Arylkoolwaterstofreceptor route activatie verhoogt maagkanker cel invasiviteit waarschijnlijk door een c-Jun-afhankelijke inductie van matrix metalloproteinase-9

Arylkoolwaterstofreceptor pathway activatie verbetert maagkanker cel invasiviteit waarschijnlijk door een c-Jun-afhankelijke inductie van matrix metalloproteinase-9
Abstracte achtergrond
Abberant arylkoolwaterstofreceptor (AhR) expressie en AhR route activering zijn betrokken bij maag carcinogenese. Het verband tussen AhR pathway activatie en maagkanker progressie is nog onduidelijk. In deze studie hebben we gebruik 2,3,7,8-tetrachloordibenzo-p-dioxine (TCDD), een klassieke en krachtigste ligand AhR aan AhR pathway te activeren en het effect van AhR pathway activatie menselijke maagkanker AGS cel invasie en onderzocht de bijbehorende mechanisme.
Resultaten
Om te bepalen of AhR route kan worden geactiveerd in AGS cellen, onderzochten we de expressie van CYP1A1, een klassieke doelwit gen van AhR route, na blootstelling TCDD. RT-PCR en Western blot analyse toonde dat zowel CYP1A1 mRNA en eiwitexpressie werden verhoogd in een dosis-afhankelijke wijze na behandeling TCDD en AhR antagonist resveratrol (RSV) kan dit TCDD-geïnduceerde CYP1A1 expressie te keren. Te bepalen of behandeling van TCDD AGS cellen resulteert in een inductie van MMP-9 expressie, detecteerden we MMP-9 mRNA via RT-PCR gedetecteerd en MMP-9 enzymatische activiteit met gelatine zymografie. De resultaten toonden dat zowel MMP-9 mRNA expressie en enzymatische activiteit geleidelijk verhoogd met de concentratie toename van TCDD in de media en deze veranderingen kunnen worden omgekeerd door RSV behandeling in een dosis-afhankelijke wijze. Om te onderzoeken of AhR activering geïnduceerde MMP-9 expressie en activiteit in AGS cellen resulteert in een verhoogde migratie en invasie, uitgevoerd we wondgenezing migratie test en transwell migratie en invasie assay. Na TCDD behandeling werden de migratieafstand en de migratie en invasie mogelijkheden van AGS cellen toe met een dosis-afhankelijke wijze. Om aan te tonen AhR-activatie geïnduceerde MMP-9 expressie wordt gemedieerd door c-Jun, werd siRNA transfectie uitgevoerd om te zwijgen c-Jun mRNA in AGS-cellen. De resultaten toonden aan dat MMP-9 mRNA expressie en activiteit in onbehandelde controle AGS cellen waren zeer zwak; Na TCDD (10 nmol /l) behandeling, MMP-9 mRNA expressie en activiteit waren significant verhoogd; Dit TCDD-geïnduceerde MMP-9 expressie en activiteit verhoging kan worden afgeschaft door c-Jun siRNA transfectie.
Conclusie
AhR pathway activatie verbetert maagkanker cel invasiviteit waarschijnlijk door een c-Jun-afhankelijke inductie van MMP-9. Onze resultaten geven inzicht in het mechanisme en de functie van de AhR route en de impact ervan op maagkanker progressie. Achtergrond
arylkoolwaterstofreceptor (AhR) is een ligand geactiveerde transcriptiefactor van de basis helix-loop-helix /per-Arnt-Sim familie. In afwezigheid van ligand AhR aanwezig in het cytosol in de vorm van een complex met twee chaperone Hsp90s een smal eiwit (p23), en een immunofiline-achtig eiwit (XAP2) [1, 2]. Bij het ligand zoals 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-para-dioxine (TCDD, de meest krachtige en klassieke exogene AhR ligand) binden, de chaperonne-eiwitten distantiëren en AhR verplaatsen in de kern om een ​​heterodimeer met zijn partner molecuul aryl te vormen koolwaterstof receptor nucleaire translocator (ARNT) [3, 4]. Dit heterodimeer bindt aan specifieke DNA-gebied genoemd dioxine responselement (DRE), die een kernsequentie 5'-TNGCGTG-3 'heeft en daardoor activeert een batterij van genen expressie [5-7].
