Aryl Kuelewaasserstoff receptor Passerelle Aktivéierung verbessert gastric Kriibs Zell invasiveness wahrscheinlech duerch e c-Jun-ofhängeg Aféierungs- vun Matrixentgasung metalloproteinase-9

Aryl Kuelewaasserstoff receptor Passerelle Aktivéierung verbessert gastric Kriibs Zell invasiveness wahrscheinlech duerch e c-Jun-ofhängeg Aféierungs- vun Matrixentgasung metalloproteinase-9 VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Abberant aryl Kuelewaasserstoff receptor (Ahr) Ausdrock an Aktivéierung Ahr Passerelle implizéieren an gastric carcinogenesis. Mä, ass d'Relatioun tëscht Ahr Passerelle Aktivéierung an gastric Kriibs Werdegang nach onkloer. Am Moment studéieren, déi mir 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-Para-dioxin (TCDD), eng klassesch a mächtegst ligand vun Ahr, Ahr Passerelle ze aktivéieren an den Effet vun Ahr Passerelle Aktivéierung op mënschlech gastric Kriibs AGS Zell propagéieren Invasioun an lant de jeeweilegen Mechanismus. VerfÜgung Resultater VerfÜgung kann fir erauszefannen, ob Ahr Passerelle an AGS Zellen ageschalt ginn, iwwerpréift mir den Ausdrock vun CYP1A1, eng klassesch Zil- Gentherapie vun Ahr Passerelle, folgende TCDD aussetzt. RT-Hinnen alleguer a westlech blot Analyse gewisen, datt béid CYP1A1 mRNA an FAQ Ausdrock vun enger Portioun-ofhängeg Manéier eropzesetzen folgenden TCDD Behandlung an Ahr neien resveratrol (Island) konnt dësen TCDD-entschlof CYP1A1 Ausdrock ëmgedréint. Fir erauszefannen, ob TCDD Behandlung vun AGS Zellen Resultater an en Aféierungs- vun MMP-9 Ausdrock, mir MMP-9 mRNA benotzt RT-Hinnen alleguer festgestallt a Réckstänn MMP-9 enzymatic Aktivitéit gelatin zymography benotzt. D'Resultater weisen, dass souwuel MMP-9 mRNA Ausdrock an enzymatic Aktivitéit sech lues a lues an de Medien mat der Konzentratioun Erhéijung vun TCDD fräi an dësen Ännerungen kéint vun Island Behandlung an enger Portioun-ofhängeg Manéier réckgängeg gemaach ginn. Ze iwwerpréifen, ob Ahr Aktivéierung-entschlof MMP-9 Ausdrock an Aktivitéit zu AGS Zellen Resultater am fräi Wanderung an Invasioun, standing mir Meter Migratioun assay Heelung a transwell Wanderung an Invasioun assay. No TCDD Behandlung, goufen d'Migratioun Distanz an der Migratioun an Invasioun Fähegkeeten vun AGS Zellen mat enger Portioun-ofhängeg Manéier fräi. Ze beweisen ass Ahr Aktivéierung-entschlof MMP-9 Ausdrock mediated vun c-Jun, war siRNA transfection standing c-Jun mRNA zu AGS Zellen a Rou. D'Resultater weisen, datt MMP-9 mRNA Ausdrock an Aktivitéit an onbehandelt Kontroll AGS Zellen sech ganz schwaach; No TCDD (10 nmol /L) Behandlung, MMP-9 mRNA Ausdrock an Aktivitéit huet bedeitend fräi; Dëst TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock an Aktivitéit Erhéijung konnt vun c-Jun siRNA transfection ofgeschaf ginn. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung Ahr Passerelle Aktivéierung gastric Kriibs Zell invasiveness wahrscheinlech duerch e c-Jun-ofhängeg Aféierungs- vun MMP-9 verbessert. Eis Resultater déi Asiicht an de rechtlechen a Funktioun vun der Ahr Passerelle a sengen Auswierkungen op gastric Kriibs Werdegang. VerfÜgung Background VerfÜgung Aryl Kuelewaasserstoff receptor (Ahr) ass eng ligand-ageschalt Transkriptiouns Faktor vun der Basis Wendel-Glück-Wendel /Per-Arnt-Sim Famill. An d'Flichte vun ligand, ass Ahr an der Zytosol an der Form vun engem Komplex mat zwee chaperone Hsp90s, engem SMAL FAQ (p23), an eng