Arylhydrocarbonrezeptor Stoffwechselwegaktivierung Invasivität Magenkrebszellen erhöht wahrscheinlich durch eine c-Jun-abhängige Induktion von Matrix-Metalloproteinase-9

Arylhydrocarbonrezeptor Stoffwechselwegaktivierung verbessert Magenkrebszellen Invasivität wahrscheinlich durch eine c-Jun-abhängige Induktion von Matrix-Metalloproteinase-9
Abberant Arylhydrocarbonrezeptor (AHR) Expression und AhR Stoffwechselwegaktivierung> Abstrakt Was sind in Magen-Krebsentstehung beteiligt sind. Jedoch ist die Beziehung zwischen AhR Signalweg-Aktivierung und Magenkrebsprogression noch unklar. In dieser Studie verwendeten wir 2,3,7,8-Tetrachlor-p-dioxin (TCDD), ein klassisches und potenteste Ligand von AhR, AhR-Signalweg aktiviert und die Wirkung von AhR Signalweg-Aktivierung auf die menschliche Magenkrebs AGS Zelle untersucht Invasion und erkundeten die entsprechenden Mechanismus.
Ergebnis einschränken können, um festzustellen, ob AhR Weg in AGS-Zellen aktiviert werden, untersuchten wir die Expression von CYP1A1, ein klassisches Ziel-Gen von AhR Weg nach TCDD-Exposition. RT-PCR und Western-Blot-Analyse zeigte, dass sowohl CYP1A1 mRNA und Proteinexpression in einer dosisabhängigen Weise erhöht wurden nach TCDD Behandlung und AhR-Antagonist Resveratrol (RSV) konnte dieses TCDD-induzierte CYP1A1 Expression kehren. Um zu bestimmen, ob TCDD Behandlung von AGS-Zellen führt zu einer Induktion von MMP-9 Expression wir MMP-9-mRNA unter Verwendung von RT-PCR detektiert und erkannt MMP-9 enzymatische Aktivität Gelatine-Zymographie unter Verwendung. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl MMP-9-mRNA-Expression und die enzymatische Aktivität wurden nach und nach in Medien mit der Konzentrationserhöhung von TCDD erhöhte und diese Veränderungen können durch RSV Behandlung in einer dosisabhängigen Art und Weise umgekehrt werden. Um zu untersuchen, ob AhR Aktivierung induzierte MMP-9-Expression und Aktivität in AGS-Zellen führt zu einer erhöhten Migration und Invasion führten wir Wundmigrationstest Heilung und Transwell Migration und Invasion Assay. Nach TCDD Behandlung wurden die Migrationsdistanz und die Migration und Invasion Fähigkeiten der AGS-Zellen mit einer dosisabhängigen Weise erhöht. Um zu demonstrieren, wird AhR Aktivierung induzierte MMP-9-Expression vermittelt durch c-Jun wurde siRNA Transfektion c-Jun-mRNA in AGS-Zellen zum Schweigen zu bringen. Die Ergebnisse zeigten, dass MMP-9-mRNA-Expression und Aktivität in unbehandelten Kontroll AGS-Zellen waren sehr schwach; Nach TCDD (10 nmol /L) Behandlung, MMP-9-mRNA-Expression und Aktivität waren signifikant erhöht; Diese TCDD-induzierte MMP-9-Expression und Aktivitätssteigerung konnte durch c-Jun siRNA-Transfektion abgeschafft werden.
Fazit
AhR Stoffwechselwegaktivierung Magenkrebszelle Invasivität wahrscheinlich durch eine c-Jun-abhängige Induktion von MMP-9 erhöht. Unsere Ergebnisse geben einen Einblick in den Mechanismus und die Funktion des AhR Weg und seine Auswirkungen auf die Magenkrebsprogression.
