Aril-szénhidrogén receptor útvonal aktiválása fokozza a gyomorrák sejt behatolásra valószínűleg keresztül a c-Jun-függő indukálása mátrix metalloproteináz-9

Aril-szénhidrogén receptor útvonal aktiválása fokozza a gyomorrák sejt behatolás valószínűleg egy c-Jun-függő indukciós mátrix metalloproteináz-9 katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Abberant aril szénhidrogén receptor (AhR) expressziója és AhR útvonal aktiválás is részt vesznek gyomor kialakulásában. Azonban a kapcsolat AhR útvonal aktiválása és a gyomorrák progresszió még nem tisztázott. A jelen tanulmányban használtuk 2,3,7,8-tetraklór-para-dioxin (TCDD), a klasszikus és a leghatásosabb ligand AhR, hogy aktiválja AhR útvonal és hatását vizsgálták AhR útvonal aktiválása humán gyomorrák AGS sejt invázió, és feltárni a megfelelő mechanizmus. katalógusa Eredmények
Annak meghatározására, hogy AhR útvonal lehet aktiválni AGS sejtek kifejeződését vizsgáltuk a CYP1A1, a klasszikus célgénje AhR út után TCDD expozíciót. RT-PCR és Western-blot-analízis azt mutatta, hogy mind a CYP1A1 mRNS és fehérje expresszió fokozott dózis-függő módon alábbi TCDD kezelésére és AhR antagonista rezveratrol (RSV) megfordíthatja ezt a TCDD-indukált CYP1A1 expressziót. Annak meghatározására, hogy a TCDD kezelésére AGS sejtek eredményezi egy indukciós az MMP-9-expresszió, észleltünk MMP-9 mRNS RT-PCR alkalmazásával, és kimutatható az MMP-9-enzimaktivitás segítségével zselatin zimográfia. Az eredmények azt mutatták, hogy mind az MMP-9 mRNS expresszió és az enzimatikus aktivitás fokozatosan nőtt a koncentráció növekedése TCDD a média és ezek a változások lehet visszafordítható RSV kezelés dózis-függő módon. Annak vizsgálatára, hogy AhR aktiváció-indukált MMP-9 expresszió és aktivitás AGS sejtek növekedését eredményezi migrációs és behatolás végeztünk sebgyógyító migrációs assay és transzwell migrációs és behatolás vizsgálattal. Miután TCDD kezelés, a migrációs távolság és a migrációs és behatolás képességeit AGS sejteket növekedett dózisfüggő módon. Annak igazolására, AhR aktiváció-indukált MMP-9 expresszió közvetítik c-Jun, siRNS transzfekciót végeztünk, hogy elhallgattassa a c-Jun mRNS AGS sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az MMP-9 mRNS expressziója és aktivitása a kezeletlen kontroll AGS sejteket nagyon gyenge; Miután TCDD (10 nmol /l) kezelésére, MMP-9 mRNS expressziója és aktivitása volt szignifikáns növekedés; Ez a TCDD-indukált MMP-9 expressziója és aktivitása növekedés volt szüntetni a c-Jun siRNS transzfekció.
Következtetés
AhR reakcióút aktiválása fokozza a gyomorrák sejt behatolásra valószínűleg keresztül a c-Jun-függő indukálása MMP-9. Eredményeink betekintést nyújt a mechanizmus és funkciója a AhR útvonal és annak hatása a gyomor daganatos progresszió. Katalógusa Háttér katalógusa aril-szénhidrogén receptor (AhR) egy ligandum által aktivált transzkripciós faktor az alap helix-loop-helix /per-Arnt-Sim család. A ligand hiányában, AhR van jelen a citoszolban formájában egy komplex két chaperone Hsp90s, egy Smal fehérje (P23) és egy immunofilinkötő-szerű fehérje (XAP2) [1, 2]. Upon ligandum, mint például 2,3,7,8-tetraklór-para-dioxin (TCDD, a leghatásosabb és a klasszikus exogén AhR ligandum) kötődését a chaperon proteinek disszociál és AhR áthelyeződnek a sejtmagba, hogy egy heterodimert képez annak partner molekula aril szénhidrogén receptor nukleáris translocator (ARNT) [3, 4]. Ez a heterodimer kötődik a specifikus DNS-régió nevezik dioxin válasz elem (DRE), amely egy mag szekvenciája 5'-TNGCGTG-3 ', és ezáltal aktivál egy akkumulátor gének expresszióját [5-7].