Historisch studies AhR reactieketen gericht op de transcriptionele regulatie van genen die coderen voor xenobiotische metaboliserende enzymen zoals cytochroom P450 enzymen [8]. Recente studies toonden een nauwe relatie tussen de Ahr en de borstklier het ontstaan ​​van tumoren [7, 9]. AhR polymorfismen zijn in verband gebracht met een verhoogd risico op long- en borstkanker [10, 11]. Verhoogde expressie van AhR gerapporteerd in long-, borst- en pancreas kanker bij mensen [7, 12, 13]. Studies suggereren ook dat constitutief actieve AhR hepatocarcinogenesis kunnen bevorderen bij muizen [14]. Deze gegevens wezen op een nauwe relatie tussen AhR en het ontstaan ​​van tumoren. De relatie tussen AhR en tumorprogressie is niet duidelijk.
Tumorcellen invasie en metastase is een ingewikkeld proces waaronder afbraak van extracellulaire matrix (ECM) en basaalmembraan is een cruciale stap. Tumorinvasie en metastase afhankelijk van de expressie van matrix metalloproteïnasen (MMPs) aan de ECM en basaalmembraan vernietigen celmigratie mogelijk. MMP's zijn een groep van zink afhankelijke metallopeptidases [15-17]. Matrix metalloproteïnase-9 (MMP-9) een van het type IV collagenase /gelatinasen die basismembraan collagenen en gelatines [16] degraderen. MMP-9 wordt algemeen geassocieerd met tumorinvasie en metastase [17]. De synthese van MMP-9 wordt gereguleerd door verscheidene groeifactoren, cytokinen en hormonen [16, 18]. Recente studie gekoppeld-TCDD geassocieerd letsels met afwijkende matrix metabolisme [8]. Microarray gegevens tonen aan dat TCDD /AhR veranderen expressie van genen betrokken in matrix metabolisme en afzetting [8]. Villano et al [19] en Haque et al [18] gemeld dat AhR agonist TCDD MMP-9 expressie in huamn melanoomcellen en prostaatkankercellen kunnen teweegbrengen. Deze studies suggereren dat de MMP-9 expressie een gemeenschappelijk eindpunt voor activatie van de route AhR [8, 19] kan zijn.
Maagkanker is de vierde meest voorkomende kanker en de tweede meest voorkomende oorzaak van aan kanker gerelateerde dood in de wereld [20]. Maagkanker cellen invasie en metastase leidt vaak tot een slechte prognose. Verschillende studies in verband AhR route activering maag carcinogenese. Chen et al gevonden verhoogde expressie van AhR in twee menselijke maagkanker cellijnen (RF1 en RF48) van microarray-analyse [21]. Ma et al gemeld dat gelijktijdige expressie van CYP1A1 en AhR is gecorreleerd met maagkanker ontwikkeling [22]. Andersson et al vonden dat constitutief geactiveerd AhR maag tumoren in een transgeen muismodel [23] kunnen teweegbrengen. In een van onze studies bleek dat AhR expressie en nucleaire translocatie waren significant hoger bij maagkanker dan in premaligne laesies en normale maagslijmvlies [24]. Het verband tussen AhR pathway activatie en maagkanker invasie en metastase is nog niet duidelijk. Daarom onderzochten wij het effect van AhR pathway activatie menselijke maagkanker cellen. De hier gepresenteerde gegevens tonen aan dat AhR route kan worden geactiveerd bij maagkanker AGS cellen en AhR route activering in AGS cellen induceert MMP-9 expressie en verbetert de AGS cellen migratie en invasie activiteit. Bovendien zijn onze gegevens blijkt dat AhR-activatie geïnduceerde MMP-9 expressie gemedieerd door c-juni
Resultaten en bespreking
AhR route activering in cellen AGS