Hintergrund
Arylhydrocarbonrezeptor (AHR) ist ein Ligand-aktivierte Transkriptionsfaktor der basischen Helix-Loop-Helix /per-Arnt-Sim-Familie. In Abwesenheit von Liganden ist AhR im Cytosol in Form eines Komplexes mit zwei Chaperon Hsp90s eine Smal-Protein (p23), und ein Immunophilin-ähnliches Protein (XAP2) [1, 2]. Bei der Ligand wie 2,3,7,8-Tetrachlor-p-dioxin (TCDD, das stärkste und klassischen exogenen AhR Ligand) bindet, die Chaperon-Proteine ​​distanzieren und AhR in den Zellkern transloziert ein Heterodimer mit seinem Partner Molekül Aryl- zu bilden Kohlenwasserstoff-Rezeptor nuklearen Translokator (ARNT) [3, 4]. Dieses Heterodimer bindet an die spezifischen DNA-Region bezeichnet dioxin-Response-Element (DRE), die eine Kernsequenz von 5'-TNGCGTG-3 aufweist ", und aktiviert dadurch eine Batterie von Gene expression [5-7].
Historisch Studien von AhR Weg haben sich auf die Transkriptionsregulation von Genen, die für xenobiotic metabolisierenden Enzyme wie Cytochrom-P450-Enzyme [8] konzentriert. Jüngste Studien zeigten eine enge Beziehung zwischen Ahr und Brustdrüse tumorigenesis [7, 9]. AhR-Gen-Polymorphismen wurden mit einem erhöhten Risiko von Lungen- und Brustkrebs verbunden [10, 11]. Erhöhte Expression von AhR wurde in Lungen-, Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs beim Menschen [7, 12, 13] berichtet. Studien deuten darauf hin, dass auch konstitutiv aktive AhR Hepatokarzinogenese bei Mäusen fördern kann [14]. Diese Daten zeigten eine enge Beziehung zwischen Ahr und tumorigenesis. Jedoch ist die Beziehung zwischen AhR und Tumorprogression nicht klar.
Tumorzellen-Invasion und Metastasierung ein komplizierter Prozess ist, bei der ein Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) und die Basalmembran ein wesentlicher Schritt ist. Tumorinvasion und Metastasierung beruht auf der Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs), um die ECM und Keller zu zerstören Membranzellmigration zu erlauben. MMPs sind eine Gruppe von Zink-abhängigen Metallopeptidasen [15-17]. Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) ist eine der Typ-IV-Kollagenase /Gelatinasen, die Keller degradieren Membran Kollagenen und Gelatinen [16]. MMP-9 ist allgemein mit der Tumorinvasion und Metastasierung assoziiert [17]. Die Synthese von MMP-9 durch mehrere Wachstumsfaktoren, Cytokine und Hormone reguliert [16, 18]. Aktuelle Studie verknüpft TCDD-assoziierten Läsionen, die mit anomalen Matrix Stoffwechsel [8]. Mikroarray-Daten zeigen, daß TCDD /AhR verändern Expression von Genen in Matrixmetabolismus und Ablagerung beinhalten [8]. Villano et al [19] und Haque et al [18] berichteten, dass AhR-Agonist TCDD konnte MMP-9-Expression in huamn Melanomzellen und Prostatakrebszellen induzieren. Diese Studien legen nahe, dass die MMP-9-Expression einen gemeinsamen Endpunkt für die Aktivierung des AhR Weg sein kann [8, 19].
Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt [20]. Magenkrebszellen Invasion und Metastasierung führen oft zu einer schlechten Prognose. Mehrere Studien AhR Signalweg-Aktivierung zu Magen-Krebsentstehung verbunden. Chen et al in zwei menschlichen Magenkrebszelllinien (RF1 und RF48) von Microarray-Analyse [21] Expression von AhR erhöht. et al Ma berichtet, dass die gleichzeitige Expression von AhR und CYP1A1 mit Magenkrebs Entwicklung korreliert ist [22]. Andersson et al fanden heraus, dass konstitutiv aktivierte AhR Magentumoren in einem transgenen Mausmodell induzieren konnten [23]. In einem anderen unserer Studien haben wir festgestellt, dass AhR-Expression und nukleäre Translokation höher bei Magenkrebs signifikant waren als in Präkanzerosen und normale Magenschleimhaut [24]. Jedoch ist die Beziehung zwischen AhR Signalweg-Aktivierung und Magenkrebsinvasion und Metastasierung noch nicht klar. Daher untersuchten wir die Wirkung von AhR Signalweg-Aktivierung auf die menschliche Magenkrebszellen. Unsere hier präsentierten Daten zeigen, dass AhR Signalweg kann bei Magenkrebs AGS-Zellen und AhR Signalweg-Aktivierung in AGS-Zellen induziert-MMP 9-Expression und verbessert die Migration und Invasion Aktivität AGS-Zellen aktiviert werden. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass diese AhR Aktivierung induzierte MMP-9-Expression von c-Jun vermittelt wird.
Ergebnisse und Diskussion
AhR Signalweg-Aktivierung in AGS-Zellen
In einem anderen unserer Studien haben wir gezeigt, dass es war ein hohes Maß an AhR-Expression in AGS-Zellen [24]. Um zu bestimmen, ob können AhR Signalweg in dieser Zelllinie aktiviert werden, untersuchten wir die Expression von Cytochrom P-450 1A1 (CYP1A1), ein klassisches Ziel-Gen von AhR Weg nach AhR-Agonisten TCDD-Exposition. RT-PCR und Western-Blot-Analyse zeigte, dass sowohl CYP1A1 mRNA (Fig. 1A) und Protein (Fig. 1B) expression in AGS-Zellen wurden in einer dosisabhängigen Weise erhöht Behandlung nach TCDD. Um festzustellen, ob diese TCDD-induzierte CYP1A1-Expression ist AhR-abhängige, AhR-Antagonist Resveratrol (RSV) wurde verwendet, um Block AhR Weg. Wie in gezeigt. 1C und 1D, RSV könnte TCDD-induzierte CYP1A1 Expression in einer dosisabhängigen Art und Weise umzukehren. Diese Daten zeigten, dass AhR Weg in AGS-Zellen durch TCDD aktiviert werden. Abbildung 1 AhR-Agonisten TCDD und AhR-Antagonist RSV reguliert CYP1A11 Expression in AGS-Zellen. Nach verschiedenen Konzentrationen (wie oben gezeigt) von TCDD Behandlung für 24 Stunden, (A) RT-PCR-Analyse von CYP1A1 mRNA-Expression in einer Konzentrations-Wirkungs. (B) Western-Blot-Analyse von CYP1A1 Proteinexpression in einer Konzentrations-Wirkungs. Nach der Co-Behandlung mit TCDD (1 nM) und RSV für 24 Stunden (bei verschiedenen Konzentrationen, wie oben gezeigt), (C) mRNA-Expression von CYP1A1 durch RT-PCR nachgewiesen wurde. (D) Die Proteinexpression von CYP1A1 wurde durch Western-Blot nachgewiesen.
