activação Aril via receptor de hidrocarboneto aumenta a capacidade de invasão de células de câncer gástrico provavelmente através de uma indução de c-Jun-dependente da ativação da matriz metaloproteinase-9

Aril via receptor de hidrocarboneto aumenta a capacidade de invasão de células de câncer gástrico provavelmente através de uma indução de c-Jun-dependente da matriz de metaloproteinase-9
Abstract
Fundo
receptor de hidrocarboneto aromático Abberant (AhR) expressão e AhR via de ativação estão envolvidas na carcinogénese gástrica. No entanto, a relação entre a activação da via de Ahr e progressão do cancro gástrico é ainda pouco claro. No presente estudo, utilizou-se 2,3,7,8-tetracloro-para-dioxina (TCDD), um ligando clássico e mais potente de AhR, para ativar AhR via e investigou o efeito da ativação da via AhR em células AGS câncer gástrico humano invasão e explorou o mecanismo correspondente.
resultados
Para determinar se AhR via podem ser ativados nas células AGS, examinamos a expressão de CYP1A1, um gene alvo clássico da AhR caminho, após a exposição TCDD. RT-PCR e análise de Western blot mostrou que ambos CYP1A1 ARNm e a expressão de proteína foram aumentados numa forma dependente da dose a seguir ao tratamento e TCDD AhR antagonista de resveratrol (RSV), pode inverter esta expressão induzida CYP1A1-TCDD. Para determinar se o tratamento das células TCDD AGS resulta numa indução da expressão de MMP-9, foram detectados ARNm de MMP-9 utilizando RT-PCR e detectado MMP-9 actividade enzimática usando zimografia de gelatina. Os resultados mostraram que tanto a MMP-9, a expressão de ARNm e actividade enzimática foram gradualmente aumentado com o aumento da concentração de TCDD em meios e essas modificações podem ser invertida por tratamento de RSV de um modo dependente da dose. Para examinar se AhR ativação induzida por MMP-9 expressão e atividade nas células AGS resulta em aumento da migração e invasão, foi realizada a cicatrização de feridas ensaio de migração e transpoço ensaio de migração e invasão. Após o tratamento TCDD, a distância de migração e as capacidades de migração e invasão de células AGS foram aumentados com uma forma dependente da dose. Para demonstrar AhR induzida pela activação de MMP-9 expressão é mediada por c-jun, siARN transfecção foi realizada para silenciar ARNm de c-Jun em células AGS. Os resultados mostraram que a MMP-9, a expressão de ARNm e actividade nas células de controlo não tratadas AGS foram muito fraco; Após o tratamento TCDD (10 nmol /L), MMP-9, a expressão de ARNm e actividade foram significativas aumentada; Este MMP-9 expressão e atividade aumento induzido por TCDD pode ser abolido por c-Jun siRNA transfecção.
Conclusão
AhR ativação da via aumenta a capacidade de invasão de células de câncer gástrico provavelmente através de uma indução de c-Jun-dependente de MMP-9. Nossos resultados fornecem uma visão sobre o mecanismo e função da via AhR e seu impacto sobre a progressão do cancro gástrico.
Fundo
receptor de hidrocarboneto aromático (AhR) é um factor de transcrição activado por ligando do hélice-volta-hélice /per-Arnt-Sim família. Na ausência de ligando, AhR está presente no citosol na forma de um complexo com duas chaperona Hsp90s, uma proteína Smal (p23), e uma proteína de imunofilina-like (XAP2) [1, 2]. Após a ligando, tal como 2,3,7,8-tetracloro-para-dioxina (TCDD, o mais potente e clássica exógeno AhR ligando) de ligação, as proteínas chaperon dissociar e AhR translocar para o núcleo para formar um heterodímero com o seu parceiro molécula arilo translocador nuclear do receptor de hidrocarboneto (ARNT) [3, 4]. Este heterodímero se liga à região do ADN específico do elemento denominado resposta dioxina (DRE), a qual tem uma sequência de núcleo de 5'-TNGCGTG-3 ', e deste modo activa a uma bateria de expressão de genes [5-7].