In een van onze studies hebben we aangetoond dat was een hoog niveau van AhR expressie in AGS-cellen [24]. Om te bepalen of AhR route geactiveerd kan worden in deze cellijn, onderzochten we de expressie van cytochroom P-450 1A1 (CYP1A1), een klassieke doelwit gen van AhR route, volgende AhR agonist TCDD blootstelling. RT-PCR en Western blot analyse toonde dat beide CYP1A1 mRNA (figuur 1A.) En eiwit (fig. 1B) expressie in AGS cellen verhoogd in een dosis-afhankelijke wijze na behandeling TCDD. Om te bepalen of dit TCDD-geïnduceerde CYP1A1 expressie AhR-afhankelijke, AhR antagonist resveratrol (RSV) werd gebruikt om te blokkeren AhR pad. Zoals getoond in Fig. 1C en 1D, RSV kan TCDD-geïnduceerde CYP1A1 expressie te keren op een dosis-afhankelijke wijze. Deze gegevens toonden aan dat AhR route geactiveerd kan worden in cellen door AGS TCDD. Figuur 1 AhR agonist TCDD en AhR antagonist RSV geregeld CYP1A11 expressie in AGS-cellen. Na verschillende concentraties (zoals hierboven) TCDD behandeling van 24 uur, (A) RT-PCR analyse van CYP1A1 mRNA expressie in een concentratie-respons. (B) Western blot analyse van CYP1A1 eiwitexpressie in een concentratie-respons. Na gelijktijdige behandeling met TCDD (1 nM) en RSV (in verschillende concentraties zoals hierboven getoond) voor 24 uur, (C) mRNA-expressie van CYP1A1 werd gedetecteerd met RT-PCR. (D) Eiwit expressie van CYP1A1 werd gedetecteerd door Western blot.
AhR pathway activatie in AGS induceren MMP-9 expressie
Eerdere studies hebben aangetoond dat in verschillende kankercellen, AhR agonist TCDD blootstelling activeert MMP-9 genexpressie [18, 19]. Om te bepalen of behandeling van TCDD AGS cellen resulteert in de inductie van MMP-9 expressie, detecteerden we MMP-9 mRNA middels RT-PCR na blootstelling TCDD. Zoals fig. 2A, MMP-9 mRNA expressie werd geïnduceerd in een dosis-afhankelijke wijze na behandeling TCDD. Om de rol van de AhR route in mediëren TCDD geïnduceerde MMP-9 expressie in cellen AGS onderzoeken kweken werden samen behandeld met TCDD en AhR antagonist resveratrol. Gelijktijdige behandeling met resveratrol ingetrokken TCDD-geïnduceerde MMP-9 expressie (fig. 2C) toonden aan dat TCDD-activatie van MMP-9 expressie afhankelijk van de AhR route. Bovenstaande gegevens blijkt dat AhR pathway activatie in AGS cellen induceert MMP-9 mRNA expressie. In de meeste celtypen, de gentranscriptie van MMP-9 induceerbaar en na translatie het enzym direct wordt afgescheiden en geactiveerd via de cysteïne-schakelmechanisme [25]. Om te bepalen of deze veranderingen in genexpressie na AhR pathway activatie leiden tot veranderingen in MMP-9 enzymatische activiteit, voerden wij gelatine zymografie. De resultaten toonden aan dat MMP-9-activiteit in media geleidelijk verhoogd met de concentratie toename van TCDD media (fig. 2B) en deze veranderingen kunnen worden omgekeerd door resveratrol behandeling in een dosis-afhankelijke wijze (fig. 2D). Deze gegevens tonen aan dat AhR pathway activatie-geïnduceerde toename in MMP-9-expressie correleert met een toename van MMP-9-activiteit. Figuur 2 AhR agonist TCDD en AhR antagonist RSV geregeld MMP-9 expressie en activiteit in AGS-cellen. Na verschillende concentraties (zoals hierboven) TCDD behandeling van 24 uur, (A) RT-PCR analyse van MMP-9 mRNA expressie in een concentratie-respons. (B) gelatine zymografie analyse van MMP-9 eiwit activiteit in een concentratie-respons. Na gelijktijdige behandeling met TCDD (1 nM) en RSV (in verschillende concentraties zoals hierboven getoond) voor 24 uur, (C) mRNA-expressie van MMP-9 werd gedetecteerd met RT-PCR. (D) Eiwitten activiteit van MMP-9 werd gedetecteerd door gelatine zymografie.
