activación de la vía del receptor de aril hidrocarburos aumenta la invasividad celular de cáncer gástrico probablemente a través de una inducción de c-Jun-dependiente de las metaloproteinasas de matriz-9

activación de la vía del receptor de aril hidrocarburos mejora la capacidad de invasión de células de cáncer gástrico probablemente a través de una inducción de c-Jun-dependiente de la matriz metaloproteinasa-9
Abstract
Antecedentes
receptor de aril hidrocarburos de Abberant (AHR) expresión y activación de la vía de AhR están involucrados en carcinogénesis gástrica. Sin embargo, la relación entre la activación de la vía de AhR y la progresión del cáncer gástrico es todavía poco clara. En este estudio, se utilizó 2,3,7,8-tetraclorodibenzoparadioxina-para-dioxina (TCDD), un ligando clásico y más potente de Ahr, para activar la vía Ahr y se investigó el efecto de Ahr activación de la vía sobre el cáncer gástrico humano de células AGS la invasión y explorado el mecanismo correspondiente.
: resultados de la vía Para determinar si Ahr puede ser activada en las células AGS, se analizó la expresión de CYP1A1, un gen diana de la vía clásica Ahr, después de la exposición TCDD. RT-PCR y análisis de transferencia Western mostraron que tanto CYP1A1 ARNm y la expresión de proteínas se aumentó de una manera dependiente de la dosis después del tratamiento TCDD y Ahr resveratrol antagonista (RSV) podría invertir esta expresión CYP1A1 TCDD inducida. Para determinar si el tratamiento de TCDD AGS células da como resultado una inducción de la MMP-9 expresión, se detectó MMP-9 mRNA mediante RT-PCR y se detectó MMP-9 actividad enzimática usando zimografía de gelatina. Los resultados mostraron que tanto MMP-9 expresión de ARNm y la actividad enzimática se aumentaron gradualmente con el aumento de la concentración de TCDD en los medios de comunicación y estos cambios podrían invertirse por tratamiento RSV de una manera dependiente de la dosis. Para examinar si AHR inducida por la activación de MMP-9 expresión y actividad en las células AGS resultados en aumento de la migración y la invasión, se realizó un ensayo de cicatrización de la herida y la migración transwell ensayo de migración y la invasión. Después del tratamiento TCDD, la distancia de migración y las capacidades de migración e invasión de células AGS se aumentó con una forma dependiente de la dosis. Para demostrar Ahr activación inducida por la expresión de MMP-9 está mediada por c-Jun, siRNA transfección se realizó para silenciar c-Jun mRNA en células AGS. Los resultados mostraron que la MMP-9 expresión de ARNm y la actividad en las células AGS de control sin tratar eran muy débil; Después del tratamiento TCDD (10 nmol /L), MMP-9 expresión y actividad de mRNA fueron significativas aumentado; Este MMP-9 expresión y actividad de aumento de TCDD inducida podría ser abolida por c-Jun siRNA transfección.
Conclusión
activación de la vía Ahr mejora la capacidad de invasión de células de cáncer gástrico probablemente a través de una inducción de c-Jun-dependiente de MMP-9. Nuestros resultados proporcionan información sobre el mecanismo y la función de la vía de Ahr y su impacto en la progresión del cáncer gástrico.
Antecedentes
receptor de aril hidrocarburos (AHR) es un factor de transcripción activado por ligandos de la hélice-bucle-hélice /por Arnt-Sim familia. En ausencia de ligando, Ahr está presente en el citosol en forma de un complejo con dos chaperona Hsp90s, una proteína smal (p23), y una proteína inmunofilina-como (XAP2) [1, 2]. Al ligando tal como 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-para-dioxina (TCDD, el exógeno Ahr ligando más potente y clásico) de unión, las proteínas se disocian y chaperon Ahr translocan en el núcleo para formar un heterodímero con su arilo molécula pareja receptor de hidrocarburo translocador nuclear (ARNT) [3, 4]. Este heterodímero se une a la región de ADN específica elemento denominado respuesta dioxina (DRE), que tiene una secuencia central de 5'-TNGCGTG-3 ', y de ese modo activa una batería de genes de expresión [5-7].
