Arilo angliavandenilių receptorių kelias aktyvacijos pagerina skrandžio vėžio ląstelių invazinis greičiausiai per c-Jun-priklauso indukcijos matricos metaloproteinazės-9

Arilo angliavandenilių receptorių kelias aktyvacijos pagerina skrandžio vėžio ląstelių invazinis greičiausiai per c-Jun-priklausomo indukcijos matricos metaloproteinazės-9 pervežimas tezės
Background pervežimas Abberant arilo angliavandenilių receptorių (AHR) išraiška ir AHR kelias aktyvacijos dalyvauja skrandžio Kancerogeninis. Tačiau tarp AHR rūšyse įjungimo ir skrandžio vėžio progresavimo santykiai vis dar neaišku. Be šio tyrimo, mes panaudojome 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-para-dioksinų (TCDD), klasikinis ir labiausiai stiprus ligando AHR, norėdami įjungti AHR kelią ir tyrė AHR rūšyse aktyvavimo dėl žmogaus skrandžio vėžio AGS ląstelių poveikį invazija ir ištirti atitinkamą mechanizmą.
rezultatai
Norėdami nustatyti, ar AHR kelias gali būti aktyvuota AGS ląstelių, mes išnagrinėjo CYP1A1 išraišką, klasikinis tikslinę geną AHR keliu po TCDD poveikio. AT-PGR ir Vakarų dėmė analizė parodė, kad tiek CYP1A1 iRNR ir baltymų ekspresija buvo padidintos dozės priklausomu būdu po TCDD gydymo ir AHR antagonistas resveratrolio (RSV) gali pakeisti šią TCDD sukeltos CYP1A1 išraiška. Norėdami nustatyti, ar TCDD gydymas AGS ląstelių rezultatus į MMP-9 raiškos indukcijos, mes nustatėme, MMP-9 mRNR per RT-PGR ir nustatė MMP-9 fermentiniu aktyvumu naudojant želatinos zymography. Tyrimo rezultatai parodė, kad tiek MMP-9 iRNR raiška ir fermentinis aktyvumas buvo palaipsniui didinti koncentracijos padidėjimo TCDD žiniasklaidoje, ir šie pokyčiai gali būti atstatomi RSV gydymo dozės priklausomu būdu. Norėdami patikrinti, ar AHR aktyvacijos sukeltos MMP-9 raiška ir veikla AGS ląstelių rezultatų didėjančios migracijos ir invazija, mes atliekame žaizdų gijimo migracijos tyrimo ir transwell migracijos ir invazija tyrimą. Po TCDD gydymą, migracijos atstumas ir migracijos ir invazija gebėjimai AGS ląstelių buvo padidintas nuo dozės priklausomu būdu. Įrodyti AHR aktyvacijos sukeltos MMP-9 raiška tarpininkaujant c-Jun, siRNR transfekcija buvo atliktas nutildyti C-Bir mRNR AGS ląsteles. Rezultatai parodė, kad MMP-9 iRNR raiška ir veikla kontrolę neapdorojus AGS ląstelės buvo labai silpnas; Po TCDD (10 nmol /l) gydyti, MMP-9 iRNR raiška ir veikla buvo didelis skaičius; Tai TCDD sukeltos MMP-9 raiška ir veikla padidėjimas gali būti panaikinta C-Birželio siRNA transfekciją.
Išvada
AHR kelias aktyvacijos pagerina skrandžio vėžio ląstelių invazinis greičiausiai per c-Jun-priklausomo indukcijos MMP-9. Mūsų rezultatai suteikia įžvalgų mechanizmo ir funkcijos AHR keliu ir jos poveikį skrandžio vėžio progresavimą.