AhR Signalweg-Aktivierung in AGS-Zellen induzieren MMP-9-Expression
Frühere Studien haben gezeigt, dass in mehreren Krebszellen, AhR-Agonisten TCDD Exposition aktiviert die Genexpression MMP-9 [18, 19]. Um zu bestimmen, ob TCDD Behandlung von AGS-Zellen führt zu einer Induktion von MMP-9 Expression wir MMP-9-mRNA unter Verwendung von RT-PCR folgenden TCDD Exposition nachgewiesen. Wie in Abb. 2A, MMP-9-mRNA-Expression wurde in einer dosisabhängigen Weise nach TCDD-Behandlung induziert. Um die Rolle des AhR-Weg bei der Vermittlung TCDD-induzierte MMP-9-Expression in AGS-Zellen zu untersuchen, wurden Kulturen co behandelt mit TCDD und die AhR-Antagonisten Resveratrol. Co-Behandlung mit Resveratrol abgeschafft TCDD-induzierte MMP-9-Expression (Abb. 2C) zeigten, daß TCDD-Aktivierung von MMP-9-Expression ist abhängig vom AhR Stoffwechselweg. Oberhalb Daten zeigen, dass AhR Signalweg-Aktivierung in AGS-Zellen induziert MMP-9-mRNA-Expression. In den meisten Zelltypen ist die Gentranskription von MMP-9 induzierbare und nach der Übersetzung wird das Enzym sofort abgesondert und durch den Cystein-Schaltmechanismus aktiviert [25]. Um festzustellen, ob diese Veränderungen in der Genexpression folgenden AhR Signalweg-Aktivierung führen zu Veränderungen in der MMP-9 enzymatische Aktivität wir Gelatine-Zymographie durchgeführt wird. Die Ergebnisse zeigten, dass MMP-9-Aktivität in Medien allmählich mit der Konzentrationserhöhung von TCDD in Medien (Fig. 2B), und diese Veränderungen erhöht könnte durch Resveratrol Behandlung in einer dosisabhängigen Weise (Fig. 2D) umgekehrt werden. Diese Daten zeigen, dass AhR Signalweg-Aktivierung induzierte Zunahme der MMP-9-Expression korreliert mit einer Zunahme der MMP-9 Aktivität. Abbildung 2 AhR-Agonisten TCDD und AhR-Antagonist RSV reguliert MMP-9-Expression und Aktivität in AGS-Zellen. Nach verschiedenen Konzentrationen (wie oben gezeigt) von TCDD Behandlung für 24 Stunden, (A) RT-PCR-Analyse der MMP-9-mRNA-Expression in einer Konzentrations-Wirkungs. (B) Gelatine-Zymographie Analyse der MMP-9-Protein-Aktivität in einer konzentrationsAntwort. Nach der Co-Behandlung mit TCDD (1 nM) und RSV für 24 Stunden (bei verschiedenen Konzentrationen, wie oben gezeigt), (C) mRNA-Expression von MMP-9 durch RT-PCR nachgewiesen wurde. (D) Protein-Aktivität von MMP-9 durch Zymographie Gelatine nachgewiesen wurde.
AhR Signalweg-Aktivierung AGS Zellen verstärkt Migration und Invasion
MMP-9 ist eine der Typ-IV-Kollagenase /Gelatinasen, die ECM-Komponenten abbauen kann. MMP-9 ist allgemein mit der Tumorinvasion und Metastasierung assoziiert [17]. Studien haben eine signifikante Korrelation zwischen MMP-9 Expression und Invasivität und Lymphknotenmetastase Magenkarzinomen [26-28] gezeigt. Um zu untersuchen, ob AhR Aktivierung induzierte MMP-9-Expression und Aktivität in AGS-Zellen führt zu einer erhöhten Migration und Invasion führten wir Wundmigrationstest Heilung und Transwell Migration und Invasion Assay. Nach TCDD Behandlung wurde die Migrationsdistanz von AGS-Zellen signifikant mit einer dosisabhängigen Weise erhöht, wenn sie mit Kontrollzellen verglichen (P < 0,01) (Fig. 3A). Transwell-Ergebnisse zeigten eine deutliche Steigerung der Migration (Fig. 3b) und Invasion (Fig. 3C) Fähigkeiten der AGS-Zellen, wenn die Zellen mit TCDD inkubiert wurden in Konzentrationen von 0,1 nmol /L (P < 0,01) bis 100 nmol /l ( p < 0,01). keinen signifikanten Effekt auf die Migration und Invasion wurde bei TCDD-Konzentration <gefunden; 0,1 nmol /l (p > 0,05). Diese Ergebnisse zeigten, dass AhR Stoffwechselwegaktivierung Magenkrebs AGS-Zellen Migration und Invasion verbessert. Abbau von ECM und Basalmembran ein wesentlicher Schritt bei der Tumorinvasion und Metastasierung. Es geht um die Wirkung von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Unsere Studie zeigte, dass AhR Stoffwechselwegaktivierung MMP-9-Expression und enzymatische Aktivität induzieren könnte, und AGS-Zellen Migration und Invasion zu fördern. Andere Studien wiesen darauf hin, dass AhR Stoffwechselwegaktivierung eine Vielzahl von MMPs Expression induzieren könnte [19, 29]. AhR Signalweg-Aktivierung erhöht Magenkrebs AGS-Zellen Migration und Invasion kann auch neben MMP-9-Expression durch andere MMPs Ausdruck sein. Abbildung 3 Die Wirkung von AhR-Agonisten TCDD auf AGS-Zellen Migration und Invasion. (A) Wundheilungsmigrationstest. (B) Transwell-Migrationstest. (C) Transwell-Invasionstest.