Történelmileg, tanulmányok a AhR útvonal középpontjában a transzkripciós szabályozása kódoló gének xenobiotikus metabolizáló enzimek, mint például a citokróm P450 enzimek [8]. A legújabb vizsgálatok kimutatták, szoros kapcsolata AhR emlőmirigy tumorogenezisben [7, 9]. AhR gén polimorfizmusok is kapcsolódik a megnövekedett kockázata a tüdő- és mellrákot [10, 11]. Fokozott expresszióját AhR számoltak be tüdő-, emlő-, és hasnyálmirigy-rák emberben [7, 12, 13]. A vizsgálatok azt is sugallják, hogy konstitutívan aktív AhR elősegítheti hepatocarcinogenesis egerekben [14]. Az adatok alapján szoros kapcsolata AhR és tumorogenezisben. Azonban a kapcsolat a AhR és a tumor progresszióját nem világos.
Tumorsejteket invázió és metasztázis egy bonyolult folyamat, amelyek között degradációját extracelluláris mátrix (ECM) és az alapmembrán döntő lépés. Tumor invázió és metasztázis támaszkodik a kifejezés a mátrix metalloproteinázok (MMP-k), hogy elpusztítsák az ECM és alapmembrán, hogy lehetővé tegye sejtek migrációját. Az MMP-k egy csoportja cink függő metallopeptidases [15-17]. A mátrix metalloproteináz-9 (MMP-9) az egyik a IV típusú kollagenáz /zselatináz, melyek lebontják a bazális membrán kollagén és zselatin. [16] MMP-9 széles körben járó tumor invázió és metasztázis. [17] A szintézis az MMP-9 szabályozza számos növekedési faktorok, citokinek és hormonok [16, 18]. Legújabb tanulmány kapcsolódik TCDD-asszociált léziók aberráns mátrix metabolizmus [8]. Microarray adatok azt mutatják, hogy a TCDD /AhR megváltoztathatja a gének kifejeződését bevonni a mátrix anyagcsere és lerakódás [8]. Villano munkatársai [19], és Haque munkatársai [18] beszámolt arról, hogy AhR agonista TCDD képes indukálni az MMP-9-expresszió huamn melanóma sejtek és a prosztata rákos sejteket. Ezek a tanulmányok azt sugallják, hogy az MMP-9 expresszió lehet egy közös végpontot aktiválása a AhR útvonal [8, 19].