AhR pathway activatie verhoogt AGS cellen migratie en invasie
MMP-9 is een van type IV collagenase /gelatinasen die ECM componenten kunnen afbreken. MMP-9 wordt algemeen geassocieerd met tumorinvasie en metastase [17]. Studies hebben een significante correlatie tussen MMP-9 expressie en invasiviteit en lymfeknoop metastase van maagcarcinomen [26-28] aangetoond. Om te onderzoeken of AhR activering geïnduceerde MMP-9 expressie en activiteit in AGS cellen resulteert in een verhoogde migratie en invasie, uitgevoerd we wondgenezing migratie test en transwell migratie en invasie assay. Na TCDD behandeling werd de migratieafstand van AGS cellen verhoogd in een dosis-afhankelijke wijze in vergelijking met controlecellen (P < 0,01) (fig. 3A). Transwell resultaten toonden een significante toename van migratie (figuur 3B.) En invasie (figuur 3C.) Mogelijkheden van AGS cellen wanneer de cellen met TCDD werden in concentraties van 0,1 nmol /L (P < 0,01) tot 100 nmol /l ( p < 0,01). geen significant effect op de migratie en invasie werd gevonden op TCDD concentratie < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Deze resultaten toonden dat AhR pathway activatie verhoogt maagkanker AGS cellen migratie en invasie. Afbraak van ECM en basaalmembraan is een essentiële stap in tumorinvasie en metastase. Het gaat om de werking van matrix metalloproteïnasen (MMPs). Onze studie toonde aan dat AhR pathway activatie MMP-9 expressie en enzymatische activiteit kan veroorzaken, en het bevorderen van AGS cellen migratie en invasie. Andere studies gaven aan dat AhR route activering van een verscheidenheid van MMP expressie [19, 29] zou kunnen veroorzaken. AhR pathway activatie verhoogt maagkanker AGS cellen migratie en invasie kunnen ook door andere MMPs expressie naast MMP-9 expressie. Figuur 3 Het effect van AhR agonist TCDD op AGS cellen migratie en invasie. (A) wondgenezing migratie test. (B) Transwell migratie test. (C) Transwell invasie assay.
C-Jun gemedieerde MMP-9 expressie geïnduceerd door activatie route AhR
Het mechanisme van TCDD geïnduceerde veranderingen in MMP-9-expressie is niet geheel duidelijk. Recente studies die TCDD kan induceren c-Jun-expressie [30, 31] en c-Jun is een doelgen AhR pathway [8]; de promoter sequentie in het 5'-flankerende gebied van humaan MMP-9-gen c-Jun-bindingsplaatsen [16] en c-Jun kan geïnduceerde MMP-9 expressie [32]; de transcriptie activiteit van c-Jun is significant verbeterd bij maagkanker [33]. Op basis van deze onderzoeksresultaten, stelden wij een hypothese dat TCDD-geïnduceerde MMP-9 expressie in AGS cellen wordt gemedieerd door c-juni Om deze hypothese te demonstreren we eerst ontdekt de c-Jun-expressie in AGS cellen na TCDD behandeling, en vonden dat zowel c-Jun-mRNA (fig. 4A en 4C) en eiwit (fig. 4B en 4D) expressie in AGS cellen verhoogd in een dosis (fig. 4A en 4B) en tijd (fig. 4C en 4D) afhankelijke wijze na behandeling TCDD en dat TCDD-geïnduceerde c-Jun-expressie zouden kunnen worden gereserveerd door AhR antagonist resveratrol (fig. 4E en 4F). Bovenstaande gegevens laten zien dat c-Jun is een doelgen AhR pathway in AGS cellen. Om verder aan te tonen dat c-Jun kan bemiddelen-TCDD geïnduceerde MMP-9-expressie, werd siRNA transfectie uitgevoerd om te zwijgen c-Jun mRNA in