C-Jun vermittelten MMP-9-Expression von AhR Stoffwechselwegaktivierung
Der Mechanismus der TCDD-induzierte Veränderungen der MMP-9-Expression induziert wird, ist nicht ganz klar. Jüngste Studien berichtet, dass TCDD kann c-Jun-Expression [30, 31] und c-Jun ist ein Zielgen von AhR Weg [8] induzieren; die Promotorsequenz in der 5'-flankierenden Region des humanen MMP-9-Gen enthält, c-Jun-Bindungsstellen [16] und c-Jun induzierte MMP-9-Expression [32]; die Transkriptionsaktivität von c-Jun ist signifikant verbessert bei Magenkrebs [33]. Basierend auf diesen Studienergebnissen haben wir vorgeschlagen, eine Hypothese, dass TCDD-induzierte MMP-9-Expression in AGS-Zellen durch c-Jun vermittelt wird. Um diese Hypothese zu beweisen, entdeckten wir zuerst das c-Jun-Expression in AGS-Zellen nach TCDD Behandlung und festgestellt, dass sowohl c-Jun-mRNA (Fig. 4A und 4C) und Protein (Fig. 4B und 4D) expression in AGS-Zellen wurden erhöhte in einer Dosis (Abb. 4A und 4B) und der Zeit (Fig. 4C und 4D) abhängigen Weise folgende TCDD Behandlung und dieses TCDD-induzierte c-Jun-Expression könnte durch AhR-Antagonist Resveratrol (Fig. 4E und 4F) reserviert werden. Oberhalb Daten zeigten, dass c-Jun ein Zielgen von AhR Signalweg in AGS-Zellen ist. Um die zeigen, c-Jun kann TCDD-induzierte MMP-9-Expression, siRNA-Transfektion vermitteln wurde durchgeführt, c-Jun-mRNA in AGS-Zellen zum Schweigen zu bringen. Die Ergebnisse zeigten, dass c-Jun siRNA (Endkonzentration 50 nmol /L) Transfektion fast vollständig c-Jun-Expression in AGS-Zellen abgeschafft sowohl in mRNA-Ebene (Abb. 4G) und in Protein-Ebene (Abb. 4H). Daher nach c-Jun siRNA-Transfektion für 48 Stunden wurden AGS-Zellen für 24 Stunden mit TCDD bei Konzentration 10 nmol /L behandelt, Zellpellet und Kulturmedien wurden gesammelt und MMP-9-mRNA-Expression und die Aktivität gemessen. Wie in Abb. 4E und 4J, MMP-9-mRNA-Expression und Aktivität in unbehandelten Kontroll AGS-Zellen waren sehr schwach; Nach TCDD (10 nmol /L) Behandlung, MMP-9-mRNA-Expression und Aktivität waren signifikant erhöht; Diese TCDD-induzierte MMP-9-Expression und Aktivitätssteigerung konnte durch c-Jun siRNA-Transfektion abgeschafft werden und nicht durch Kontroll-siRNA-Transfektion beeinflusst werden. Oberhalb Daten zeigten, dass c-Jun MMP-9-Expression von AhR Signalweg-Aktivierung in AGS-Zellen induziert vermittelt. Abbildung 4 c-Jun vermittelt TCDD-induzierte MMP-9-Expression und Aktivität. (A) TCDD induziert c-Jun-mRNA-Expression in einer Dosis-abhängigen Weise. (B) TCDD induziert c-Jun-Protein-Expression in einer Dosis-abhängigen Weise. (C) TCDD induziert c-Jun-mRNA-Expression in einer zeitabhängigen Weise. (D) TCDD induziert c-Jun-Protein-Expression in einer zeitabhängigen Weise. (E) RSV kehrt TCDD-induzierte c-Jun-mRNA-Expression. (F) RSV kehrt TCDD-induzierte c-Jun-Protein-Expression. (G) c-Jun siRNA zum Schweigen bringt c-Jun-mRNA-Expression. (H) c-Jun siRNA zum Schweigen bringt c-Jun-Protein-Expression. (I) c-Jun siRNA hemmt TCDD-induzierte MMP-9-mRNA-Expression. (J) c-Jun siRNA hemmt TCDD-induzierte MMP-9-Aktivität zu erhöhen.