Historicamente, estudos de Ahr via focaram-se na regulação da transcrição de genes que codificam enzimas metabolizadoras de xenobióticos, tais como enzimas do citocromo P450 [8]. Estudos recentes demonstraram uma estreita relação entre AhR e da glândula mamária tumorigênese [7, 9]. polimorfismos do gene AhR têm sido associados a um risco aumentado de câncer de pulmão e da mama [10, 11]. A expressão aumentada de Ahr tem sido relatada em pulmão, mama, cancros pancreáticos e em seres humanos [7, 12, 13]. Estudos também sugerem que AhR constitutivamente activa pode promover hepatocarcinogênese em ratos [14]. Estes dados indicam uma estreita relação entre AhR e tumorigênese. No entanto, a relação entre a Ahr e progressão do tumor não é clara.
Células tumorais invasão e metástase é um processo complicado que entre a degradação da matriz extracelular (ECM) e a membrana basal é um passo crucial. invasão tumoral e metástase baseia-se na expressão das metaloproteinases de matriz (MMPs) para destruir a membrana basal e ECM para permitir a migração de células. MMPs são um grupo de dependentes de zinco metalopeptidases [15-17]. Metaloproteinase-9 (MMP-9) é um dos tipo IV colagenase /gelatinases, que degradam colágeno membrana basal e gelatinas [16]. MMP-9 é amplamente associado com a invasão tumoral e metástase [17]. A síntese de MMP-9 é regulada por vários fatores de crescimento, citocinas e hormonas [16, 18]. estudo lesões associadas ao TCDD recentes ligados com o metabolismo da matriz aberrante [8]. dados de microarranjos demonstrar que TCDD /AhR alterar a expressão de genes envolver no metabolismo da matriz e deposição [8]. Villano et al [19] e Haque et al [18] relataram que AhR agonista TCDD poderia induzir a expressão de MMP-9 em células de melanoma huamn e células de cancro da próstata. Estes estudos sugerem que a expressão de MMP-9 pode ser um final comum da ativação da via AhR [8, 19].
O câncer gástrico é a quarta neoplasia maligna mais comum ea segunda causa mais frequente de morte relacionada ao câncer na mundo [20]. Gástrica células cancerosas invasão e metástase, muitas vezes levar a um mau prognóstico. Vários estudos ligados ativação da via AhR à carcinogênese gástrica. Chen et al encontraram um aumento da expressão de AHR em duas linhas de células de cancro humanas gástricas (RF1 e RF48) por análise de microarray [21]. Ma et al relataram que a expressão simultânea de Ahr e CYP1A1 está correlacionada com o desenvolvimento do cancro gástrico [22]. Andersson et ai descobriram que AhR constitutivamente activada poderia induzir tumores do estômago num modelo de ratinho transgénico [23]. Em outro de nossos estudos, descobrimos que a expressão AhR e translocação nuclear foram significativamente maior no câncer gástrico do que em lesões pré-malignas e mucosa gástrica normal, [24]. No entanto, a relação entre a ativação da via AhR e invasão câncer gástrico e metástase ainda não está claro. Por conseguinte, foram investigados os efeitos de activação da via Ahr em células de cancro gástrico humano. Os dados aqui apresentados demonstram que AhR via pode ser activado em células de cancro gástrico AGS e activação da via AHR em células AGS induz a expressão de MMP-9 e aumenta células AGS migração e invasão actividade. Além disso, nossos dados mostram que este induzida por ativação de MMP-9 expressão AhR é mediada por c-junho
Resultados e discussão
ativação da via AhR nas células AGS
Em outro dos nossos estudos têm demonstrado que há era um elevado nível de expressão AHR em células AGS [24]. Para determinar se AhR via pode ser activado nesta linha de células, foi examinada a expressão do citocromo P-450 1A1 (CYP1A1), um gene alvo clássico de Ahr via, a seguir a exposição agonista AhR TCDD. RT-PCR e análise de Western blot mostrou que tanto a expressão de ARNm de CYP1A1 (Fig. 1A) e de proteína (Fig. 1B) em células de AGS foram aumentados numa forma dependente da dose a seguir ao tratamento da TCDD. Para determinar se a expressão de CYP1A1 é induzida por TCDD AhR-dependente, AhR resveratrol antagonista (RSV) foi utilizado para bloquear AhR via. Como mostrado na Fig. 1C e 1D, o RSV pode reverter expressão CYP1A1 induzida por TCDD de uma forma dependente da dose. Estes dados demonstram que AhR via pode ser activado em células AGS por TCDD. Figura 1 AhR agonista TCDD e AhR RSV antagonista expressão CYP1A11 regulada em células AGS. Depois de diferentes concentrações (como mostrado acima) de tratamento de TCDD, durante 24 horas, (a) a análise de RT-PCR da expressão de ARNm de CYP1A1 em uma concentração-resposta. (B) análise por Western blot da expressão da proteína de CYP1A1 em uma concentração-resposta. Após o co-tratamento com TCDD (1 nM) e RSV (a diferentes concentrações como indicado acima), durante 24 horas, (C) a expressão de ARNm de CYP1A1 foi detectada por RT-PCR. (D) A expressão da proteína de CYP1A1 foi detectado por Western blot.