AGS-cellen. De resultaten toonden aan dat c-Jun siRNA (uiteindelijke concentratie 50 nmol /L) transfectie bijna volledig afgeschaft c-Jun-expressie in AGS cellen, zowel in mRNA-niveau (fig. 4G) en eiwitgehalte (fig. 4H). Dus na c-Jun siRNA transfectie gedurende 48 uren werden cellen behandeld met AGS TCDD bij concentratie 10 nmol /L 24 uur, celpellet en kweekmedia werden verzameld en MMP-9 mRNA expressie en activiteit werden gemeten. Zoals fig. 4I en 4J, MMP-9 mRNA expressie en activiteit in onbehandelde controle AGS cellen waren zeer zwak; Na TCDD (10 nmol /l) behandeling, MMP-9 mRNA expressie en activiteit waren significant verhoogd; Dit TCDD-geïnduceerde MMP-9 expressie en activiteit verhoging kan worden afgeschaft door c-Jun siRNA transfectie en niet worden beïnvloed door de controle siRNA transfectie. Bovenstaande gegevens laten zien dat c-Jun gemedieerde MMP-9-expressie geïnduceerd door AhR pathway activatie in AGS-cellen. Figuur 4 c-Jun bemiddelt-TCDD geïnduceerde MMP-9 expressie en activiteit. (A) TCDD induceert c-Jun mRNA expressie op een dosis-afhankelijke wijze. (B) TCDD induceert c-Jun-eiwit expressie in een dosis-afhankelijke wijze. (C) TCDD induceert c-Jun mRNA expressie in een tijdsafhankelijke manier. (D) TCDD induceert c-Jun-eiwit expressie in een tijdsafhankelijke manier. (E) RSV keert-TCDD-geïnduceerde c-Jun mRNA expressie. (F) RSV keert-TCDD-geïnduceerde c-Jun eiwit expressie. (G) c-Jun siRNA stiltes c-Jun mRNA expressie. (H) c-Jun siRNA stiltes c-Jun eiwit expressie. (I) c-Jun remt siRNA-TCDD geïnduceerde MMP-9 mRNA expressie. (J) c-Jun remt siRNA-TCDD geïnduceerde MMP-9-activiteit te verhogen.

Conclusie Concluderend deze studie tonen aan dat AhR route geactiveerd kan worden bij maagkanker AGS cellen en AhR route activatie induceert MMP-9 expressie en activiteit die uiteindelijk bijdraagt ​​aan AGS migratie en invasie in vitro. Bovendien zijn onze gegevens blijkt dat AhR-activatie geïnduceerde MMP-9 expressie gemedieerd door c-juni Omdat de afbraak van ECM en basaal membraan is een essentiële stap in de tumor invasie en metastase, onze resultaten geven inzicht in het mechanisme en de functie van de AhR route en de impact ervan op deze processen tijdens maagkanker progressie.
Methods
Celcultuur
Maagkanker AGS cellijn werd verkregen van de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) en werd in RPMI 1640 medium (Hyclone) gesupplementeerd met 2 mM glutamine, 10% foetaal runderserum (Hyclone), 100 gehandhaafd eenheden /ml penicilline en 100 ug /ml gentamycine. Cellulaire omgeving werd op 5% CO 2 en 37 ° C. Cellen werden uit de exponentiële groeifase en totaal RNA en eiwit geoogst werden bereid zoals hieronder beschreven.
Behandeling van cellen
TCDD en resveratrol werden gekocht bij Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Na incubatie gedurende 24 uur werden de cellen behandeld met TCDD in verschillende concentraties (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) of TCDD (1 nM) plus Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 uM) voor 24 uur, of behandeld met TCDD (1 nM) gedurende verschillende tijdstippen (0, 1, 6, 24, 48, 72 uur) resp. Alle geneesmiddelen werden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO). Controle cellen ontvingen 0,1% DMSO alleen.