immunophilin-wëll FAQ (XAP2) [1, 2]. Beim ligand wéi 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-Para-dioxin (TCDD, déi mächtegst a klassescher exogenous Ahr ligand) obligatoresch, de chaperon Proteinen dissociate an Ahr an den helle translocate engem heterodimer mat senge Partner Protein aryl zu Form Kuelewaasserstoff receptor nuklear translocator (Arnt) [3, 4]. Dëst heterodimer Photo'en zu de spezifesche DNA Regioun als dioxin Äntwert Element (Dre), déi engem Kär Haaptrei vun 5'-TNGCGTG-3 huet ", an activéiert doduerch eng Batterie vun Genen Ausdrock [5-7]. VerfÜgung historeschen, Studien vun Ahr Passerelle hunn op der transcriptional Regulatioun vun Genen Zeechesaatz xenobiotic metabolizing Enzymen wéi cytochrome P450 Enzymen [8] konzentréiert. Rezent Studien bewisen eng enk Relatioun tëscht Ahr an mammary drüs tumorigenesis [7, 9]. Ahr Gentherapie schiefgang gewiescht fir eng fräi Risiko vun haett an Broscht Cancers Hausnummeren [10, 11]. Fräi Meenungsäusserung vun Ahr gouf zu haett, Broscht, an pancreatic Cancers zu Mënschen [7, 12, 13] gemellt. Studien proposéieren och, datt constitutively aktiv Ahr hepatocarcinogenesis zu Mais Promotioun kënnen [14]. Dës Donnéeë uginn eng enk Relatioun tëscht Ahr an tumorigenesis. Mä, ass d'Relatioun tëscht Ahr an entholl Werdegang net kloer. VerfÜgung entholl Zellen Invasioun an Metastasen e komplizéierte Prozess ass ënnert deem ofgeschnidden vun extracellular Matrixentgasung (ECM) an Keller Membran engem entscheedende Schrëtt ass. Entholl Invasioun an Metastasen berout op der Ausdrock vun Matrixentgasung metalloproteinases (MMPs) d'ECM a Keller ze zerstéieren Membran Zell Migratioun ze erlaben. MMPs sinn e Grupp vun Zénk ofhängeg metallopeptidases [15-17]. MATRIX metalloproteinase-9 (MMP-9) ass eent vun den Typ IV collagenase /gelatinases, déi Keller dauert Membran collagens an gelatins [16]. MMP-9 ass verbreet mat entholl Invasioun an Metastasen verbonne [17]. D'Synthes vun MMP-9 ass duerch verschidden Wuesstem Faktoren, cytokines a liicht reegelen [16, 18]. Rezent Etude Hausnummeren TCDD-verbonne lesions mat aberrant Matrixentgasung ukuerbelt [8]. Microarray Donnéeën déi beweisen datt TCDD /Ahr ofzeänneren Ausdrock vun Genen vun Matrixentgasung ukuerbelt an Oflagerung abannen [8]. Villano et al [19] an HAQUE et al [18] gemellt dass Ahr agonist TCDD konnt MMP-9 Ausdrock vun huamn melanoma Zellen an Aarbecht Kriibs Zellen induce. Dës Studie weist datt den MMP-9 Ausdrock eng gemeinsam Endpunkt fir Aktivatioun vun der Ahr Passerelle kann [8, 19]. VerfÜgung Gastric Kriibs ass déi véiert stäerkste gemeinsam malignancy an der zweeter heefegsten Ursaach vum Kriibs-Zesummenhang Doud vun der Welt [20]. Gastric Kriibs Zellen Invasioun an Metastasen An oft op aarmséileg hätt. Puer Studien Ahr Passerelle Aktivéierung zu gastric carcinogenesis verbonnen. Chen et al fonnt an zwee Mënsch gastric Kriibs Zell Linnen (RF1 an RF48) vun microarray Analyse [21] Ausdrock vun Ahr fräi. et al ma gemellt dass concurrent Ausdrock vun Ahr an CYP1A1 mat gastric Kriibs Entwécklung soll ass [22]. Andersson et al fonnt dass constitutively ageschalt Ahr Mo. erhéijen an engem transgenic Maus Modell induce kéint [23]. An anere vun eisen Studien, fonnt mir dass Ahr Ausdrock an nuklear br héich zu gastric Kriibs bedeitendst sech wéi an premalignant lesions an normal gastric mucosa [24]. Mä, ass d'Relatioun tëscht Ahr Passerelle Aktivéierung an gastric