Gyomorrák a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat, és a második leggyakoribb oka a rák okozta halál a világ [20]. Gyomor rákos sejtek terjedését és áttétét gyakran vezet a rossz prognózissal. Számos tanulmány kapcsolódik AhR útvonal aktiválása gyomor kialakulásában. Chen és munkatársai azt találták fokozott expressziója AhR két emberi gyomor rákos sejtvonalat (RF1 és RF48) által microarray [21]. Ma és mtsai számoltak be, hogy egyidejű kifejezése AhR és CYP1A1 korrelál a gyomorrák fejlesztés [22]. Andersson és munkatársai megállapították, hogy konstitutívan aktivált AhR idézhet gyomor tumorok egy transzgén egér modelljében [23]. Egy másik a mi tanulmányok, azt találtuk, hogy AhR expresszió és nukleáris transzlokációs szignifikánsak voltak magasabbak a gyomorrák, mint a premalignus léziók és a normál gyomornyálkahártya [24]. Azonban a kapcsolat a AhR reakcióút aktiválást és gyomor rák terjedését és áttétét még mindig nem világos. Ezért megvizsgáltuk a hatását AhR útvonal aktiválása az emberi gyomor rákos sejteket. A bemutatott adatok demonstrálják, hogy a AhR útvonal lehet aktiválni a gyomorrák AGS sejtek és AhR útvonal aktiválás AGS sejtekben indukál MMP-9 expresszióját, és fokozza AGS sejtek migrációs és behatolás aktivitást. Továbbá, a mi az adatok azt mutatják, hogy ez a AhR aktiválással indukált MMP-9-expresszió által közvetített c-június
Eredmények és megbeszélés
AhR útvonal aktiválás AGS sejtekben
másik Vizsgálataink azt igazolták, hogy volt a magas szintű AhR expresszió AGS sejtekben [24]. Annak meghatározására, hogy AhR útvonal lehet aktiválni ebben a sejtvonalban megvizsgáltuk a kifejezés a citokróm P-450 1A1 (CYP1A1), egy klasszikus célgénje AhR út, következő AhR agonista TCDD expozíció. RT-PCR és Western-blot-analízis azt mutatta, hogy mind a CYP1A1 mRNS (1A.), És a fehérje (ábra. 1B) expressziót AGS sejteket fokozott dózis-függő módon követi a TCDD kezelést. Annak meghatározására, hogy ez a TCDD-indukált CYP1A1 expresszió Ahr-függő, AhR antagonista rezveratrol (RSV) használtunk, hogy blokkolja AhR útvonalon. Ábrán látható. 1C és 1D, RSV megfordíthatja TCDD-indukálta a CYP1A1 expresszió dózis-függő módon. Ezek az adatok igazolták, hogy AhR útvonal lehet aktiválni AGS sejtekben TCDD. 1. ábra AhR agonista TCDD és AhR antagonista RSV szabályozott CYP1A11 kifejezést AGS sejtekben. Miután különböző koncentrációkban (a fentiek szerint) a TCDD 24 órás kezelés, az (A) RT-PCR-analízis a CYP1A1 mRNS expressziójának egy koncentráció-reakció. (B) Western-blot analízis a CYP1A1 fehérje expresszióját egy koncentráció-reakció. Miután együttes kezelés TCDD (1 nM), valamint az RSV (különböző koncentrációban, amint fentebb) 24 órán át, a (C) mRNS expresszióját CYP1A1 detektáltuk RT-PCR-rel. (D) fehérje expresszióját CYP1A1 detektáltuk Western-blottal.
AhR útvonal aktiválás AGS sejtek indukálják az MMP-9-expresszió
Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy számos rákos sejtek, AhR agonista TCDD expozíció aktiválja az MMP-9 gén expressziójának [18, 19]. Annak meghatározása érdekében, vajon TCDD kezelésére AGS sejtek eredményezi egy indukciós az MMP-9-expresszió, észleltünk MMP-9 mRNS RT-PCR alkalmazásával következő TCDD expozíciót. Ábrán látható. 2A, MMP-9 mRNS expressziója indukálódott dózis-függő módon követi a TCDD kezelést. Szerepét vizsgálja a AhR útvonal közvetítésében TCDD-indukált MMP-9 expresszió AGS sejtekben tenyészeteket együttes kezelt TCDD és az AhR antagonista rezveratrol. Co-kezelés rezveratrol megszüntette TCDD-indukált MMP-9 expresszióját (ábra. 2C) kimutatták, hogy a TCDD-aktiválás az MMP-9-expresszió függ a AhR útvonalon. A fenti adatok azt mutatják, hogy AhR útvonal aktiválás AGS sejteket indukál MMP-9 mRNS expresszió. A legtöbb sejttípusban, a gén transzkripcióját az MMP-9-indukálható, és fordítás után az enzimet azonnal szekretálódik, és aktiválni a cisztein-kapcsoló mechanizmust [25]. Annak megállapításához, hogy ezek a változások a gén kifejeződésének AhR útvonal aktiválása változásokat eredményeznek a MMP-9 enzimaktivitást végeztünk zselatin zimográfiával. Az eredmények azt mutatták, hogy az MMP-9 aktivitás média fokozatosan nőtt a koncentráció növekedése TCDD a médiában (ábra. 2B) és ezek a változások megfordítható resveratrol kezelés dózisfüggő módon (ábra. 2D). Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy AhR útvonal aktiválás által kiváltott növekedés a MMP-9 expressziója korrelál a növekedés a MMP-9-aktivitást. 2. ábra AhR agonista TCDD és AhR antagonista RSV szabályozott MMP-9 expresszió és aktivitás AGS sejtekben. Miután különböző koncentrációkban (a fentiek szerint) a TCDD 24 órás kezelés, az (A) RT-PCR-analízis Az MMP-9 mRNS-expressziót egy koncentráció-reakció. (B) Zselatin zimográfia elemzése MMP-9 fehérje aktivitás egy koncentráció-reakció. Miután együttes kezelés TCDD (1 nM), valamint az RSV (különböző koncentrációban, amint fentebb) 24 órán át, a (C) mRNS expresszióját MMP-9-detektáltuk RT-PCR-rel. (D) fehérje aktivitásának MMP-9-detektáltuk zselatin zimográfiával.
AhR reakcióút aktiválása fokozza AGS sejtek migrációs és behatolás
MMP-9 egyike a IV típusú kollagenáz /zselatináz, amely szintén csökkentheti az ECM komponenseket. MMP-9 széles körben járó tumor invázió és metasztázis. [17] Tanulmányok kimutatták, szignifikáns korrelációt MMP-9 expresszió és invazív és a nyirokcsomó metasztázis gyomor- carcinoma [26-28]. Annak vizsgálatára, hogy AhR aktiváció-indukált MMP-9 expresszió és aktivitás AGS sejtek növekedését eredményezi migrációs és behatolás végeztünk sebgyógyító migrációs assay és transzwell migrációs és behatolás vizsgálattal. Miután TCDD kezelés, a migráció távolságát AGS sejtek szignifikánsan megnövekedett egy dózis-függő módon, ha, mint a kontroll sejtek (P < 0,01) (3A.). Transwell eredmények azt mutatták, jelentős növekedést a migráció (ábra. 3B) és az invázió (3C.) Képességeit AGS sejtek, amikor a sejteket a TCDD koncentrációban 0,1 nmol /l (P < 0,01) és 100 nmol /l ( p < 0,01). nincs jelentős hatása a migrációs és behatolás találtak TCDD koncentráció < 0,1 nmol /l (p 0,05). Az eredmények azt mutatták, hogy a AhR útvonal aktiválása növeli a gyomorrák AGS sejtek migrációs és behatolás. Degradációja ECM és membrán rendkívül fontos lépés a tumor invázió és metasztázis. Ez magában foglalja az intézkedés a mátrix metalloproteinázok (MMP-k). A vizsgálat kimutatta, hogy AhR útvonal aktiválás képes indukálni az MMP-9-expresszió és az enzimatikus aktivitás, és elősegíti a AGS sejtek migrációs és behatolás. Más tanulmányok azt mutatták, hogy AhR útvonal aktiválás képes indukálni a különböző MMP-k expresszióját [19, 29]. AhR útvonal aktiválása növeli a gyomorrák AGS sejtek migrációs és behatolás lehet azért is, mert más az MMP-k expressziója mellett MMP-9 expresszió. 