Kleine interfererende RNA-synthese
Kleine interfererende RNA's (siRNA's) werden gesynthetiseerd en high-performance gezuiverd (Ribo Biotechnology, Guangzhou). c-Jun siRNA (sense, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT, antisense, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) en controle siRNA (sense, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT, antisense, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), gesteund door geen homologie met alle bekende menselijke genen, werden opgelost in RNase-vrij DDH 2O tot een uiteindelijke concentratie van 20 umol /L.
kleine interfererende RNA-transfectie
cellen (5 x 10 5) werden uitgeplaat op putjes van zes-well celcultuur platen en toegestaan ​​te hechten gedurende 24 uur. Vier microliter Lipofectamine2000 (Invitrogen) per putje werd toegevoegd aan serumvrij Opti MEM (Invitrogen) voor een uiteindelijk volume van 250 complexerende pl, voorzichtig gemengd en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Vijf microliter van siRNA-oplossing per well werden verdund met 250 ul serumvrij Opti MEM. Meng de verdunde oplossing siRNA en de verdunde Lipofectamine2000 zachtjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De Lipofectamine2000 /siRNA-complex werd toegevoegd aan de putjes die 1500 ul RPMI 1640 met 10% FBS en geïncubeerd in normale celkweekomstandigheden. Alle testen werden uitgevoerd na 48 uur.
RNA-isolatie en RT-PCR Totaal RNA
cellen werd geëxtraheerd met behulp van de Qiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) volgens de instructies van de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd met 1 ug totaal RNA met behulp van reverse transcriptase, ReverTra AceTM (Toyobo Co., Osaka, Japan) onder volgende omstandigheden: 30 ° C gedurende 10 min, 42 ° C gedurende 20 min, 99 ° C gedurende 5 min en 4 ° C gedurende 5 minuten. PCR van cDNA werd uitgevoerd in een reactiemengsel (30 pi) bevattende 2 pi template cDNA, 2,5 mM MgClz gedragen 2, 200 uM dNTPs, 0,3 uM primer 1 en 2, en 1 eenheid Taq DNA-polymerase (New England Biolabs). Amplificatie werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: 94 ° C gedurende 5 min, gevolgd door 25-32 cycli (denaturatie gedurende 45 s bij 94 ° C, ontlaten gedurende 30 s en verlenging gedurende 30 seconden bij 72 ° C) en 72 ° C gedurende 7 min. De data van primers, annealing temperatuur, amplificatiecycli, en PCR productgrootte voor elk gen zijn vermeld in tabel 1. De PCR-producten werden geëlektroforeerd op 1,5% agarose gel, gekleurd met ethidiumbromide en zichtbaar gemaakt met een ultra-violet (UV) transilluminator. Band intensiteiten in RT-PCR werden gekwantificeerd met behulp van Quantity One imaging analyse software. Band intensiteiten van CYP 1A1, MMP-9 en c-Jun mRNA werden genormaliseerd met overeenkomstige band intensiteiten van beta-actine. De gegevens werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD.Table 1 Primer sequenties en PCR-amplificatie voorwaarden
Gene
primers (5 '→ 3')

Gloeien (° C)
Cycles
grootte van het product (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174 Hotels A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480 Hotels A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292 Hotels A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta-actine
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256 Hotels A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Afkortingen: S, sense primer; Een antisense primer
Western blotanalyse
celpellets werden gehomogeniseerd in een lysisbuffer die 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 50 mM β-glycerofosfaat, 2 mM natriumorthovanadaat, 10% glycerol, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT en 1 x Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Duitsland). Lysaat werd gecentrifugeerd bij 13.000 rpm en 4 oC gedurende 10 minuten. Het supernatant was het totale cellysaat. De eiwitconcentratie werd gemeten met de BCA eiwit assay kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Dertig microgram eiwit werd geladen per baan gescheiden door 10% SDS-polyacrylamide gelelektroforese en op evenwicht gebracht polyvinylideendifluoridemembraan overgebracht door electroblotting. Membranen werden geblokkeerd met TBS-T buffer met 5% (w /v) magere melkpoeder. AhR, CYP1A1, c-Jun en beta-actine werden gedetecteerd gedurende 2 uur met behulp van antilichamen tegen AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, werkende verdunning 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, het werken verdunning 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, werkende verdunning 1: 200) en beta-actine (DZ0, Cell Signaling Technology, het werken verdunning 1: 1000). Na incubatie secundair antilichaam (in bedrijf verdunning 1: 2000), verbeterde chemiluminescentie (Pierce Biotechnology, Inc.) werd bepaald door blootstelling aan röntgenfilm. Band intensiteiten in Western blot werden gekwantificeerd met behulp van Quantity One imaging analyse software. Band intensiteiten van CYP 1A1 en c-Jun werden genormaliseerd met overeenkomstige band intensiteiten van beta-actine. De gegevens werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD.