Activação da via AHR em células AGS induzir a expressão de MMP-9
estudos anteriores demonstraram que em várias células cancerígenas, AhR exposição agonista TCDD activa de MMP-9, a expressão do gene [18, 19]. A fim de determinar se o tratamento das células TCDD AGS resulta numa indução da expressão de MMP-9, foi detectada a MMP-9 ARNm por meio de RT-PCR após a exposição da TCDD. Como se mostra na fig. 2A, MMP-9, a expressão de ARNm foi induzida de uma maneira dependente da dose a seguir ao tratamento da TCDD. Para examinar o papel da via AHR em mediar induzida TCDD MMP-9 a expressão em células AGS, as culturas foram co-tratados com o antagonista de TCDD, e o resveratrol AhR. Co-tratamento com resveratrol abolida induzida por TCDD MMP-9 de expressão (Fig. 2C) demonstraram que a TCDD-activação de MMP-9 de expressão está dependente da via de Ahr. dados acima indicam que a activação AhR via em células AGS induz MMP-9 a expressão de ARNm. Na maioria dos tipos de células, a transcrição do gene de MMP-9 é induzível, e após a tradução a enzima é imediatamente activado e segregada através do mecanismo de interruptor de cisteína-[25]. Para determinar se estas alterações na expressão de genes seguintes resultado de activação via Ahr em alterações na actividade de MMP-9 enzimática, foi realizada zimografia de gelatina. Os resultados mostraram que a MMP-9 em meio actividade é aumentada gradualmente com o aumento de concentração de TCDD em meios (Fig. 2B) e essas modificações podem ser invertida por tratamento com resveratrol numa forma dependente da dose (Fig. 2D). Estes dados demonstram que o aumento de activação induzida por via de Ahr em MMP-9 expressão correlaciona-se com um aumento na actividade de MMP-9. Figura 2 AhR agonista TCDD e AhR RSV antagonista regulada MMP-9 expressão e atividade em células AGS. Depois de diferentes concentrações (como mostrado acima) de tratamento de TCDD, durante 24 horas, (a) a análise de RT-PCR da expressão de MMP-9 ARNm numa concentração-resposta. (B) Análise de Gelatina zimografia da actividade da proteína MMP-9 em uma concentração-resposta. Após o co-tratamento com TCDD (1 nM) e RSV (a diferentes concentrações como indicado acima), durante 24 horas, (C) a expressão de ARNm de MMP-9 foi detectada por RT-PCR. (D) A actividade da proteína de MMP-9 foi detectado por zimografia em gelatina.
Activação da via AhR aumenta a migração e a invasão de células AGS
MMP-9 é um dos colagenase tipo IV /gelatinases que pode degradar componentes da matriz extracelular. MMP-9 é amplamente associado com a invasão tumoral e metástase [17]. Estudos têm demonstrado uma correlação significativa entre MMP-9 expressão e capacidade de invasão e metástases em linfonodos de carcinomas gástricos [26-28]. Para examinar se AhR ativação induzida por MMP-9 expressão e atividade nas células AGS resulta em aumento da migração e invasão, foi realizada a cicatrização de feridas ensaio de migração e transpoço ensaio de migração e invasão. Após o tratamento TCDD, a distância de migração de células AGS foi significativamente aumentada com um modo dependente da dose quando comparado com células de controlo (P < 0,01) (Fig. 3A). Resultados Transwell mostrou um aumento significativo de migração (Fig 3B.) e invasão (Fig 3C). capacidades de células AGS quando as células foram incubadas com a TCDD em concentrações de 0,1 nmol /L (p < 0,01) a 100 nmol /L ( p < 0,01). nenhum efeito significativo sobre a migração e invasão foi encontrada a uma concentração de <TCDD; 0,1 nmol /L (p > 0,05). Estes resultados demonstraram que a activação de via de Ahr aumenta cancro gástrico AGS células migração e invasão. A degradação de ECM e membrana basal é um passo essencial na invasão tumoral e metástases. Ela envolve a acção de metaloproteinases de matriz (MMPs). Nosso estudo demonstrou que AhR ativação da via poderia induzir MMP-9 expressão e atividade enzimática, e promover a AGS células migração e invasão. Outros estudos indicaram que a activação da via AhR pode induzir uma variedade de expressão de MMP [19, 29]. AhR ativação da via aumenta câncer gástrico AGS células migração e invasão pode ser também devido a outra expressão MMPs além MMP-9 expressão. Figura 3 O efeito do agonista AhR TCDD em AGS células migração e invasão. (A) a cicatrização de feridas ensaio de migração. ensaio de migração (B) Transwell. (C) Transwell ensaio de invasão.