Faktai
arilą angliavandenilių receptorių (AHR) yra ligando aktyvuota transkripcijos faktorius pagrindinio sraigto-kilpinis spiralės /už Arnt-SIM šeima. Atsižvelgiant į ligando nėra, AHR yra pateikti į sudėtingą su dviem šaperono Hsp90s A smal baltymų (P23) forma citozolyje, o imunofilino panašus baltymas (XAP2) [1, 2]. Po ligando, pvz 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-para-dioksinų (TCDD, labiausiai stiprus ir klasikinės egzogeninė AHR ligandas) privaloma, chaperon baltymai atskirti ir AHR translocate į branduolį formuoti heterodimerą su savo partneriu molekulės arilas angliavandenilių receptorių atominės translocator (Arnt) [3, 4]. Tai heterodimero jungiasi prie specifinės DNR regione vadinami dioksinų atsakas elementas (DRE), kuri turi pagrindinę seką 5'-TNGCGTG-3 ', ir tokiu būdu aktyvuoja genų išraiškos [5-7] bateriją.
Istoriškai, mokytis iš AHR keliu sutelktas į transkripcijos reguliavimo genų, koduojančių ksenobiotinių metabolizmą fermentų, pavyzdžiui, citochromo P450 fermentų [8]. Naujausi tyrimai parodė glaudų AHR ir pieno liaukų Tumorigenesis [7, 9]. AHR genų polimorfizmas buvo susijęs su padidėjusia rizika susirgti plaučių ir krūties vėžio [10, 11]. Padidėjo išraiška AHR buvo pastebėta plaučių, krūties, ir kasos vėžio žmonėms [7, 12, 13]. Tyrimai taip pat rodo, kad constitutively aktyvus AHR gali skatinti hepatocarcinogenesis pelėms [14]. Šie duomenys rodo, glaudų ryšį tarp AHR ir Tumorigenesis. Tačiau tarp AHR ir naviko progresavimas santykiai nėra aiškūs.
Vėžinių ląstelių invazija ir metastazės yra sudėtingas procesas, tarp kurių degradacija tarpląsteliniame (ECM) ir pamatinės membranos yra labai svarbus žingsnis. Naviko invazija ir metastazių remiasi matrikso metaloproteinazių (MMP) išraiškos sunaikinti ECM ir pamatinės membranos, kad būtų galima ląstelių migraciją. MMPs yra cinko priklauso metallopeptidases [15-17] grupė. Matrikso metaloproteinazės-9 (MMP-9) yra vienas iš IV tipo kolagenazės /želatinazių, kuri suyra pamatinės membranos kolagenai ir želatinos, [16]. MMP-9 yra plačiai susijęs su naviko invazija ir metastazių [17]. Iš MMP-9 sintezė yra reguliuojama keletą augimo faktorių, citokinų ir hormonų [16, 18]. Neseniai atliktas tyrimas susiję TCDD susijusių pakitimų su nukrypusiu nuo normos matricos metabolizmo [8]. Mikrogardeliq duomenys rodo, kad TCDD /AHR pakeisti genų įtraukti į matricos metabolizmo ir nusėdimo [8]. Villano ir kt [19] ir Haque ir kt [18] pranešė, kad AHR agonistas TCDD gali sukelti MMP-9 raišką huamn melanomos ląstelių ir prostatos vėžio ląstelių. Šie tyrimai rodo, kad MMP-9 raiška gali būti bendra vertinamoji baigtis aktyvavimo AHR keliu [8, 19].
Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia piktybinių navikų ir antra dažniausia priežastis, dėl vėžio susijusių mirties pasaulis [20]. Skrandžio vėžio ląstelės invazija ir metastazių dažnai sukelia prastos prognozės. Keli tyrimai susiję AHR keliu aktyvacijos skrandžio kancerogenezėje. Chen et al rasta padidėjo išraiška AHR dviem žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijų (RF1 ir RF48) pagal mikrogardeliq analizę [21]. Ma ir kt "pranešė, kad vienu metu išraiška AHR ir CYP1A1 koreliuoja su skrandžio vėžio vystymosi [22]. Andersson ir kt nustatė, kad constitutively aktyvuota AHR gali sukelti skrandžio auglių transgeninių pelių modelį [23]. Kitoje mūsų tyrimų, mes nustatėme, kad AHR išraiška ir branduolinės translokacijos buvo reikšmingai didesnis skrandžio vėžio nei ikivėžinių pakitimų ir normalus skrandžio gleivinės [24]. Tačiau tarp AHR rūšyse įjungimo ir skrandžio vėžio invazijos ir metastazių santykiai vis dar nėra aiški. Todėl mes tyrė AHR rūšyse aktyvavimo poveikį žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Mūsų duomenų pateikta čia įrodyti, kad AHR kelias gali būti aktyvuota skrandžio vėžio AGS ląstelių ir AHR rūšyse aktyvacijos AGS ląstelių skatina MMP-9 raiška ir stiprina AGS ląstelių migraciją ir invazija veiklą. Be to, mūsų duomenys rodo, kad ši AHR aktyvacijos sukeltos MMP-9 raiška tarpininkaujant c-Jun.