Históricamente, los estudios de la vía de Ahr se han centrado en la regulación transcripcional de los genes que codifican las enzimas que metabolizan xenobióticos tales como las enzimas del citocromo P450 [8]. Estudios recientes demostraron una estrecha relación entre Ahr y la glándula tumorigénesis mamaria [7, 9]. polimorfismos de genes Ahr se han relacionado con un mayor riesgo de cáncer de pulmón y de mama [10, 11]. El aumento de expresión de Ahr se ha informado en pulmón, mama, y ​​cáncer de páncreas en seres humanos [7, 12, 13]. Los estudios también sugieren que constitutivamente activa Ahr puede promover hepatocarcinogénesis en ratones [14]. Estos datos indican una estrecha relación entre Ahr y la tumorigénesis. Sin embargo, la relación entre Ahr y la progresión del tumor no está claro.
Células tumorales invasión y metástasis es un proceso complicado entre los que la degradación de la matriz extracelular (ECM) y la membrana basal es un paso crucial. la invasión tumoral y la metástasis se basa en la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) para destruir la membrana de ECM y el sótano para permitir la migración celular. MMPs son un grupo de zinc dependiente metalopeptidasas [15-17]. Metaloproteinasa de la matriz 9 (MMP-9) es una de las colagenasa tipo IV /gelatinasas, que degradan colágenos y gelatinas [16] de la membrana basal. MMP-9 es ampliamente asociado con la invasión tumoral y la metástasis [17]. La síntesis de MMP-9 está regulado por varios factores de crecimiento, citoquinas y hormonas [16, 18]. estudio de TCDD lesiones asociadas a enlaces recientes con metabolismo de la matriz aberrante [8]. Microarray datos demuestran que TCDD /Ahr alterar la expresión de genes implican en el metabolismo de la matriz y la deposición [8]. Villano et al [19] y Haque et al [18] informaron de que Ahr agonista TCDD podría inducir MMP-9 expresión en células de melanoma huamn y células de cáncer de próstata. Estos estudios sugieren que la expresión de MMP-9 puede ser un punto final común para la activación de la vía de Ahr [8, 19].
El cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en el mundo [20]. Gástrica células de cáncer de invasión y metástasis a menudo conducen a un mal pronóstico. Varios estudios vinculados activación de la vía de AhR a la carcinogénesis gástrica. Chen et al encontró aumento de la expresión de AHR en dos líneas celulares de cáncer gástrico humano (RF1 y RF48) por el análisis de microarrays [21]. Ma et al informaron de que la expresión simultánea de Ahr y CYP1A1 se correlaciona con el desarrollo del cáncer gástrico [22]. Andersson et al encontraron que constitutivamente activado Ahr podría inducir tumores de estómago en un modelo de ratón transgénico [23]. En otro de nuestros estudios, hemos encontrado que la expresión de AhR y la translocación nuclear eran significativamente mayor en el cáncer gástrico que en las lesiones premalignas y normal de la mucosa gástrica [24]. Sin embargo, la relación entre la activación de la vía de AhR y la invasión del cáncer gástrico y metástasis todavía no está claro. Por lo tanto, se investigó el efecto de la activación de la vía Ahr en células de cáncer gástrico humano. Nuestros datos presentados aquí demuestran que la vía de Ahr se puede activar en las células AGS de cáncer gástrico y activación de la vía de AhR en células AGS induce MMP-9 expresión y mejora la migración de células AGS y la actividad invasión. Además, nuestros datos muestran que esta activación inducida por MMP-9 expresión Ahr está mediada por c-jun.
Resultados y discusión
Ahr activación de la vía en células AGS
En otro de nuestros estudios hemos demostrado que hay era un alto nivel de expresión en las células AGS Ahr [24]. Para determinar si la vía de AhR puede ser activado en esta línea celular, se analizó la expresión de citocromo P-450 1A1 (CYP1A1), un gen diana clásico de la vía de Ahr, después de la exposición Ahr TCDD agonista. RT-PCR y análisis de transferencia Western mostraron que tanto la expresión de CYP1A1 mRNA (Fig. 1A) y proteína (Fig. 1B) en las células AGS se incrementaron de una manera dependiente de la dosis después del tratamiento TCDD. Para determinar si esta expresión CYP1A1 TCDD inducida Ahr es dependiente, se utilizó Ahr resveratrol antagonista (RSV) para bloquear la vía de Ahr. Como se muestra en la Fig. 1C y 1D, RSV podrían revertir expresión CYP1A1 TCDD inducida de una manera dependiente de la dosis. Estos datos demostraron que la vía de Ahr se puede activar en las células AGS por TCDD. Figura 1 Ahr agonista TCDD y RSV antagonista de expresión regulada CYP1A11 Ahr en células AGS. Después de diferentes concentraciones (como se muestra más arriba) de tratamiento TCDD durante 24 horas, (A) análisis de RT-PCR de la expresión de ARNm de CYP1A1 en una concentración-respuesta. (B) Análisis de transferencia Western de expresión de la proteína CYP1A1 en una concentración-respuesta. Después de co-tratamiento con TCDD (1 nM) y RSV (a diferentes concentraciones, como se muestra más arriba) durante 24 horas, (C) la expresión del ARNm de CYP1A1 fue detectada por RT-PCR. (D) Expresión de la proteína de CYP1A1 fue detectada por Western blot.
