Tieto dáta ukazujú, že aktivácia dráhy AhR indukovanej zvýšenie MMP-9, expresie koreluje so zvýšením aktivity MMP-9. Obrázok 2 AhR agonista TCDD a Ahr antagonista RSV regulovaná MMP-9 expresiu a aktivitu v AGS bunkách. Po rôznych koncentráciách (ako je uvedené vyššie), liečby TCDD po ​​dobu 24 hodín, (A) RT-PCR analýzy MMP-9 mRNA expresiu v odpovedi na koncentrácii. (B) Analýza želatína zymografie z MMP-9 aktivity proteínu v koncentračnom odozvy. Po súčasného podávania TCDD (1 nM) a RSV (v rôznych koncentráciách, ako je uvedené vyššie) po dobu 24 hodín, (C) mRNA expresie MMP-9 bola detekovaná pomocou RT-PCR. (D) Protein aktivita MMP-9 bola detekovaná želatíny zymografií.
Aktiváciu AhR dráhy zvyšuje AGS bunky migráciu a inváziu
MMP-9 je jednou z kolagenázy typu IV /gelatináz, ktoré môžu degradovať ECM zložky. MMP-9 je široko spojená s invázie tumoru a metastáz [17]. Štúdie preukázali významnú koreláciu medzi MMP-9 a expresie invazívnosti a lymfatických uzlín žalúdočných karcinómov [26-28]. Preskúmať, či AhR aktiváciou indukované MMP-9 expresiu a aktivitu v AGS bunkách vedie k zvýšenej migrácii a invázii sme vykonali hojenie rán migračnej test a transjamkových migrácie a invázie testu. Po ošetrení TCDD, migrácia vzdialenosť AGS buniek bola významne vyššia v spôsobom závislým od dávky v porovnaní s kontrolnými bunkami (p 0,01) (obr. 3A). Transwell výsledky ukázali významné zvýšenie migrácie (obr 3B.) A invázie (obr. 3c), schopnosti AGS buniek, keď boli bunky inkubované s TCDD v koncentráciách od 0,1 nmol /L (P 0,01) do 100 nmol /l ( p 0,01). žiadny významný vplyv na migráciu a inváziu bola nájdená pri koncentrácii TCDD < 0,1 nmol /l (p 0,05). Tieto výsledky preukázali, že aktivácia AhR cesta zvyšuje rakovina žalúdka AGS bunky migráciu a inváziu. Degradácia ECM a bazálnej membránou je základným krokom v nádorovej invázie a metastáz. To zahŕňa pôsobenie matrixových metaloproteinázy (MMP). Naša štúdia ukázala, že aktivácia AhR cesta by mohlo vyvolať MMP-9 expresiu a enzymatickú aktivitu a podporovať AGS bunky migráciu a inváziu. Ďalšie štúdie ukázali, že aktivácia dráhy AhR by mohlo vyvolať celý rad MMP expresie [19, 29]. Aktivácia AhR cesta zvyšuje rakovina žalúdka AGS buniek migrácie a invázie môže byť tiež dôsledkom iných MMP expresie okrem MMP-9 výrazu. Obrázok 3 Účinok AhR agonisty TCDD na AGS buniek migrácie a invázie. (A) hojenie rán migračného testu. (B) Transwell migračné test. (C) Transwell invázie testu.