Rezultatai ir jų aptarimas
AHR rūšyse aktyvacijos AGS ląstelių
kitą mūsų tyrimais įrodėme, kad buvo aukšto lygio AHR raiškos AGS ląstelių [24]. Norėdami nustatyti, ar AHR kelias gali būti aktyvuota šiame ląstelių liniją, mes išnagrinėjo citochromo P-450 1A1 (CYP1A1), klasikinis tikslinę geno AHR kelio išraiška, po AHR agonistas TCDD poveikio. RT-PGR ir Western blot analizė parodė, kad tiek CYP1A1 mRNR (1A pav.) Ir baltymų (pav. 1B) ekspresija AGS ląstelių buvo didėjo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu taip TCDD gydymui. Norėdami nustatyti, ar šis TCDD sukeltos CYP1A1 ekspresija yra AHR priklausoma, AHR antagonistas resveratrolis (RSV) buvo naudojamas blokuoti AHR kelią. Kaip parodyta Fig. 1C ir 1D, RSV gali pakeisti TCDD-sukeltas CYP1A1 išraiška priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Šie duomenys rodo, kad AHR kelias gali būti aktyvuota AGS ląstelėse TCDD. 1 pav AHR agonistas TCDD ir AHR antagonistas RSV reglamentuoja CYP1A11 išraiška AGS ląsteles. Po to, kai skirtingų koncentracijų (kaip parodyta aukščiau) iš TCDD gydymo už 24 valandų, (A) RT-PGR metodu CYP1A1 iRNR išraiškos A koncentracijos ir atsako. (B) Western blot analizė CYP1A1 baltymų ekspresijos koncentracijos ir atsako. Po to, kai skiriami kartu su TCDD (1 nM) ir RSV (esant skirtingoms koncentracijoms, kaip parodyta aukščiau) už 24 valandų, (C) mRNR išraiška CYP1A1 buvo aptikta RT-PGR. (D) "baltymai CYP1A1 ekspresija buvo aptikta Vakarų dėmė.
AHR keliu aktyvinimo AGS ląstelių sukelti MMP-9 raiška
Ankstesni tyrimai parodė, kad keletą vėžinių ląstelių, AHR agonistas TCDD poveikis aktyvuoja MMP-9 genų ekspresiją [18, 19]. Siekiant nustatyti, ar TCDD gydymas AGS ląstelių rezultatus į MMP-9 raiškos indukcijos, mes nustatėme, MMP-9 iRNR naudojant RT-PGR po TCDD poveikio. Kaip parodyta Fig. 2A, MMP-9 mRNR išraiška buvo indukuota nuo dozės priklausomu būdu taip TCDD gydymui. Norėdami išnagrinėti AHR keliu tarpininkaujant TCDD sukeltas MMP-9 raišką AGS ląstelių vaidmenį, kultūros buvo bendrai gydomi TCDD ir AHR antagonistas resveratrolio. Kartu vartojant resveratrolio panaikinta TCDD sukeltos MMP-9 raiška (pav 2c.) Parodė, kad TCDD-aktyvavimo MMP-9 raiškos priklauso nuo AHR keliu. Minėti duomenys rodo, kad AHR kelias aktyvavimo AGS ląstelių skatina MMP-9 iRNR išraiška. Daugeliu tipų ląstelių, genas transkripcijos MMP-9 yra indukuojamas, ir po to, kai vertimo fermentas yra iš karto išsiskiria ir aktyvuota per cisteino-perjungimo mechanizmo [25]. Norėdami nustatyti, ar šie pokyčiai genų ekspresijos šie AHR rūšyse aktyvacijos rezultatas pokyčių MMP-9 fermentinio aktyvumo, mes atliekame želatinos zymography. Rezultatai parodė, kad MMP-9 veikla terpėje yra didinamas palaipsniui su koncentracijos padidėjimas ir TCDD žiniasklaidoje (pav 2B.), O šie pakeitimai gali būti pakeista į resveratrolio gydymo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu (pav. 2d). Šie duomenys rodo, kad AHR kelio sužadinimu sukeltos padidėjimas MMP-9 raiškos koreliuoja su į MMP-9 aktyvumo padidėjimu. 