3. ábra A hatás AhR agonista TCDD az AGS sejtek migrációs és behatolás. (A) Sebgyógyulái migrációs assay. (B) Transwell migrációs assay. (C) Transwell inváziós vizsgálat. Katalógusa c-Jun közvetített MMP-9 expresszió által kiváltott AhR útvonal aktiválása katalógusa mechanizmusa TCDD okozta változások MMP-9 expresszió nem teljesen világos. A legújabb vizsgálatok szerint a TCDD képes indukálni a c-Jun kifejezés [30, 31], valamint a c-Jun a célgént a AhR útvonal [8]; a promoter szekvenciát az 5'-szegélyező régió a humán MMP-9 gén tartalmazza a c-Jun-kötőhelyek [16] és a c-Jun képes indukált MMP-9 expresszióját [32]; a transzkripciós aktivitás a c-Jun jelentős fokozni gyomorrák [33]. Alapozza ezeket vizsgálati eredmények javasoltuk egy hipotézist, hogy a TCDD-indukált MMP-9-expresszió AGS sejtek által közvetített c-június Annak bizonyítására, ezt a hipotézist, először észlelte a c-Jun expresszió AGS sejtekben TCDD kezelést, és megállapította, hogy mind a c-Jun mRNS (4A. És 4C) és fehérje (ábra. 4B és 4D) kifejezést AGS sejteket fokozott egy adag (4A. és 4B) és az idő (ábra. 4C, 4D) függő módon követi a TCDD kezelést, és ez a TCDD-indukálta c-Jun kifejezés lehetne fenntartva AhR antagonista resveratrol (ábra. 4E és 4F). Fent adatok kimutatták, hogy a c-Jun a célgént a AhR reakcióút AGS sejtekben. További bizonyítására, hogy a c-Jun közvetíthet TCDD-indukált MMP-9 expresszió siRNS transzfekció végeztünk, hogy elhallgattassa a c-Jun mRNS AGS sejtekben. Az eredmények azt igazolták, hogy a c-Jun siRNS (végső koncentráció 50 nmol /l) a transzfekció majdnem teljesen megszüntette a c-Jun expresszió AGS sejtekben mind a mRNS szintjén (ábra. 4G) és a fehérje szinten (ábra. 4H). Ezért, miután a c-Jun siRNS transzfekció 48 órán át, AGS sejteket kezeltünk TCDD koncentrációban 10 nmol /l, 24 óra hosszat sejtüledéket és táptalajokat összegyűjtjük, és MMP-9 mRNS expressziója és aktivitása mértük. Ábrán látható. 4I és 4J, MMP-9 mRNS expressziója és aktivitása a kezeletlen kontroll AGS sejteket nagyon gyenge; Miután TCDD (10 nmol /l) kezelésére, MMP-9 mRNS expressziója és aktivitása volt szignifikáns növekedés; Ez TCDD-indukált MMP-9 expresszió és aktivitás növekedésének lehetne szüntetni a c-Jun siRNS transzfekció által nem befolyásolható kontroll siRNS transzfekció. A fenti adatok igazolták, hogy a c-Jun közvetített MMP-9 expresszió által kiváltott AhR útvonal aktiválás AGS sejtekben. 4. ábra c-Jun közvetíti TCDD-indukált MMP-9 expressziója és aktivitása. (A) TCDD indukálja a c-Jun-mRNS-expresszióját egy dózis-függő módon. (B) TCDD indukálja a c-Jun fehérje expresszióját egy dózis-függő módon. (C) TCDD indukálja a c-Jun-mRNS-expresszióját egy idő-függő módon. (D) TCDD indukálja a c-Jun fehérje expresszió idő-függő módon. (E) RSV megfordítja TCDD-indukálta c-Jun mRNS-expresszió. (F) az RSV megfordítja TCDD-indukálta c-Jun fehérje expresszióját. (G) c-Jun siRNS elhallgattatja c-Jun mRNS expresszió. (H) a c-Jun siRNS elnémítja a c-Jun fehérje expresszióját. (I) c-Jun siRNS gátolja a TCDD-indukált MMP-9 mRNS expressziót. (J) a c-Jun siRNS gátolja a TCDD-indukált MMP-9-aktivitás növekedésének.