Fazit
Im Ergebnis der vorliegenden Studie zeigen, dass AhR Signalweg kann bei Magenkrebs AGS-Zellen und AhR Signalweg-Aktivierung induziert-MMP 9 aktiviert werden Expression und Aktivität, die AGS Migration und Invasion in vitro trägt letztlich zu. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass diese AhR Aktivierung induzierte MMP-9-Expression von c-Jun vermittelt wird. Da Abbau von ECM und Basalmembran ein wesentlicher Schritt bei der Tumorinvasion und Metastasierung ist unsere Ergebnisse Einblick in den Mechanismus zur Verfügung stellen und die Funktion des AhR Weg und ihre Auswirkungen auf diese Prozesse während der Magenkrebs Progression.
Methoden
Zellkultur
Magenkrebszelllinie AGS wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) erhalten und wurde in RPMI 1640-Medium (Hyclone) ergänzt mit 2 mM Glutamin, 10% fötalem Rinderserum (Hyclone) gehalten, 100 Einheiten /ml Penicillin und 100 ug /ml Gentamycin. Zellumgebung wurde bei 5% CO 2 und 37 ° C gehalten. Die Zellen wurden aus der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und Gesamt-RNA und Protein wurden wie unten beschrieben hergestellt.
Behandlung von Zellen
TCDD und Resveratrol wurden von Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA) gekauft. Nach Inkubation für 24 Stunden wurden die Zellen mit TCDD bei verschiedenen Konzentrationen behandelt (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) oder TCDD (1 nM) und Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 &mgr; M) für 24 Stunden oder mit TCDD (1 nM) für verschiedene Zeit behandelt (0, 1, 6, 24, 48, 72 Stunden) auf. Alle Arzneimittel wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Kontrollzellen erhielten 0,1% DMSO nur.
RNA-Synthese Small interfering
Small interfering RNAs (siRNAs) synthetisiert und High-Performance-gereinigt (Ribo Biotechnologie, Guangzhou). c-Jun siRNAs (sense, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; Antisense-, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) und Steuerungs siRNAs (sense, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; Antisense-, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), keine Homologie mit irgendwelchen bekannten menschlichen Genen tragen, wurden in RNase-freiem ddH gelöst 2 O auf eine Endkonzentration von 20 &mgr; mol /L.