2 pav AHR agonistas TCDD ir AHR antagonistas RSV reglamentuoja MMP-9 raiška ir veikla AGS ląsteles. Po to, kai skirtingų koncentracijų (kaip parodyta aukščiau) iš TCDD gydymo už 24 valandų, (A) RT-PGR metodu MMP-9 iRNR išraiškos A koncentracijos ir atsako. (B) želatina zymography analizė MMP-9 baltymų veiklos į koncentracijos ir atsako. Po to, kai skiriami kartu su TCDD (1 nM) ir RSV (esant skirtingoms koncentracijoms, kaip parodyta aukščiau) už 24 valandų, (C) iRNR išraiška MMP-9 buvo aptikta RT-PGR. (D) "baltymai veikla MMP-9 buvo aptikta želatinos zymography.
AHR keliu aktyvacijos pagerina AGS ląstelių migraciją ir invazija
MMP-9 yra vienas iš IV tipo kolagenazę /želatinazių, kurie gali pabloginti ECM komponentus. MMP-9 yra plačiai susijęs su naviko invazija ir metastazių [17]. Tyrimai parodė reikšmingą koreliaciją tarp MMP-9 raiškos ir invazijos ir limfmazgių metastazių skrandžio karcinoma [26-28]. Norėdami patikrinti, ar AHR aktyvacijos sukeltos MMP-9 raiška ir veikla AGS ląstelių rezultatų didėjančios migracijos ir invazija, mes atliekame žaizdų gijimo migracijos tyrimo ir transwell migracijos ir invazija tyrimą. Po TCDD gydymą, migracijos atstumas AGS ląstelių buvo gerokai padidėjo dozės priklausomu būdu, kai, palyginti su kontrolinės ląstelių (p < 0,01) (. 3A pav). Transwell rezultatai parodė, kad gerokai padidėjo migracija (3b pav.) Ir invazija (pav 3C.) Gebėjimai AGS ląstelių, ląstelės inkubuojamos su TCDD koncentracija nuo 0,1 nmol /l (p < 0,01) iki 100 nmol /l ( p < 0,01). Reikšmingo poveikio migracijai ir invazijos buvo rastas TCDD koncentracijos < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Šie rezultatai parodė, kad AHR kelias aktyvacijos pagerina skrandžio vėžys AGS ląstelių migraciją ir invazija. Degradacija ECM ir pamatinės membranos yra esminis žingsnis naviko invazija ir metastazių. Tai reiškia, kad matricos metaloproteinazių (MMP) veiksmų. Mūsų tyrimas parodė, kad AHR kelias aktyvavimo gali sukelti MMP-9 raiška ir fermentiniu aktyvumu, ir skatinti AGS ląstelių migraciją ir invazija. Kiti tyrimai parodė, kad AHR kelias aktyvavimo gali sukelti daug MMP raiškos [19, 29] įvairovė. AHR kelias aktyvacijos pagerina skrandžio vėžys AGS ląstelių migraciją ir invazija taip pat gali būti dėl kitų MMP raiškos neskaitant MMP-9 raiška. 3 paveikslas iš AHR agonisto TCDD poveikis AGS ląstelių migracijos ir invazijos. (A), žaizdų gijimą migracijos tyrimą. (B), Transwell migracijos tyrimas. (C) Transwell invazija tyrimas.