Következtetés
Összefoglalva, a jelen tanulmány azt mutatják, hogy AhR útvonal lehet aktiválni a gyomorrák AGS sejtek és AhR útvonal aktiválás indukálja az MMP-9 expressziója és aktivitása, amely végül hozzájárul AGS migrációs és behatolás in vitro. Továbbá, a mi az adatok azt mutatják, hogy ez a AhR aktiválással indukált MMP-9-expresszió által közvetített c-június Mivel degradációja ECM és membrán rendkívül fontos lépés a tumor invázió és metasztázis, eredményeink betekintést nyújt a mechanizmus és funkciója a AhR útvonal és annak hatása az e folyamatok során gyomorrák progresszió. Katalógusa Methods katalógusa Sejtkultúra
Gyomorrák sejtvonalat AGS-t az American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), és tartottunk fenn RPMI 1640 tápközegben (Hyclone) kiegészített 2 mM glutaminnal, 10% magzati marhaszérummal (Hyclone), 100 egység /ml penicillinnel és 100 ng /ml gentamicin. Cellular környezet tartottuk 5% CO 2 és 37 ° C-on. A sejteket az exponenciális növekedési fázisban, és a teljes RNS-t és fehérjét állítottunk elő az alábbiakban leírtak szerint.
Kezelése a sejtek katalógusa TCDD és a resveratrol a Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Inkubálás után 24 órán át, a sejteket kezeltük a TCDD különböző koncentrációkban (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) vagy a TCDD (1 nM), valamint Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 uM) a 24 óra, vagy kezeljük a TCDD (1 nM) különböző ideig (0, 1, 6, 24, 48, 72 óra) volt. Valamennyi hatóanyagot feloldjuk dimetil-szulfoxidban (DMSO). Kontroll sejtek kapott 0,1% DMSO csak.
Kis interferáló RNS-szintézis katalógusa kis interferáló RNS-ek (siRNS) állítottunk elő és nagy teljesítményű tisztított (Ribo Biotechnology, Guangzhou). c-Jun siRNS (szensz, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT antiszensz, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) és a kontroll siRNS-ek (szensz, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT antiszensz, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), szem nem homológ bármely ismert emberi gén, oldunk RNáz-mentes DDH 2O, hogy a végső koncentráció 20 nmol /liter.
kis interferáló RNS-transzfekciós
Cells (5 × 10 5) szélesztünk rá kutak hat lyukú sejttenyésztő lemezekre, és hagyjuk letapadni 24 óra. Négy mikroliter Lipofectamine2000 (Invitrogen) lyukanként adtunk szérummentes OPTI MEM (Invitrogen) a végső komplexképző térfogata 250 ul, óvatosan összekeverjük, és szobahőmérsékleten inkubáltuk 5 percen keresztül. Öt mikroliter siRNS oldat lyukanként hígítottunk 250 ul szérummentes OPTI MEM. Keverjük össze a hígított siRNS oldat és a hígított Lipofectamine2000 óvatosan, és inkubáljuk szobahőmérsékleten 30 percig. A Lipofectamine2000 /siRNS komplexet adunk a lyukakba tartalmazó 1500 ul RPMI 1640, 10% FBS-sel, és inkubáljuk a sejtek normális tenyésztési körülmények között. Minden vizsgálatot végeztünk 48 óra után.