Activación de la vía de AhR en células AGS inducir MMP-9 expresión
Estudios anteriores han demostrado que en varias células cancerosas, Ahr exposición TCDD agonista activa MMP-9 expresión génica [18, 19]. Con el fin de determinar si el tratamiento de TCDD AGS células da como resultado una inducción de la MMP-9 expresión, se detectó MMP-9 mRNA mediante RT-PCR tras la exposición TCDD. Como se muestra en la fig. 2A, se indujo la expresión de MMP-9 mRNA de una manera dependiente de la dosis después del tratamiento TCDD. Para examinar el papel de la vía en la mediación de Ahr inducida por TCDD la expresión de MMP-9 en células AGS, los cultivos fueron co-tratado con TCDD y el resveratrol antagonista de AhR. Co-tratamiento con resveratrol abolió TCDD inducida por MMP-9 expresión (fig. 2C) demostró que TCDD-activación de MMP-9 expresión es dependiente de la vía de Ahr. datos anteriores indican que la vía de activación de AhR en células AGS induce MMP-9 expresión mRNA. En la mayoría de tipos de células, la transcripción de genes de MMP-9 es inducible, y después de la traducción de la enzima se secreta inmediatamente y se activa a través del mecanismo de cisteína-interruptor [25]. Para determinar si estos cambios en la expresión génica siguiente resultado Ahr activación de la vía de los cambios en la MMP-9 actividad enzimática, se realizó zimografía de gelatina. Los resultados mostraron que la actividad de MMP-9 en los medios de comunicación se aumenta gradualmente con el aumento de la concentración de TCDD en los medios de comunicación (fig. 2B) y estos cambios podría ser revertido por el tratamiento con resveratrol de una manera dependiente de la dosis (fig. 2D). Estos datos demuestran que el aumento inducido por activación de la vía de AhR en MMP-9 expresión se correlaciona con un aumento en la actividad de MMP-9. Figura 2 Ahr agonista TCDD y Ahr RSV antagonista reguladas MMP-9 expresión y la actividad en las células AGS. Después de diferentes concentraciones (como se muestra más arriba) de tratamiento TCDD durante 24 horas, (A) análisis de RT-PCR de MMP-9 expresión de ARNm en una concentración-respuesta. (B) Análisis de gelatina zimografía de MMP-9 actividad de la proteína en una concentración-respuesta. Después de co-tratamiento con TCDD (1 nM) y RSV (a diferentes concentraciones, como se muestra más arriba) durante 24 horas, (C) la expresión de mRNA de MMP-9 se detectó mediante RT-PCR. (D) la actividad de la proteína de MMP-9 se detectó por zimografía de gelatina.
Activación de la vía Ahr mejora la migración de células AGS y la invasión
MMP-9 es uno de los colagenasa tipo IV /gelatinasas que puede degradar los componentes de ECM. MMP-9 es ampliamente asociado con la invasión tumoral y la metástasis [17]. Los estudios han demostrado una correlación significativa entre la expresión de MMP-9 y capacidad de invasión y metástasis de los ganglios linfáticos de los carcinomas gástricos [26-28]. Para examinar si AHR inducida por la activación de MMP-9 expresión y actividad en las células AGS resultados en aumento de la migración y la invasión, se realizó un ensayo de cicatrización de la herida y la migración transwell ensayo de migración y la invasión. Después del tratamiento TCDD, la distancia de migración de las células AGS fue significativamente mayor con una forma dependiente de la dosis cuando se compara con células de control (P < 0,01) (Fig. 3A). resultados Transwell mostraron un aumento significativo de la migración (fig 3B.) y la invasión (figura 3C). capacidades de células AGS cuando las células se incubaron con TCDD en concentraciones de 0,1 nmol /L (P < 0,01) a 100 nmol /l ( p < 0,01). ningún efecto significativo en la migración y la invasión fue encontrado en la concentración de TCDD < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Estos resultados demostraron que la vía de activación de AhR mejora cáncer gástrico AGS células migración y la invasión. La degradación de ECM y la membrana basal es un paso esencial en la invasión tumoral y la metástasis. Se trata de la acción de las metaloproteinasas de matriz (MMPs). Nuestro estudio demostró que la activación de la vía Ahr podría inducir la expresión de MMP-9 y la actividad enzimática, y promover AGS células migración y la invasión. Otros estudios indicaron que la vía de activación de AhR puede inducir una variedad de MMPs expresión [19, 29]. activación de la vía Ahr mejora cáncer gástrico AGS células migración y la invasión puede ser también debido a otra expresión MMP además de MMP-9 expresión. Figura 3 El efecto de Ahr agonista TCDD en AGS células migración y la invasión. (A) Cicatrización de heridas ensayo de migración. ensayo de migración (B) Transwell. (C) de ensayo Transwell invasión.