C-Birželio tarpininkaujant MMP-9 raiška sukelia AHR rūšyse aktyvavimo
TCDD sukeltus pasikeitimus mechanizmo MMP-9 raiškos nėra visiškai aiškus. Naujausi tyrimai pranešė, kad TCDD gali sukelti C-Bir išraišką [30, 31] ir C-Jun taikinys genas AHR [8] keliu; rengėjas seka 5'-gretutinė regione žmogaus MMP-9 geno yra c-Birželio jungimosi vietų [16] ir C-Bir gali sukeltas MMP-9 raiška [32]; transkripcijos veikla c-Jun yra reikšmingas sustiprintos skrandžio vėžio [33]. Remiantis šių tyrimų rezultatais, mes pasiūlėme hipotezę, kad TCDD sukeltos MMP-9 raiška AGS ląstelių procesų, kuriuose c-Jun. Įrodyti šią hipotezę, mes pirmą kartą aptiko C-Bir išraišką AGS ląstelių šių TCDD gydymo, ir nustatė, kad tiek C-Birželio iRNR (pav. 4A ir 4C) ir baltymų (pav. 4B ir 4D) išraiška AGS ląstelių buvo padidintos į dozė (pav. 4a ir 4b) ir laiko (pav. 4c ir 4d) priklausomu būdu taip TCDD gydymo, ir tai TCDD-sukeltas c-birželis išraiška gali būti saugomos pagal AHR antagonistu resveratrolio (pav. 4E ir 4F). Minėti duomenys rodo, kad C-Jun taikinys genas AHR keliu į AGS ląsteles. Siekiant dar labiau įrodo, kad c-Birželio gali tarpininkauti TCDD sukeltos MMP-9 raiška, siRNR transfekcija buvo atliktas nutildyti C-Bir mRNR AGS ląsteles. Rezultatai parodė, kad C-birželis siRNR (galutinė koncentracija 50 nmol /L) transfekcija beveik visiškai panaikinta c-Jun ekspresiją AGS ląstelių tiek iRNR lygiu (pav 4G.) Ir į baltymų lygiu (4H pav.). Todėl po c-Birželio siRNA transfekciją 48 val, AGS ląstelės buvo gydomi TCDD ne koncentracijos 10 nmol /L 24 valandas, ląstelių gumulėlis ir kultūra žiniasklaida buvo surinkti, ir MMP-9 iRNR raiška ir veikla buvo matuojamas. Kaip parodyta Fig. 4I ir 4J, MMP-9 iRNR raiška ir veikla kontrolę neapdorojus AGS ląstelės buvo labai silpnas; Po TCDD (10 nmol /l) gydyti, MMP-9 iRNR raiška ir veikla buvo didelis skaičius; Tai TCDD sukeltos MMP-9 raiška ir veikla padidėjimas gali būti panaikinta C-Birželio siRNA transfekciją ir negali daryti įtakos valdymo siRNA transfekciją. Minėti duomenys parodė, kad c-Birželio tarpininkaujant MMP-9 raiška sukeltas AHR rūšyse aktyvacijos AGS ląsteles. 4 pav c-Birželio tarpininkauja TCDD sukeltos MMP-9 raiška ir veikla. (A), TCDD sukelia c-birželis iRNR išraiška priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. (B) TCDD sukelia c-Jun baltymo ekspresiją priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. (C) TCDD sukelia c-birželis iRNR ekspresiją laiko priklausomu būdu. (D) TCDD sukelia c-Jun baltymo ekspresiją ir tam tikru priklausomu būdu. (E), RSV apsisuks TCDD sukeltos c-Birželio iRNR išraiška. (F), RSV apsisuks TCDD sukeltos C-Bir baltymo ekspresiją. (G), c-Birželio siRNR nutildo C-Bir iRNR išraiška. (O) C-Birželio siRNR nutildo C-Bir baltymo ekspresiją. (I) formulės C-birželis siRNR slopina TCDD-sukeltas MMP-9 iRNR išraiška. (J) K-Birželio siRNR slopina TCDD sukeltos MMP-9 aktyvumo padidėjimu.