C-Jun mediada MMP-9 expressão induzida por ativação da via AhR
O mecanismo de mudanças induzidas pelo TCDD na MMP-9 expressão não é totalmente clara. Estudos recentes relataram que a TCDD pode induzir a expressão de c-Jun [30, 31] e c-Jun é um gene alvo de Ahr via de [8]; a sequência do promotor na região flanqueante 5 'do gene de MMP-9 humano contém sítios de [16] e c-jun de ligação de c-Jun induzida pode MMP-9 expressão [32]; a actividade de transcrição de c-Jun é significativa aumentada no cancro gástrico [33]. Baseando-se os resultados deste estudo, propusemos uma hipótese que induzida por TCDD expressão de MMP-9 nas células AGS é mediada por c-junho Para demonstrar esta hipótese, foi detectada pela primeira vez a expressão de c-Jun em células AGS seguintes tratamento TCDD, e descobriram que tanto c-jun de ARNm (Fig. 4A e 4C) e de proteínas (Fig. 4B e 4D) Expressão em células de AGS foram aumentadas em uma dose (Fig. 4A e 4B) e tempo (Fig. 4C e 4D) seguinte maneira dependente tratamento TCDD, e esta expressão de c-Jun induzida por TCDD poderia ser reservados por Ahr resveratrol antagonista (Fig. 4E e 4F). Acima dados demonstraram que c-Jun é um gene alvo de AhR via em células AGS. Para demonstrar ainda que a de c-Jun induzida pode mediar-TCDD, MMP-9, expressão, transfecção foi realizada siRNA para silenciar ARNm de c-Jun em células AGS. Os resultados demonstraram que c-Jun siRNA (concentração final de 50 nmol /L) de transfecção quase aboliu completamente a expressão de c-Jun em células AGS tanto no nível de ARNm (Fig. 4G) e no nível de proteína (Fig. 4H). Portanto, depois de c-Jun siARN transfecção durante 48 horas, as células foram tratadas com AGS TCDD, numa concentração de 10 nmol /L durante 24 horas, a pelota de células e meios de cultura foram recolhidos, e MMP-9 a expressão de ARNm e actividade foram medidos. Como se mostra na fig. 4I e 4J, MMP-9, a expressão de ARNm e actividade nas células de controlo não tratadas AGS foram muito fraco; Após o tratamento TCDD (10 nmol /L), MMP-9, a expressão de ARNm e actividade foram significativas aumentada; Este MMP-9 expressão e atividade aumento induzido por TCDD pode ser abolido por c-Jun siRNA transfecção e não ser influenciado por controle siRNA transfecção. Os dados acima demonstram que a proteína c-Jun mediada por MMP-9 de expressão induzida por activação da via AHR em células AGS. A Figura 4 c-Jun induzida medeia-TCDD MMP-9 expressão e actividade. (A) TCDD induz a expressão de c-jun de ARNm de uma forma dependente da dose. (B) TCDD induz a expressão da proteína c-Jun de um modo dependente da dose. (C) TCDD induz a expressão de c-jun de ARNm de um modo dependente do tempo. (D) TCDD induz a expressão da proteína c-Jun de um modo dependente do tempo. (E) de RSV inverte a expressão de c-jun de ARNm induzido-TCDD. (F) de RSV inverte a expressão da proteína de c-Jun induzida por TCDD. (G) c-Jun siRNA silencia a expressão do mRNA c-junho (H) c-Jun siARN silencia a expressão da proteína c-junho (I) c-Jun inibe siARN MMP-9 expressão induzida de mRNA-TCDD. (J) c-Jun siRNA inibe a MMP-9 aumento da atividade induzida por TCDD.