C-Jun sprostredkovanej MMP-9 expresie vyvolanej aktiváciou AhR dráhy
Mechanizmus zmeny TCDD indukovanej expresie MMP-9, nie je celkom jasný. Nedávne štúdie uvádzajú, že TCDD môžu indukovať expresiu c-Jun [30, 31] a c-Jun je cieľový gén AHR dráhy [8]; promotorová sekvencie na 5'-hraničnú oblasť ľudského MMP-9 génu obsahuje c-Jun väzobných miest [16] a c-Jun je indukovaná expresia MMP-9 [32]; prepis aktivita c-Jun je významná zvýšená u rakoviny žalúdka [33]. Na báze týchto výsledkov tejto štúdie, sme navrhli hypotézu, že TCDD indukované MMP-9 expresie v bunkách AGS je sprostredkovaný c-Jun. Na preukázanie tejto hypotézy sme prvýkrát zistená expresia c-Jun v AGS bunkách po liečbe TCDD, a zistilo sa, že ako c-Jun mRNA (obr. 4A a 4C) a proteín (obr. 4B a 4D) expresie v AGS bunkách zvýšené v závislosti na dávke (obr. 4A a 4B) a čas (obr. 4C a 4D), spôsobom závislým od dávky po liečbe TCDD, a to TCDD indukované c-Jun expresie by mohla byť vyhradené AHR antagonistu resveratrolu (obr. 4E a 4F). Vyššie uvedené údaje ukázali, že c-Jun je cieľový gén AHR dráhy v bunkách AGS. Aby sa ďalej ukazujú, že c-Jun možno sprostredkovať TCDD indukovanej expresie MMP-9, siRNA transfekcia bola vykonaná na umlčanie c-Jun mRNA v bunkách AGS. Výsledky ukázali, že c-Jun siRNA (konečná koncentrácia 50 nmol /l), transfekcia takmer úplne zrušila c-Jun expresiu v bunkách AGS a to ako v úrovni mRNA (obr. 4G) a na úrovni proteínu (obr. 4H). Preto po c-Jun siRNA transfekcia po dobu 48 hodín, AGS bunky boli ošetrené s TCDD v koncentrácii 10 nmol /l po dobu 24 hodín, bunkový peliet a kultivačné médiá boli zhromaždené a boli merané MMP-9 mRNA expresie a aktivity. Ako je znázornené na obr. 4I a 4J, MMP-9 mRNA expresie a aktivita v neošetrenej kontrolnej AGS bunky boli veľmi slabé; Po ošetrení TCDD (10 nmol /l), MMP-9 mRNA expresie a aktivita bola značne predĺžená; Tento TCDD indukované MMP-9 Expresia a aktivita zvýšenie mohlo byť zrušená c-Jun siRNA transfekcia a nesmie byť ovplyvnená riadiacej siRNA transfekcia. Vyššie uvedené údaje ukázali, že c-Jun sprostredkovanej MMP-9 expresiu indukovanú aktiváciou AhR dráhy v bunkách AGS. Obrázok 4 c-Jun sprostredkováva TCDD indukované MMP-9 expresiu a aktivitu. (A) TCDD indukuje expresiu c-Jun mRNA v spôsobom závislým od dávky. (B) TCDD indukuje expresiu proteínu c-Jun v spôsobom závislým od dávky. (C) TCDD indukuje expresiu c-Jun mRNA v závislosti na čase. (D) TCDD indukuje expresiu proteínu c-Jun v závislosti na čase. (E), RSV obracia TCDD indukovanú expresiu c-Jun mRNA. (F), RSV obracia expresiu proteínu c-Jun TCDD indukovanej. (G) c-Jun siRNA umlčuje expresiu c-Jun mRNA. (H) c-Jun siRNA umlčuje expresiu proteínu c-Jun. (I) c-Jun siRNA inhibuje MMP-9 mRNA TCDD indukovanej. (J), c-Jun siRNA inhibuje MMP-9 zvýšenie aktivity TCDD indukované.
Záver
uvedeného vyplýva, že táto štúdia ukazujú, že AhR cesta môže byť aktivovaný v karcinómu žalúdka AGS buniek a aktiváciu AhR dráhy indukuje MMP-9 expresie a aktivita, ktorá v konečnom dôsledku prispieva k AGS migrácie a invázie in vitro. Okrem toho, naše dáta ukazujú, že táto AhR aktivácia indukovanej expresie MMP-9 je sprostredkovaná c-Jun. Vzhľadom k tomu, degradácie ECM a bazálnej membránou je základným krokom v nádorovej invázie a metastáz, naše výsledky poskytujú vhľad do mechanizmu a funkciu dráhy AhR a jeho vplyvu na tieto procesy v priebehu progresie rakoviny žalúdka.
Metódy
bunkové kultúry
žalúdka bunková línia rakoviny AGS bol získaný z American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), a bola udržiavaná v médiu RPMI 1640 (Hyclone), s prídavkom 2 mM glutamínu, 10% fetálnym hovädzím sérom (Hyclone), 100 jednotiek /ml penicilínu a 100 ug /ml gentamycínu. Bunkové prostredie sa udržuje na 5% CO 2 a 37 ° C. Bunky boli zozbierané z exponenciálnej rastovej fáze a celkovej RNA a proteínu boli pripravené, ako je popísané nižšie.
Ošetrenie buniek
TCDD a resveratrol boli získané od Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Po inkubácii po dobu 24 hodín boli bunky ošetrené TCDD v rôznych koncentráciách (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) alebo TCDD (1 nM) plus resveratrolu (0, 1, 5, 10, 20 uM) po dobu 24 hodín, alebo reaguje s TCDD (1 nM) po rôznu dobu (0, 1, 6, 24, 48, 72 hodín), v danom poradí. Všetky látky boli rozpustené v dimetylsulfoxidu (DMSO). Kontrolné bunky nedostali 0,1% DMSO iba.