Išvada
Apibendrinant, šis tyrimas rodo, kad AHR kelias gali būti aktyvuota skrandžio vėžio AGS ląstelių ir AHR rūšyse aktyvavimo skatina MMP-9 išraiška ir veikla, kuri galiausiai prisideda prie AGS migracijos ir invazijos in vitro. Be to, mūsų duomenys rodo, kad šis AHR aktyvavimo sukeltas MMP-9 išraiška yra sąlygotas c-Jun. Kadangi degradacija ECM ir pamatinės membranos yra esminis žingsnis naviko invazija ir metastazių, mūsų rezultatai suteikia įžvalgų mechanizmo ir funkcijos AHR keliu ir jos poveikį šiems procesams metu skrandžio vėžio progresavimą.
Metodai
Mobilusis kultūra
Skrandžio vėžys ląstelių linija AGS buvo gauta iš Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje (ATCC, Rockville, MD), ir buvo palikta RPMI 1640 terpė (Hyclone), papildytoje su 2 mM glutamino, 10% vaisiaus galvijų serumo (Hyclone), 100 vienetai penicilino /ml, ir 100 mikrogramų /ml gentamicinu. Korinio aplinka buvo tęsiamas skiriant 5% CO 2 ir 37 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo nuimta nuo eksponentinio augimo fazės ir visos RNR ir baltymų buvo paruoštas kaip aprašyta žemiau.
Gydymas ląstelės
TCDD ir Resveratrolis buvo įsigytas iš Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Po inkubacijos 24 valandas, ląstelės buvo gydomi TCDD esant skirtingoms koncentracijoms (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nm) arba TCDD (1 nM), taip pat Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 mikromolių) dėl 24 valandas arba apdoroti su TCDD (1 nM) dėl skirtingu laiku (0, 1, 6, 24, 48, 72 valandas) atitinkamai. Visi vaistai buvo ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO). Kontrolės ląstelės gavo 0,1% DMSO tik.
Sirnr sintezę
mažųjų trukdančių RNR (siRNAs) buvo susintetinti ir gerų parametrų išgrynintas (RIBO Biotechnologijos, Guangdžou). c-Birželio siRNAs (prasme CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antiprasmq, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) ir kontrolės siRNAs (jausmas, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; Priešprasminis, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), turint ne homologiją su visais žinomais žmogaus genų, ištirpinti RNaze be DDH 2O, kad galutinė koncentracija 20 mkmol /L.
sirnr transfekciją
ląstelės (5 × 10 5) buvo padengtą ant šulinių iš šešių duobučių ląstelių kultūros plokščių ir leidžiama laikytis už 24 valandos. Keturi mikrolitrų Lipofectamine2000 (Invitrogen) viename šulinėlyje buvo įtraukta į serumo neturinčioje Opti MEM (Invitrogen), kad galutinė kompleksodario tūrio 250 ml, švelniai maišyti, ir inkubuojami kambario temperatūroje 5 min. Penki mikrolitrai siRNA tirpalą per gerai buvo skiedžiamas 250 iL serumo neturinčioje Opti atm. praskiestų siRNA tirpalo ir praskiestas Lipofectamine2000 maišyti švelniai, ir inkubuojama kambario temperatūroje 30 minučių. Lipofectamine2000 /siRNR kompleksas buvo pridėta į šulinius, kurių sudėtyje yra 1500 mikrol, RPMI 1640 su 10% FBS ir inkubuojami esant normalioms ląstelių kultūros sąlygomis. Visi tyrimai buvo atlikti po 48 valandų.