Conclusão
Em conclusão, o presente estudo demonstram que AhR via podem ser ativados nas células AGS câncer gástrico e ativação da via AhR induz MMP-9 expressão e atividade que em última análise contribui para a migração AGS e invasão in vitro. Além disso, os nossos dados mostram que este induzida pela activação de MMP-9 expressão de Ah é mediado por c-junho Porque degradação da ECM e membrana basal é um passo essencial na invasão tumoral e metástase, nossos resultados fornecem uma visão sobre o mecanismo e função da via AhR e seu impacto sobre esses processos durante a progressão do cancro gástrico.
Métodos
cultura celular a linha celular de cancro gástrico
AGS foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), e foi mantida em meio RPMI 1640 (Hyclone) suplementado com glutamina 2 mM, 10% de soro bovino fetal (Hyclone), 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de gentamicina. ambiente celular foi mantida a 5% de CO 2 e 37 ° C. As células foram colhidas a partir da fase de crescimento exponencial e de ARN total e as proteínas foram preparadas como descrito a seguir. O tratamento de células

TCDD e resveratrol foram adquiridos da Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, EUA). Após incubação durante 24 horas, as células foram tratadas com a TCDD em diferentes concentrações (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) ou TCDD (1 nM) mais resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 uM) durante 24 horas, ou tratados com TCDD (1 nM) durante o tempo diferente (0, 1, 6, 24, 48, 72 horas), respectivamente. Todos os fármacos foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO). As células de controlo recebeu 0,1% DMSO somente.
pequeno interferir síntese de RNA
pequenos RNAs de interferência (siRNAs) foram sintetizados e de alto desempenho purificado (Ribo Biotecnologia, Guangzhou). c-Jun siRNAs (sentidos, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antisense, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) e controle siRNAs (sentido, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; antisense, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), tendo nenhuma homologia com quaisquer genes humanos conhecidos, foram dissolvidos em RNase DDH 2O para uma concentração final de 20 pmol /L.
pequeno ARN interferente
transfecção as células (5 × 10 5) foram plaqueadas em poços de placas de seis poços de cultura de células e deixa-se aderir durante 24 horas. Quatro microlitros Lipofectamine2000 (Invitrogen) por poço foram adicionados a livre de soro Opti MEM (Invitrogen) para um volume final de 250 complexante uL, misturou-se suavemente e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 minutos. Cinco microlitros de solução por cavidade de siRNA foram diluídos com 250 ul de soro livre de MEM Opti. Misture a solução diluída de siRNA e o Lipofectamine2000 diluída suavemente, e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. O complexo Lipofectamine2000 /siARN foi adicionado aos poços contendo 1500 mL de RPMI 1640 com 10% FBS e incubados em condições de cultura de células normais. Todos os ensaios foram realizados após 48 horas.
Isolamento de ARN e RT-PCR O ARN total
de células foi extraído utilizando o kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado com ARN total de 1 ug utilizando transcriptase reversa, ReverTra AceTM (Toyobo Co, Osaka, Japão) sob as seguintes condições: 30 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 20 min, 99 ° C durante 5 min, e 4 ° C durante 5 min. PCR do ADNc foi realizada numa mistura reaccional (30 ul), contendo 2 ul de ADNc molde, MgCl 2,5 mM 2, 200? M de dNTP, 0,3 uM de iniciadores 1 e 2, e 1 unidade de Taq DNA polimerase (New England Biolabs). A amplificação foi realizada utilizando as seguintes condições: 94 ° C durante 5 min, seguido de 25-32 ciclos (desnaturação durante 45 s a 94 ° C, recozimento durante 30 s, e estender-se por 30 s a 72 ° C), e, em seguida, 72 ° C por 7 min. Os detalhes de iniciadores, a temperatura de recozimento, os ciclos de amplificação, e o tamanho do produto de PCR para cada gene estão listados na Tabela 1. Os produtos da PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio e visualizada com um ultra-violeta (UV) transilluminator. intensidades das bandas em RT-PCR foram quantificados utilizando Quantidade Um software de análise de imagem. intensidades de banda de CYP 1A1, MMP-9 e C-Jun mRNA foram normalizados com intensidades de banda de beta-actina correspondente. Os dados foram apresentados como média ± SD.Table 1 sequências de primers e condições de amplificação de PCR
Gene
Primers (5 '→ 3')
temperatura de recozimento (° C)
Ciclos
tamanho do produto (pb)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: Beta-actina CTGCGTTAGCATGAGTTGG
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