Kriibs Invasioun an Metastasen nach net kloer. Dofir, ze propagéieren mir den Effet vun Ahr Passerelle Aktivéierung op mënschlech gastric Kriibs Zellen. Eis Daten hei virgestallt bewisen, datt Ahr Passerelle kann zu gastric Kriibs AGS Zellen an Ahr Passerelle Aktivatioun vun AGS Zellen induces-MMP 9 Ausdrock a verbessert Wanderung an Invasioun Aktivitéit AGS Zellen ageschalt ginn. Ausserdeem, weisen eis Daten datt dës Ahr Aktivéierung-entschlof MMP-9 Ausdrock vun c-Jun mediated ass. VerfÜgung Resultater an Diskussioun VerfÜgung Ahr Passerelle Aktivatioun vun AGS Zellen VerfÜgung An anere vun eisen Studien hu mir bewisen, datt et war en héije Niveau vun Ahr Ausdrock vun AGS Zellen [24]. Fir erauszefannen, ob kann Ahr Passerelle an dëser Zell Linn ageschalt ginn, iwwerpréift mir den Ausdrock vun Cytochrome P-450 1A1 (CYP1A1), eng klassesch Zil- Gentherapie vun Ahr Passerelle, folgende Ahr agonist TCDD aussetzt. RT-Hinnen alleguer a westlech blot Analyse gewisen, datt béid CYP1A1 mRNA (Figebam. 1A) an FAQ (Figebam. 1B) Ausdrock vun AGS Zellen sech zu enger Portioun-ofhängeg Manéier fräi Behandlung folgenden TCDD. Fir erauszefannen, ob dëst TCDD-entschlof CYP1A1 Ausdrock ass Ahr-ofhängeg, Ahr neien resveratrol (Island) war benotzt ze blockéieren Ahr Passerelle. Als zu Lalumi gewisen. 1c an 1D, Island hätt TCDD-entschlof CYP1A1 Ausdrock vun enger Portioun-ofhängeg Manéier ëmgedréint. Dës Donnéeën bewisen, dass Ahr Passerelle kann zu AGS Zellen vun TCDD ageschalt ginn. Figur 1 Ahr agonist TCDD an Ahr neien Island reegelen CYP1A11 Ausdrock vun AGS Zellen. No verschiddene Konzentratioune (wéi uewen gewisen) vun TCDD Behandlung fir 24 Stonnen, (A) RT-Hinnen alleguer Analyse vun CYP1A1 mRNA Ausdrock vun enger Konzentratioun-Äntwert. (B) Western blot Analyse vun CYP1A1 FAQ Ausdrock vun enger Konzentratioun-Äntwert. Nodeems de Ko-Behandlung mat TCDD (1 nm) an Island fir 24 Stonnen (bei verschiddene Konzentratioune wéi uewe gewisen), (C) mRNA Ausdrock vun CYP1A1 vun RT-Hinnen alleguer festgestallt gouf. (D) Protein Ausdrock vun CYP1A1 war vun Western blot fonnt. VerfÜgung Ahr Passerelle Aktivatioun vun AGS Zellen induce MMP-9 Ausdrock VerfÜgung virdrun Studie gewisen hunn, datt an e puer Kriibs Zellen, Ahr agonist TCDD aussetzt activéiert Ausdrock Gentherapie MMP-9 [18, 19]. Fir ze bestëmmen, ob TCDD Behandlung vun AGS Zellen Resultater an en Aféierungs- vun MMP-9 Ausdrock, mir MMP-9 mRNA benotzt RT-Hinnen alleguer folgenden TCDD Belaaschtung festgestallt. Als zu Figebam gewisen. 2A, MMP-9 mRNA Ausdrock war an enger Portioun-ofhängeg Manéier folgenden TCDD Behandlung entschlof. Fir d'Roll vun der Ahr Passerelle an mediating TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock vun AGS Zellen iwwerpréifen, Kulturen sech Co-behandelt mat TCDD an der Ahr neien resveratrol. Co-Behandlung mat resveratrol ofgeschaf TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock (Figebam. 2C) bewisen, datt TCDD-Aktivatioun vun MMP-9 Ausdrock ass ofhängeg vun der Ahr Passerelle. Virun Donnéeën weg datt Ahr Passerelle Aktivatioun vun AGS Zellen induces MMP-9 mRNA Ausdrock. Am meeschte Zell Zorte, ass der Gentherapie Transkriptiouns vun MMP-9 inducible, an der Iwwersetzung ass d'Aktivitéit direkt secreted an duerch d'cysteine-Knäppche Mechanismus ageschalt [25]. Fir erauszefannen, ob dësen Ännerungen an der Gentherapie Ausdrock folgenden Ahr Passerelle Aktivéierung Resultat vun Ännerungen an MMP-9 enzymatic Aktivitéit, mir gelatin zymography gesuergt. D'Resultater weisen, datt MMP-9 Aktivitéit zu Medien no mat der Konzentratioun Erhéijung vun TCDD zu Medien (Figebam. 