RNR išskyrimo ir PGR
viso RNR ląstelių buvo išgauti naudojant Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) pagal gamintojo instrukcijas. kDNR buvo susintetintas su 1 mikrogramų visos RNR naudojant atvirkštinę transkriptazės, ReverTra AceTM (Toyobo Co, Osaka, Japonija) pagal šią sąlygą: 30 ° C 10 min, 42 ° C temperatūroje 20 min, 99 ° C temperatūroje 5 min ir 4 ° C 5 min. PGR kDNR buvo atliktas reakcijos mišinyje, (30 pl), kuriame yra 2 įxL šablono kDNR, 2,5 mM MgCl 2, 200 pM dNTP, 0,3 mkm pradmenų 1 ir 2, ir 1 vienetas Taq DNR polimerazės (New England Biolabs). Amplifikacija buvo atliekama naudojant šias sąlygas: 94 ° C 5 min, o po to 25-32 ciklų (denatūruotis 45 s 94 ° C, atkaitina 30 s, ir išplėsti 30 s 72 ° C temperatūroje), ir tada 72 ° C, 7 min. Į gruntai, atkaitinimo temperatūra, amplifikacijos ciklų ir PGR produkto dydis už kiekvieną geną detalės yra išvardyti 1 lentelėje PGR produktai buvo elektroforezė apie 1,5% agarozės gelyje, tamsintas su etidžio bromido, ir vizualizuoti su ultravioletiniams (UV) transiliuminatoriumi. Band intensyvumas RT-PGR buvo įvertinami naudojant kiekį Viena vaizdo analizės programinė įranga. Band intensyvumas CYP 1A1, MMP-9 ir C-Jun mRNR buvo normalizuotas su atitinkamomis band intensyvumo beta-aktino. Duomenys buvo pranešta kaip vidurkis ± SD.Table 1 PRIMER sekų ir PGR amplifikacijos sąlygomis
Genų
Gruntai (5 '→ 3')

atkaitinimo temperatūra (° C),

ciklai
Gaminio dydis (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480 pervežimas A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT pervežimas c-Jun pervežimas S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292 pervežimas A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta aktino
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Sutrumpinimai: S pajusti gruntą; A Priešprasminis gruntas
Vakarų dėmė analizė
Mobilaus granules buvo homogenizuoti į lizės buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra 20 mm Hepes, 1 mM EGTA, 50 mm β-gliukonatas, 2 mM natrio orthovanadate, 10% glicerolis, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT ir 1 × proteazės inhibitorius Kokteilių (Roche, Manheimas, Vokietija). Lizatas buvo centrifuguojamas 13000 rpm ir 4 ° C temperatūroje 10 minučių. Supernatantas buvo bendras ląstelių lizatas. Baltymų koncentracija buvo matuojama naudojant BCA baltymų Bandymo komplektas (Pierce Chemical Co, Rockford, IL). Trisdešimt mikrogramų baltymų buvo pakrauta už juostos, atskirti 10% SDS-poliakrilamido gelyje, ir perkeliamas ant Išbalansuoto polivinilideno difluoridą membranos electroblotting. Membranos buvo užblokuotas su TBS-T buferis, kuriame yra 5% (w /v) Nonfat sauso pieno. AHR, CYP1A1, c-Dec ir beta-aktino buvo aptikta 2 valandas, naudojant antikūnus prieš AHR (SC-5579, Santa Cruz biotechnologijos, darbo skiesti 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International ", darbo praskiedimo 1: 500) c-Birželio (SC-1694, Santa Cruz biotechnologijos, darbo skiesti 1: 200) ir beta-aktino (DZ0, Mobilaus ryšio Signaling technologija, darbinį tirpalą 1: 1000). Po to, kai antrinio antikūno inkubacijos (darbo praskiedimo 1: 2000), chemiliuminescencijos sustiprinimo (Pierce Biotechnology, Inc) buvo nustatomas pagal poveikio rentgeno juostą. Band intensyvumas Vakarų dėmė buvo įvertinami naudojant kiekį Viena vaizdo analizės programinė įranga. Band intensyvumas CYP 1A1 ir C-Bir susinormalizavo su atitinkamomis band intensyvumo beta-aktino. Duomenys buvo pranešta kaip vidurkis ± SD.