C-Jun mediada por la expresión de MMP-9 inducida por la activación de la vía Ahr Francia El mecanismo de los cambios de TCDD inducida por MMP-9 expresión no está del todo claro. Estudios recientes informaron que la TCDD puede inducir la expresión de c-Jun [30, 31] y c-Jun es un gen diana de Ahr vía [8]; la secuencia del promotor en la región flanqueante 5 'del gen de la MMP-9 humana contiene c-Jun sitios [16] y c-Jun inducida de unión pueden MMP-9 expresión [32]; la actividad de transcripción de c-Jun es significativo mejorada en el cáncer gástrico [33]. Basándose en estos resultados del estudio, hemos propuesto una hipótesis que inducida por TCDD expresión de MMP-9 en células AGS está mediada por c-jun. Para demostrar esta hipótesis, se detectó por primera vez la expresión de c-Jun en las células AGS siguientes TCDD tratamiento, y encontró que tanto la c-Jun mRNA (Fig. 4A y 4C) y proteínas (fig. 4B y 4D) la expresión en células AGS se incrementaron en una dosis (fig. 4A y 4B) y el tiempo (fig. 4C y 4D) de manera dependiente después del tratamiento TCDD, y esta expresión c-Jun inducida por TCDD podrían reservarse por Ahr resveratrol antagonista (fig. 4E y 4F). Por encima de los datos demostró que el c-Jun es un gen diana de la vía de Ahr en células AGS. Para demostrar aún más que el c-Jun puede mediar TCDD inducida por MMP-9 expresión, siRNA transfección se realizó para silenciar c-Jun mRNA en células AGS. Los resultados demostraron que c-Jun siRNA (concentración final de 50 nmol /L) transfección casi abolió completamente la expresión de c-Jun en las células AGS tanto en el nivel de mRNA (Fig. 4G) y en el nivel de proteína (Fig. 4H). Por lo tanto, después de c-Jun siRNA transfección durante 48 horas, las células AGS se trataron con TCDD a una concentración de 10 nmol /L durante 24 horas, se recogieron sedimento de células y medios de cultivo, y MMP-9 expresión y actividad mRNA se midieron. Como se muestra en la fig. 4I y 4J, MMP-9 expresión del ARNm y la actividad en las células AGS de control no tratados eran muy débiles; Después del tratamiento TCDD (10 nmol /L), MMP-9 expresión y actividad de mRNA fueron significativas aumentado; Este MMP-9 expresión y actividad de aumento de TCDD inducida podría ser abolida por c-Jun siRNA transfección y no ser influenciado por el control de siRNA transfección. Por encima de los datos demostró que c-Jun mediada expresión de MMP-9 inducida por la activación de la vía Ahr en células AGS. Figura 4 c-Jun media de TCDD inducida por MMP-9 expresión y actividad. (A) TCDD induce la expresión de c-Jun mRNA de una manera dependiente de la dosis. (B) TCDD induce la expresión de la proteína c-Jun en una forma dependiente de la dosis. (C) TCDD induce la expresión de c-Jun mRNA de una manera dependiente del tiempo. (D) TCDD induce la expresión de la proteína c-Jun de una manera dependiente del tiempo. (E) RSV invierte la expresión de c-Jun mRNA TCDD inducida. (F) de RSV invierte expresión de la proteína c-Jun inducida por TCDD. (G) c-Jun siRNA silencia la expresión de ARNm c-jun. (H) c-Jun siRNA silencia la expresión de la proteína c-jun. (I) c-Jun siRNA inhibe la MMP-9 expresión de mRNA TCDD inducida. (J) c-Jun siRNA inhibe la MMP-9 aumento de la actividad inducida por TCDD.