Malé interferujúce RNA syntéze
malé interferujúce RNA (siRNA) boli syntetizované a vysoko výkonných čistí (Ribo Biotechnology, Guangzhou). c-Jun siRNA (zmyslové, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antisencie, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) a kontrolné siRNA (sense, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT antisencie, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), pričom žiadnu homológie s akýmikoľvek známymi ľudskými génmi, boli rozpustené vo RNázou bez DDH 2O do konečnej koncentrácie 20 umol /l.
malé interferujúce RNA transfekciu
bunky (5 x 10 5), boli umiestnené do jamiek šiestich jamkami a nechajú sa priľnúť na 24 hodín. Štyri ul Lipofectamine2000 (Invitrogen) na jamku bol pridaný do bezsérového Opti MEM (Invitrogen) na konečný objem komplexotvorných 250 ul, jemne zmiešané a inkubované pri izbovej teplote po dobu 5 minút. Päť mikrolitrov roztoku siRNA na jamku sa zriedi 250 ul bezsérového Opti MEM. Premiešajte zriedený roztok siRNA a zriedený Lipofectamine2000 jemne, a inkubuje sa pri teplote miestnosti po dobu 30 minút. Komplex Lipofectamine2000 /siRNA bolo pridané do jamiek obsahujúcich 1500 ul RPMI 1640 s 10% FBS a inkubované za normálnych podmienok bunkovej kultivácie. Všetky testy boli vykonané po 48 hodinách. Izolácia
RNA a RT-PCR
Celková RNA z buniek sa extrahuje za použitia Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) podľa inštrukcií výrobcu. cDNA bola syntetizovaná s 1 ug celkovej RNA za použitia reverznej transkriptázy, ReverTra acetát (Toyobo Co, Osaka, Japonsko) za nasledujúcich podmienok: 30 ° C počas 10 minút, 42 ° C počas 20 minút, 99 ° C počas 5 min a 4 ° C po dobu 5 min. PCR z cDNA bola vykonaná v reakčnej zmesi (30 ul) obsahujúci 2 ul templátové cDNA, 2,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP, 0,3 uM priméru 1 a 2, a 1 jednotku Taq DNA polymerázy (New England Biolabs). Amplifikácia bola vykonaná za použitia nasledujúce podmienky: 94 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 25-32 cyklov (denaturáciu po dobu 45 s pri 94 ° C, žíhanie po dobu 30 s, a rozšíriť po dobu 30 s pri teplote 72 ° C), a potom 72 ° C počas 7 minút. Podrobnosti o priméry, teplota žíhanie, cyklom amplifikácie a veľkosť PCR produktu pre každý gén, sú uvedené v tabuľke 1. PCR produkty boli podrobené elektroforéze na 1,5% agarózovom gélu, zafarbené s etídiumbromidom, a vizualizované s ultrafialovou (UV) presvecovanie. Band intenzity v RT-PCR boli kvantifikované pomocou Množstvo Jeden software zobrazovacej analýzy. Band intenzity CYP 1A1, MMP-9 a c-Jun mRNA boli normalizované so zodpovedajúcimi pásma intenzity beta-aktínu. Dáta bola označená ako priemer ± SD.Table 1 Primer sekvencií a PCR amplifikácie podmienok
Gene
Primery (5 '→ 3')
teplota žíhanie (° C)
Cykly
rozmery výrobku (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
beta-aktínu
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Skratky: S, sense priméru; A, antisencie primer
Western blot analýza
bunkové pelety boli homogenizované v lyzačním pufri obsahujúcom 20 mM HEPES, 1 mM EGTA, 50 mM β-glycerofosfát, 2 mM orthovanadičnan sodný, 10% glycerol, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT, a 1 x Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Nemecko). Lyzát bol centrifugován pri 13000 otáčkach za minútu a 4 ° C počas 10 minút. Supernatant bol celkový bunkový lyzát. Koncentrácia proteínu bola meraná s použitím BCA proteín kitu (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Tridsať mikrogramov proteínu bolo nanesené na dráhu, ktoré sú oddelené 10% elektroforézou na SDS-polyakrylamidovom gélu a prenesené na ekvilibrovanou polyvinylidendifluoridovou membránu elektropřenosového. Membrány boli blokované TBS-T pufri obsahujúcom 5% (hmotnosť /objem) netučného sušeného mlieka. AhR, CYP1A1, c-Jun a beta-aktínu boli detekované počas 2 hodín za použitia protilátky proti AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, pracovné riedenie 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, pracovné riedenie 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, pracovné riedenie 1: 200) a beta-aktínu (DZ0, Cell Signaling Technology, pracovné riedenie 1: 1000). Po inkubácii sekundárnej protilátky (pracovné riedenie 1: 2000), zvýšené chemiluminiscencie (Pierce Biotechnology, Inc.) bola stanovená expozíciou x-ray film. Band intenzity v westernovým prenosom boli kvantifikované pomocou Množstvo Jeden software zobrazovacej analýzy. Band intenzity CYP 1A1 a c-Jun boli normalizované so zodpovedajúcimi pásma intenzity beta-aktínu. Dáta bola označená ako priemer ± SD.