Želatina zymography
Media iš TCDD kultūrų, paveiktų tiriamąja buvo elektroforezė su SDS-PAGE, kur gelis yra 0,1% (w /v) želatina. Gelis inkubuojami per naktį Zn 2 + ir Ca 2+, kuriame buferį sudaryti sąlygas MMPs atgauti tinkamą struktūrą ir degraduoja želatina gelio. Išvalyti baltos juostos ant Coomassie tamsintas gelis yra orientaciniai MMP veikla. Band intensyvumas buvo įvertinami naudojant Kiekis One vaizdo analizės programinė įranga.
Žaizdų gijimo migracija Bandymo
Dėl ląstelių migracijos matavimo metu žaizdų gijimą, AGS ląstelės buvo pasėjamos atskirų gręžinių 6 šulinėlių kultūros plokštės. Kai ląstelės pasiekė susiliejantį būklę, ląstelių sluoksnių buvo sužeisti su plastiko mikropipetė patarimas turintys didelę angą. Vidutinės ir nuolaužos buvo pripūtimo toli ir pakeičiamas 2,5 ml šviežio serumo neturinčioje terpėje, kuriame išdėstyti skirtingų koncentracijų TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). Ląstelės buvo fotografuotas kas 12 h po sužeidė fazinio kontrasto mikroskopu. Vertinimo "žaizdų uždarymui," Penki atsitiktinai atrinktų taškai išilgai kiekvienos žaizdos buvo pažymėtos ir horizontalus atstumas migruojančių ląsteles nuo pradinio žaizdos buvo matuojamas. Duomenys buvo pranešta kaip vidurkis ± SD.
Transwell migracija ir invazija tyrimas
apdoroti arba neapdoroti kontrolės ląstelės buvo pasėjamos trimis egzemplioriais į aukštutinį kambarį su Transwell Intarpas (Corning, Niujorkas, NY, JAV) serumo vidutinio esant 1 × 10 5 proc tankio pat. Migracijos tyrimų, terpę, turinčią 5% serumo buvo dedamas į apatinę kamerą veikti kaip chemoattractant, ir ląstelės buvo toliau inkubuojami už 18 h. Nonmigratory ląstelės buvo pašalinimas iš viršutinio kameroje grandymo, ir ląstelės, likusios ant apatinės paviršiaus intarpo buvo dažomi 0,1% metilvioletinio 15 minučių. Ląstelės buvo skaičiuojami po mikroskopu. Invazija tyrimai buvo padaryta kaip aprašyta pirmiau migracijos tyrimus, išskyrus įdėklai buvo precoated su tarpląsteliniame (ECM) pakaitalas Matrigel (BD biomokslai) ir inkubuojama per 24 h laikotarpiu. Kiekvienas klonas buvo padengtas trimis egzemplioriais Kiekvieno eksperimento metu ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent tris kartus. Ląstelių migraciją (arba invazija) gebėjimas = (mobilųjį skaičius gydytų pacientų grupėje /ląstelių skaičius kontrolinėje grupėje) × 100%.
Pastabos
Tie-Li Peng, Jie Chen prisidėjo vienodai prie šio darbo.
deklaracijos
Padėka
šis darbas parėmė šias dotacijas: dotacijos iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 30670949, Nr 30671904 ir No.30871145), yra sudaryta su nauju mokytoju iš Kinijos ministerijos dotacijos Švietimas (No.20070558288) A apdovanotas doktorantūros vadovu iš Kinijos švietimo ministerija (Nr 20060558010), dotacijų iš natūralių mokslo fondo Guangdong provincijoje (No.5300767 ir No.7001641) išmoka.
Autorių originalus pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalių pateiktų failų vaizdų. 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff Autorių originalus failas 1 pav 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Autorių originalaus failo 2 pav 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Autorių originalios 3 pav 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Autorių originalaus failo 4 paveiksle

• Sąlyginis išlikimo analizė Korėjos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu, kuriems atliekama gydomoji pašalintas skrandis
• Galimybių tvirtesnio atsigavimo po operacijos skrandžio operacijos: retrospektyvus tyrimas