RNS izolálás és RT-PCR
Az összes sejtek RNS-t extraháltunk a Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) a gyártó utasításai szerint. cDNS-t szintetizáltunk 1 ng össz-RNS reverz transzkriptáz alkalmazásával, ReverTra AceTM (Toyobo Co., Osaka, Japán) mellett a következő feltétel: 30 ° C-on 10 percig, 42 ° C-on 20 percig, 99 ° C-on 5 percig, és 4 ° C-on 5 percig. PCR A cDNS végeztük a következő összetételű reakcióelegyben (30 ul): 2 ul cDNS templát, 2,5 mM MgCI 2, 200 uM dNTP-k, 0,3 umol primert az 1. és 2., és 1 egység Taq-DNS-polimeráz (New England Biolabs). Az amplifikációt végeztünk az alábbi feltételt: 94 ° C-on 5 percig, ezt követi 25-32 ciklus (denaturálja 45 s 94 ° C-, lágyítás, 30 s, és meghosszabbítja a 30 s, 72 ° C-on), majd a 72 ° C 7 percig. A részleteket a primerek, lágyítási hőmérséklet, amplifikációs ciklusokat, és a PCR-termék mérete a gén az 1. táblázatban felsorolt ​​A PCR termékeket elektroforézisnek 1,5% -os agaróz gélen, etidium-bromiddal festjük, és láthatóvá egy ultra-ibolya (UV) transzilluminátor. A sávok intenzitását az RT-PCR mennyiségileg Mennyiség Egy képalkotó elemző szoftver. A sávok intenzitását a CYP 1A1, MMP-9 és a C-Jun mRNS normalizáltuk a megfelelő sáv intenzitása a béta-aktin. Az adatokat jelentették átlag ± SD.Table 1 A primer szekvenciák és a PCR-amplifikációs feltételek
Gene
alapozók (5 '→ 3')
izzítás hőmérséklete (° C) Matton Cycles
Termék mérete (bp) Matton CYP1A1 katalógusa S: CCATGTCGGCCACGGAGTT katalógusa 59 katalógusa 32
174 katalógusa A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT katalógusa MMP-9 katalógusa S: CAACATCACCTATTGGATCC katalógusa 52,5 katalógusa 37 katalógusa 480 katalógusa A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT katalógusa c-Jun katalógusa S : TCAGACAGTGCCCGAGAT katalógusa 55,2 katalógusa 30 katalógusa 292 katalógusa A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG katalógusa béta-aktin katalógusa S: CTCGCTGTCCACCTTCCA katalógusa 52 katalógusa 30 katalógusa 256 katalógusa A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Rövidítések: S, érzékelik alapozó; A, antiszensz láncindító
Western-blot-analízis
sejtüledékeket homogenizáljuk lízis pufferben, amely 20 mM Hepes, 1 mM EGTA-t, 50 mM β-glicerofoszfát, 2 mM nátrium-ortovanadát, 10% glicerin, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT-t és 1 × Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Németország). A lizátumot centrifugáltuk 13000 rpm és 4 oC-on 10 percig. A felülúszót a teljes sejtlizátum. A fehérje koncentrációját mértük a BCA fehérje vizsgálati készlettel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Harminc mikrogramm fehérjét vittünk sávonként elválasztott 10% -os SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel, és vittük át ekvilibráltuk polivinilidén-difluorid membránra elektrolenyomatolással. A membránokat blokkoltuk TBS-T-pufferrel, ami 5% (w /v) zsírmentes tejpor. Ahr CYP1A1, a c-Jun és a béta-aktin-detektáltuk 2 órán elleni antitestek felhasználásával AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, munkahígítás 1: 150), a CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, munkahígítás 1: 500) , c-Jun (SC-1694, santa Cruz Biotechnology, munkahígítás 1: 200) és a béta-aktin (DZ0, Cell Signaling Technology, munkahígítás 1: 1000). Miután másodlagos antitestet inkubálás (munkahígítás 1: 2000), a fokozott kemilumineszcencia (Pierce Biotechnology, Inc.) határoztuk meg kitettség röntgen film. A sávok intenzitását a Western blot mennyiségi meghatározását Mennyiség Egy képalkotó elemző szoftver. A sávok intenzitását CYP 1A1 és c-Jun normalizálódtak a megfelelő sáv intenzitása béta-aktin. Az adatokat jelentették átlag ± SD.