Gelatine zymografie
media vanuit TCDD behandelde kweken werd aan elektroforese op SDS-PAGE wanneer de gel bevat 0,1% (w /v) gelatine. De gel werd gedurende de nacht in een Zn 2 + en Ca 2+ bevattende buffer om de MMP's naar de juiste structuur te herwinnen en degraderen de gelatine in de gel. Duidelijke witte banden op de Coomassie gekleurde gel zijn een indicatie van MMP-activiteit. Band intensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van Quantity One imaging analyse software.
Wondgenezing migratie assay
Voor het meten van celmigratie tijdens wondgenezing, werden AGS cellen gezaaid in individuele putjes van een 6-well cultuur plaat. Wanneer de cellen een confluente toestand bereikt, werden cel lagen gewond met een plastic micropipet tip met een grote opening. Middellange en brokstukken werden verwijderd afgezogen en vervangen door 2,5 ml vers serumvrij medium dat verschillende concentraties bevat van TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). De cellen werden elke 12 uur gefotografeerd na verwonding door fasecontrast microscopie. Voor de evaluatie van "wondsluiting" vijf willekeurig geselecteerde punten langs elke wond werden gemerkt en de horizontale afstand van migrerende cellen van de oorspronkelijke wond werd gemeten. De gegevens werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD.
Transwell migratie en invasie assay
Behandelde of onbehandelde controle cellen werden in drievoud in de bovenste kamer van een Transwell voegen (Corning, New York, NY, USA) in serumvrij medium bij een dichtheid van 1 x 10 5 per putje. Migratie assays, medium met 5% serum werd in de onderste kamer te treden als een chemoattractant, en cellen werden verder geïncubeerd gedurende 18 uur. Nonmigratory cellen werden uit de bovenste kamer verwijderd door schrapen en de cellen blijven aan de onderkant van de insert werden gekleurd met 0,1% kristalviolet gedurende 15 minuten. De cellen werden geteld onder een microscoop. Invasie-assays werden uitgevoerd zoals voor de migratie die hierboven beschreven, behalve inserties werden vooraf bekleed met extracellulaire matrix (ECM) vervangende Matrigel (BD Biosciences) en geïncubeerd gedurende een 24-uurs periode. Elke kloon werd in drievoud uitgeplaat in elk experiment en elk experiment werd ten minste driemaal herhaald. Celmigratie (of invasie) vermogen = (het aantal cellen van de behandelde groep /het aantal cellen van de controlegroep) x 100%.
Notes
Tie-Li Peng, Chen Jie eveneens bijgedragen aan dit werk.
verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door de volgende beurzen: de subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr 30670949, nr 30671904 en No.30871145), een subsidie ​​toegekend aan nieuwe leraar van Chinese ministerie van Onderwijs (No.20070558288), een subsidie ​​toegekend aan de promotor van het Chinese ministerie van Onderwijs (nr 20060558010), de subsidies van de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (No.5300767 en No.7001641).
oorspronkelijke auteurs ' ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar originele ingediende dossiers van de auteurs voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Authors' 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff Auteurs originele bestand voor figuur 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Authors 'originele bestand voor figuur 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Authors' originele bestand voor figuur 4

• Voorwaardelijke survival analyse in het Koreaans patiënten met maagkanker ondergaan curatieve gastrectomy
• Haalbaarheid van verbeterde herstel na een operatie in de maag chirurgie: een retrospectief study