abreviaturas: S, iniciador com sentido; Um, iniciador anti-sentido
análise Western blot
Os sedimentos celulares foram homogeneizados num tampão de lise contendo Hepes 20 mM, EGTA 1 mM, glicerofosfato β-50, ortovanadato de sódio 2 mM, 10% de glicerol, 1% de Triton X- 100, 1 mM de DTT, e 1 × Cocktail de Inibidor de Protease (Roche, Mannheim, Alemanha). O lisado foi centrifugado a 13000 rpm e 4 oC durante 10 minutos. O sobrenadante foi o lisado de células totais. A concentração de proteínas foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Trinta microgramas de proteína foi carregada por pista, separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10%, e transferido para uma membrana de difluoreto de polivinilideno equilibrada por electrotransferência. As membranas foram bloqueadas com tampão de TBS-T contendo 5% (w /v) de leite em pó magro. Ahr, CYP1A1, c-jun e beta-actina foram detectadas durante 2 horas, utilizando anticorpos contra a Ahr (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, diluição de trabalho 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, diluição de trabalho 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, diluição de trabalho 1: 200) e da beta-actina (DZ0, Cell Signaling Technology, trabalhando diluição 1: 1000). Após incubação do anticorpo secundário (diluição de trabalho 1: 2000), de quimioluminescência aumentada (Pierce Biotechnology, Inc.) foi determinada por exposição a filme de raios-x. intensidades das bandas em Western blot foram quantificados utilizando Quantidade Um software de análise de imagem. intensidades de banda de CYP 1A1 e c-Jun foram normalizados com intensidades de banda de beta-actina correspondente. Os dados foram registados como média ± DP.
Gelatina zimografia
Meios de TCDD culturas tratadas foi sujeito a electroforese em SDS-PAGE, em que o gel contém 0,1% (w /v) de gelatina. O gel foi incubada durante a noite em um Zn 2 + e Ca 2 + contendo tampão para permitir que as MMPs para recuperar a sua estrutura adequada e degradar a gelatina em gel. faixas brancas claras sobre o gel corado com Coomassie são indicativos da atividade de MMP. intensidades de banda foram quantificados utilizando Quantity One software de análise de imagem.
Cicatrização de feridas ensaio de migração
Para a medição da migração das células durante a cicatrização de feridas, as células AGS foram semeadas em poços individuais de uma placa de cultura de 6 poços. Quando as células atingiram um estado confluente, as camadas de células foram feridas com uma ponta de micropipeta de plástico tendo um grande orifício. O meio e os detritos foram aspirados e substituído por 2,5 ml de meio fresco isento de soro que continha diferentes concentrações de TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). As células foram fotografadas a cada 12 h após o ferimento por microscopia de contraste de fase. Para a avaliação de "fecho de feridas," cinco pontos seleccionados aleatoriamente ao longo de cada ferida foram marcados, e a distância horizontal de células a partir da ferida inicial migração foi medida. Os dados foram registados como média ± DP.
Ensaio de migração e invasão
Transwell tratados ou células de controlo não tratadas foram semeadas em triplicado, para a câmara superior de um Transwell inserir (Corning, Nova Iorque, NY, EUA) em soro-livre meio a uma densidade de 1 x 10 5 por poço. Para os ensaios de migração, meio contendo soro de 5% foi colocada na câmara inferior para actuar como um quimioatractor, e as células foram incubadas durante mais 18 h. células não migratório foram removidos da câmara superior por raspagem, e as restantes células na superfície inferior do inserto foram coradas utilizando 0,1% de violeta de cristal durante 15 minutos. As células foram contadas sob um microscópio. ensaios de invasão foram feitos como para os ensaios de migração descritas acima, excepto as inserções foram pré-revestidas com o substituto da matriz extracelular (ECM) de Matrigel (BD Biosciences) e incubou-se durante um período de 24 h. Cada clone foi plaqueado em triplicado em cada experiência e cada experiência foi repetida pelo menos três vezes. migração celular (ou invasão) Capacidade = (o número de células do grupo tratado /o número de células do grupo de controlo) × 100%.
Notas
Tie-Li Peng, Jie Chen contribuíram igualmente para este trabalho.
declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelos seguintes subsídios: os subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 30.670.949, No. 30.671.904 e No.30871145), uma subvenção concedida ao novo professor de Ministério de chinês educação (No.20070558288), uma subvenção concedida ao supervisor PhD Ministério chinês da educação (No. 20060558010), as doações da Fundação de Ciência Natural da província de Guangdong (No.5300767 e No.7001641).
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