Conclusión
En conclusión, el presente estudio demuestran que la vía de Ahr puede ser activada en las células AGS con cáncer gástrico y activación de la vía AHR induce MMP-9 expresión y actividad que en última instancia contribuye a la migración AGS y la invasión in vitro. Además, nuestros datos muestran que esta activación inducida por MMP-9 expresión Ahr está mediada por c-jun. Debido a la degradación de la MEC y la membrana basal es un paso esencial en la invasión tumoral y la metástasis, nuestros resultados proporcionan información sobre el mecanismo y la función de la vía de Ahr y su impacto en estos procesos durante la progresión del cáncer gástrico.
Métodos Cultivo de células
línea celular de cáncer gástrico
AGS se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), y se mantuvo en medio RPMI 1640 (Hyclone) suplementado con glutamina 2 mM, 10% de suero bovino fetal (Hyclone), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 g /ml de gentamicina. entorno celular se mantuvo en 5% de CO 2 y 37 ° C. Las células se recogieron a partir de la fase de crecimiento exponencial y el ARN total y proteínas se prepararon como se describe a continuación.
El tratamiento de células
TCDD y Resveratrol se adquirieron de Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, EE.UU.). Después de la incubación durante 24 horas, las células fueron tratadas con TCDD a diferentes concentraciones (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) o TCDD (1 nM) más Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 M) para 24 horas, o tratadas con TCDD (1 nM) durante un tiempo diferente (0, 1, 6, 24, 48, 72 horas) respectivamente. Todos los fármacos se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO). Las células de control recibieron 0,1% de DMSO solamente.
Pequeño interfiriendo la síntesis de ARN
pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) fueron sintetizados y purificados de alto rendimiento (Ribo Biotecnología, Cantón). c-Jun siRNAs (sensoriales, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antisentido, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) y de control de siRNAs (sentido, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; antisentido, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), teniendo ninguna homología con cualquier genes humanos conocidos, se disolvieron en RNasa libre de ddH 2O a una concentración final de 20 mmol /L.
pequeños ARN de interferencia transfección
Las células (5 × 10 5) se sembraron en pocillos de placas de cultivo de células de seis pocillos y se dejaron adherir durante 24 horas. Cuatro microlitros Lipofectamine2000 (Invitrogen) por pocillo se añadieron a libre de suero Opti MEM (Invitrogen) para un volumen final de 250 complejante l, se mezcló suavemente, y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Cinco microlitros de solución de siRNA por pocillo se diluyeron con 250 l sin suero Opti MEM. Mezclar la solución siRNA diluido y la Lipofectamine2000 diluida suavemente, y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. El complejo Lipofectamine2000 /siRNA se añadió a los pocillos que contienen 1500 l RPMI 1640 con 10% de FBS y se incubaron en condiciones de cultivo celular normales. Todos los ensayos se realizaron después de 48 horas. Aislamiento
ARN y RT-PCR
ARN total de las células se extrajo usando el kit Quiagen RNeasy Mini (Quiagen) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc con 1 mg de ARN total usando la transcriptasa inversa, ReverTra ACETM (Toyobo Co, Osaka, Japón) bajo la condición siguiente: 30 ° C durante 10 min, 42 ° C durante 20 min, 99 ° C durante 5 min, y 4 ° C durante 5 min. PCR de cDNA se llevó a cabo en una mezcla de reacción (30 l) que contiene 2 l de cDNA plantilla, mM MgCl 2,5 2, 200 mM dNTPs, 0,3 M de cebadores 1 y 2, y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (New England Biolabs). La amplificación se realizó usando las siguientes condiciones: 94 ° C durante 5 min, seguido de 25-32 ciclos (desnaturaliza durante 45 s a 94 ° C, recocido durante 30 s, y se extienden durante 30 s a 72 ° C), y luego 72 ° C durante 7 min. Los detalles de los cebadores, la temperatura de recocido, ciclos de amplificación, y el tamaño del producto de PCR para cada gen se enumeran en la Tabla 1. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron con un ultra-violeta (UV) transiluminador. Banda intensidades de RT-PCR se cuantificaron utilizando un software Cantidad de análisis de imágenes. Banda intensidades de CYP 1A1, MMP-9 y C-Jun mRNA se normalizaron con la intensidad de la banda de beta-actina correspondiente. Los datos se presentan como media ± SD.Table 1 Primer secuencias y condiciones de amplificación por PCR
Gene
cebadores (5 '→ 3')
La temperatura de hibridación (° C)
Ciclos
tamaño del producto gratis (pb) guía empresas CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59 32

174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: Beta-actina CTGCGTTAGCATGAGTTGG