Želatína zymografií
médiá z TCDD ošetrených kultúr sa podrobí elektroforéze na SDS-PAGE, kde je gél obsahuje 0,1% (w /v) želatíny. Gél bol inkubuje sa s ním cez noc v Zn 2+ a Ca 2+, ktorý obsahuje vyrovnávacej pamäte umožniť MMP znovu získať správnu štruktúru a degradujú želatíny v gélu. Jasné biele pruhy na zafarbených v Coomassie blue gél svedčí o aktivitou MMP. Band intenzity boli kvantifikované za použitia Množstvo One softvér zobrazovacie analýzy.
Hojenie rany migrácie testu
Na meranie bunkovej migrácie v priebehu hojenia rán, AGS bunky boli nasadené na jednotlivých jamiek kultivačnej doštičke s 6 jamkami. Keď bunky dosiahli konfluentní stavu, vrstvy buniek bol zranený s plastovým micropipette hrot s veľkým otvorom. Médium a nečistoty odsajú sa a nahradené 2,5 ml čerstvého média bez séra, ktoré obsahovali rôzne koncentrácie TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). Bunky boli fotografované každých 12 hodín po zranení fázovým kontrastom mikroskopie. Pre vyhodnotenie "uzavretie rany," päť náhodne vybraných bodov pozdĺž každej rany boli označené, a bola meraná horizontálna vzdialenosť migrácie buniek z pôvodnej rany. Dáta bola označená ako priemer ± SD.
Transwell migrácie a invázie test
upravené alebo neupravené kontrolné bunky boli nasadené v triplikátech do hornej komôrky Transwell vložka (Corning, New York, NY, USA) v sére prostom médium v ​​hustote 1 x 10 5 na jamku. Migračné testy, médium obsahujúce 5% séra bola umiestnená v spodnej komore pôsobiť ako chemoatraktantu, a bunky boli ďalej inkubované po dobu 18 hodín. Nepohyblivá bunky boli odstránené z hornej komory oškrabaním, a bunky, ktoré zostali na spodnú plochu vložky boli zafarbené za použitia 0,1% kryštalickej fialovej po dobu 15 minút. Bunky boli počítané pod mikroskopom. Invázia testy boli vykonané ako v testoch migrácie popísaných vyššie, s výnimkou vložky boli vopred s extracelulárnej matrix (ECM) náhrada Matrigelu (BD Biosciences) a inkubovaných po dobu 24 h obdobia. Každý klon bol nanesené v triplikátech v každom pokuse a každý experiment bol opakovaný aspoň trikrát. Migrácia buniek (alebo invázia) schopnosť = (počet buniek ošetrených skupín /počet buniek z kontrolnej skupiny) x 100%.
Notes
Tie-Li Peng, Jie Chen prispeli rovnakou mierou k tejto práci.
vyhlásenie
Poďakovanie
Táto práca bola podporená nasledujúcimi granty: dotácie z Národného Natural Science Foundation Číny (No. 30670949, 30671904 a č No.30871145), čo je grantu do nového učiteľa z čínskeho ministerstva Education (No.20070558288), grant udelený nadriadenému PhD z čínskeho ministerstva školstva (č 20060558010), dotácie zo Natural Science Foundation v provincii Guangdong (No.5300767 a No.7001641).
pôvodné autorov predložené súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na pôvodných predložených súborov autorov pre obrazy. "Pôvodný súbor na obrázku 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff autorského 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff autorského pôvodného súboru pre Obrázok 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff autorského pôvodného súboru na obrázku 4

• Podmienené analýza prežitia v kórejskej pacientov s rakovinou žalúdka liečených kuratívny gastrektómii
• Realizovateľnosť zvýšenej zotavenie po operácii žalúdka chirurgii: retrospektívnej štúdie