Zselatin zimográfia
Media származó TCDD kezelt tenyészetek elektroforetizáltuk SDS-PAGE, ahol a gélt tartalmaz, 0,1% (w /v) zselatin. A gélt egy éjszakán át inkubáljuk Zn 2+ és Ca 2+ tartalmazó pufferrel, hogy a MMP-k, hogy visszanyerje a megfelelő szerkezetét és rontja a zselatin a gélben. Tiszta fehér sávok a Coomassie festett gél jeleznek MMP aktivitás. A sávok intenzitását mennyiségileg alkalmazásával Quantity One képalkotó elemző szoftver.
Sebgyógyulái migrációs assay
mérésére sejtek migrációját a sebgyógyulás során, AGS sejteket beoltottuk egyes lyukakban egy 6-lyukú tenyésztő lemezen. Amikor a sejtek elérték a konfluens állapotban, a sejt fázisokat sebesült egy műanyag mikropipettával csúcsot javasol, amelynek egy nagy nyílás. A közeget és a törmelék leszívjuk el, és helyébe 2,5 ml friss, szérummentes tápközegben, amely tartalmazott különböző koncentrációjú TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). A sejteket fényképezett minden 12 h után megsebzés fáziskontraszt mikroszkóppal. Értékeléséhez "seb lezárása" öt, véletlenszerűen kiválasztott pontok mentén minden egyes seb voltak megjelölve, és a vízszintes távolság a vándorló sejtek a kezdeti seb mértük. Az adatokat jelentették átlag ± SD.
Transwell migrációs és inváziós vizsgálati eljárás
kezelt vagy kezeletlen kontroll sejteket szélesztettünk három példányban be a felső kamrába egy Transwell beszúrni (Corning, New York, NY, USA) szérummentes közepes sűrűséggel 1 × 10 5 lyukanként. A migrációs assay, közepes, amely 5% szérumot helyeztünk az alsó kamrába, hogy egyfajta kemoattraktáns, majd a sejteket tovább inkubáltuk 18 óra hosszat. Nonmigratory sejteket eltávolítjuk a felső kamra által kaparás, és a sejteket maradó alsó felületén a betét megfestjük 0,1% -os kristályibolya 15 percig. A sejteket mikroszkóp alatt megszámoltuk. Inváziós vizsgálati eljárást végeztünk, mint a migrációs assay-fent, kivéve, inzerteket előzetesen bevont az extracelluláris mátrix (ECM) helyettesítő Matrigel (BD Biosciences), és inkubáltuk egy 24 órás periódus. Mindegyik klónt szélesztünk három párhuzamosban minden kísérletben, és mindegyik kísérletet megismételjük legalább háromszor. Cell migráció (vagy invázió) képesség = (a sejtek számát a kezelt csoportban /a sejtek száma a kontroll csoport) × 100%. Katalógusa Notes
Tie-Li Peng, Jie Chen hozzájárult egyaránt ezt a munkát. Katalógusa nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás katalógusa Ezt a munkát támogatják az alábbi juttatások: a támogatások Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 30670949, 30671904 számú és No.30871145), a megítélt támogatás az új tanár kínai Minisztérium oktatás (No.20070558288), a megítélt támogatás a PhD témavezető kínai Oktatási Minisztérium (No. 20060558010), a támogatást a Természettudományi Alapítvány Guangdong tartomány (No.5300767 és No.7001641). katalógusa a szerzők eredeti beküldötteknek képeket
alábbiakban a linkeket a szerzők eredeti beküldötteknek képeket. 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff A szerzők eredeti fájl a 4. ábra

• Feltételes túlélési analízis koreai gyomorrákos betegeknél átesett gyógyító gasztrektómiának
• Lehetne a fokozottabb hasznosítás a műtét után gyomor műtét: retrospektív study