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Abreviaturas: S, el sentido de imprimación; A, cebador antisentido
análisis de transferencia de Western
Los sedimentos celulares se homogeneizaron en un tampón de lisis que contiene Hepes 20 mM, EGTA 1 mM, 50 mM β-glicerofosfato, ortovanadato de sodio 2 mM, 10% de glicerol, 1% Triton X- 100, 1 mM de DTT, y 1 × inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche, Mannheim, Alemania). El lisado se centrifugó a 13.000 rpm y 4 oC durante 10 minutos. El sobrenadante era el lisado celular total. La concentración de proteína se midió usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Treinta microgramos de proteína se cargaron por carril, separados por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10%, y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno equilibrada por electrotransferencia. Las membranas se bloquearon con tampón TBS-T que contiene 5% (w /v) de leche descremada en polvo. Ahr, CYP1A1, se detectaron c-Jun y beta-actina durante 2 horas usando anticuerpos contra Ahr (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, dilución de trabajo 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, dilución de trabajo 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, la dilución de trabajo 1: 200) y beta-actina (DZ0, Cell Signaling Technology, trabajando dilución 1: 1000). Después de la incubación secundaria de anticuerpos (de trabajo dilución 1: 2000), un aumento de quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Inc.) se determinó por exposición a película de rayos x. intensidades de las bandas de Western blot se cuantificaron utilizando un software Cantidad de análisis de imágenes. Banda intensidades de CYP 1A1 y c-Jun se normalizaron con la intensidad de la banda de beta-actina correspondiente. Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
Zimografía de gelatina
Medios de cultivos tratados TCDD se sometió a electroforesis en SDS-PAGE en el que el gel contiene 0,1% (w /v) de gelatina. El gel se incubó durante la noche en un Zn 2 + y Ca 2 + que contenía tampón para permitir que las MMPs a recuperar su estructura adecuada y degradan la gelatina en el gel. bandas blancas claras sobre el gel teñido con Coomassie son indicativos de la actividad de MMP. Banda intensidades fueron cuantificados usando Quantity One software de análisis de imágenes.
de heridas de curación ensayo de migración
Para la medición de la migración celular durante la cicatrización de heridas, las células AGS se sembraron en pocillos individuales de una placa de cultivo de 6 pocillos. Cuando las células alcanzaron un estado de confluencia, las capas de células fueron heridos con una punta de micropipeta de plástico que tiene un orificio grande. El medio y los residuos se aspiraron de distancia y se sustituyen por 2,5 ml de medio libre de suero fresco que contenían diferentes concentraciones de TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). Las células se fotografiaron cada 12 h después de la herida por microscopía de contraste de fase. Para la evaluación de "cierre de la herida," cinco puntos seleccionados al azar a lo largo de cada herida fueron marcados, y se midió la distancia horizontal de la migración de las células de la herida inicial. Los datos se presentan como media ± desviación estándar.
Migración y la invasión Transwell ensayo
tratada o células control no tratadas se sembraron por triplicado en la cámara superior de un Transwell inserte (Corning, Nueva York, NY, EE.UU.) en medio sin suero medio a una densidad de 1 × 10 5 por pocillo. Para los ensayos de migración, medio que contiene suero al 5% se colocó en la cámara inferior para actuar como un quimioatrayente, y las células se incubaron adicionalmente durante 18 h. células no migratorias se retiraron de la cámara superior por raspado y las células restantes en la superficie inferior del inserto se tiñeron utilizando 0,1% de cristal violeta durante 15 minutos. Las células se contaron con un microscopio. Invasión ensayos se realizaron como para los ensayos de migración descrito anteriormente, excepto insertos se recubrieron previamente con la matriz extracelular (ECM) sustituto Matrigel (BD Biosciences) y se incubaron durante un periodo de 24 h. Cada clon se cultivó por triplicado en cada experimento y cada experimento se repitió al menos tres veces. La migración celular (o invasión) capacidad = (el número de células del grupo tratado /el número de células del grupo de control) x 100%.
Notas
Tie-Li Peng, Jie Chen contribuyeron igualmente a este trabajo.
declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (Nº 30670949, 30671904 y Nº No.30871145), una subvención concedida al nuevo maestro del Ministerio de china educación (No.20070558288), una subvención concedida al director de tesis del Ministerio de educación de china (Nº 20060558010), las becas de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.5300767 y No.7001641).
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