Kleine RNA Transfektion interferierenden
Zellen (5 × 10 5) wurden auf Vertiefungen von sechs-Well-Zellkulturplatten ausplattiert und man ließ sie anhaften 24 Stunden. Vier Mikroliter Lipofectamine2000 (Invitrogen) pro Vertiefung wurden in serumfreien Opti MEM (Invitrogen) für eine endgültige Komplexierungsmittel Volumen von 250 &mgr; l, vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Fünf Mikroliter der siRNA-Lösung pro Well wurden mit 250 &mgr; l Serum-freiem Opti MEM verdünnt. Mischen Sie die verdünnte siRNA-Lösung und die verdünnte Lipofectamine2000 sanft, und bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Lipofectamine2000 /siRNA-Komplex wurde in die Vertiefungen gegeben, die 1500 &mgr; l RPMI 1640 mit 10% FBS und in normalen Zellkulturbedingungen inkubiert. Alle der Assays wurden nach 48 Stunden.
RNA-Isolierung und RT-PCR
Gesamt-RNA von Zellen durchgeführt wurde unter Verwendung des Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) gemß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. cDNA wurde mit 1 &mgr; g Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, ReverTra ACETM (Toyobo Co, Osaka, Japan) unter folgenden Bedingungen synthetisiert: 30 ° C für 10 min, 42 ° C für 20 min, 99 ° C für 5 min und 4 ° C für 5 min. PCR von cDNA wurde in einem Reaktionsgemisch (30 ul), enthaltend 2 &mgr; l Matrizen-cDNA, 2,5 mM MgCl 2 durchgeführt, 200 uM dNTPs, 0,3 &mgr; M Primer 1 und 2 und 1 Einheit Taq DNA-Polymerase (New England Biolabs). Amplifikation wurde unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt: 94 ° C für 5 min, gefolgt von 25-32 Zyklen (45 s für 30 s, und erstrecken sich denaturieren für 30 s bei 72 ° C bei 94 ° C, Glühen), und dann 72 ° C für 7 min. Die Einzelheiten von Primern, Glühtemperatur, Amplifikationszyklen und PCR Produktgröße für jedes Gen in der Tabelle aufgelistet sind 1. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5% Agarosegel, gefärbt mit Ethidiumbromid, sichtbar gemacht und mit einer Ultraviolett- (UV) elektrophoretisiert Durchleuchtungs. Bandenintensitäten in RT-PCR wurden unter Verwendung quantifiziert Quantity One Abbildungsanalysesoftware. Bandenintensitäten von CYP 1A1, MMP-9 und C-Jun-mRNA wurden mit entsprechenden Bandenintensitäten von beta-Aktin normalisiert. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD.Table 1 Primersequenzen und PCR-Amplifikation Bedingungen berichtet
Gene
Primer (5 '→ 3')
Glühtemperatur (° C)
Cycles
Produktgröße (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta-Actin
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Abkürzungen: S, Sense-Primer; A, Antisense-Primer
Western blot analysis
Zellpellets wurden in einem Lysepuffer, enthaltend 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 50 mM β-Glycerophosphat, 2 mM Natriumorthovanadat, 10% Glycerol, 1% Triton X- homogenisiert 100, 1 mM DTT und 1 × Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Deutschland). Lysat wurde bei 13000 rpm und 4 oC während 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde die gesamte Zell-Lysat. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kits (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) gemessen. Dreißig Mikrogramm Protein wurden pro Spur geladen, durch 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und auf äquilibriert Polyvinylidendifluorid-Membran transferiert durch Elektroblotting. Die Membranen wurden blockiert mit TBS-T-Puffer mit 5% (w /v) fettfreie Trockenmilch. AhR, CYP1A1, c-Jun und Beta-Actin 2 Stunden nachgewiesen wurden Antikörper gegen AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, Arbeitsverdünnung 1: 150) unter Verwendung von CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, Arbeitsverdünnung 1: 500) , c-Jun (SC-

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