2B) an dësen Ännerungen fräi ass kéinten duerch resveratrol Behandlung an enger Portioun-ofhängeg Manéier (Figebam. 2D) opgehuewe ginn. Dës Donnéeë weisen datt Ahr Passerelle Aktivéierung-entschlof Erhéijung vun MMP-9 Ausdrock deemolegt Weltbild mat enger Erhéijung vun MMP-9 Aktivitéit. Figur 2 Ahr agonist TCDD an Ahr neien Island reegelen MMP-9 Ausdrock an Aktivitéit zu AGS Zellen. No verschiddene Konzentratioune (wéi uewen gewisen) vun TCDD Behandlung fir 24 Stonnen, (A) RT-Hinnen alleguer Analyse vun MMP-9 mRNA Ausdrock vun enger Konzentratioun-Äntwert. (B) gelatin zymography Analyse vun MMP-9 FAQ Aktivitéit zu enger Konzentratioun-Äntwert. Nodeems de Ko-Behandlung mat TCDD (1 nm) an Island fir 24 Stonnen (bei verschiddene Konzentratioune wéi uewe gewisen), (C) mRNA Ausdrock vun MMP-9 vun RT-Hinnen alleguer festgestallt gouf. (D) Protein Aktivitéit vun MMP-9 vun gelatin zymography festgestallt gouf. VerfÜgung Ahr Passerelle Aktivéierung AGS Zellen verbessert Wanderung an Invasioun VerfÜgung MMP-9 ass eent vun den Typ IV collagenase /gelatinases datt ECM Komponente dauert kann. MMP-9 ass verbreet mat entholl Invasioun an Metastasen verbonne [17]. Studien hunn e bedeitend Korrelatioun tëscht MMP-9 Ausdrock an invasiveness an lymph Node Metastasen vun gastric carcinomas [26-28] bewisen. Ze iwwerpréifen, ob Ahr Aktivéierung-entschlof MMP-9 Ausdrock an Aktivitéit zu AGS Zellen Resultater am fräi Wanderung an Invasioun, standing mir Meter Migratioun assay Heelung a transwell Wanderung an Invasioun assay. No TCDD Behandlung, war d'Migratioun Distanz vun AGS Zellen vill mat enger Portioun-ofhängeg Manéier fräi wéi mat Kontroll Zellen am Verglach (P &Si besteet; 0.01) (. Figebam 3A). Transwell Resultater awer e wesentleche Erhéijung vun Migratioun (Figebam 3B.) An Invasioun (Figebam 3C.) Fähegkeeten vun AGS Zellen wann d'Zellen mat TCDD incubated sech zu Konzentratioune vun 0,1 nmol /L (P &Si besteet; 0.01) bis 100 nmol /l ( p &Si besteet; 0.01). kee groussen Effet op d'Migratioun an Invasioun war um TCDD Konzentratioun &dra fonnt; 0,1 nmol /l (p > 0,05). Dës Resultater bewisen, dass Ahr Passerelle Aktivéierung gastric Kriibs AGS Zellen Wanderung an Invasioun verbessert. Ofgeschnidden vun ECM an Keller Membran ass e wesentleche Schrëtt zu entholl Invasioun an Metastasen. Et handelt der Aktioun vun Matrixentgasung metalloproteinases (MMPs). Eis Etude bewisen, dass Ahr Passerelle Aktivéierung MMP-9 Ausdrock an enzymatic Aktivitéit induce hätt, an AGS Zellen Wanderung an Invasioun förderen. Aner Studie uginn dass Ahr Passerelle Aktivéierung verschiddenste MMPs Ausdrock induce kéint [19, 29]. Ahr Passerelle Aktivéierung verbessert gastric Kriibs AGS Zellen Wanderung an Invasioun kann och niewt MMP-9 Ausdrock wéinst anere MMPs Ausdrock gin. Figur 3 Den Effet vun Ahr agonist TCDD op AGS Zellen Wanderung an Invasioun. (A) Meter verkënnegt Migratioun assay. (B) Transwell Migratioun assay. (C) Transwell Invasioun assay. VerfÜgung c-Jun mediated MMP-9 Ausdrock vun Ahr Passerelle Aktivéierung VerfÜgung De Mechanismus vun TCDD-entschlof Ännerungen am MMP-9 Ausdrock entschlof ass net ganz kloer. Rezent Etude confirméiert datt TCDD kann c-Jun Ausdrock [30, 31] an c-juni ass en Zil Gentherapie vun Ahr Passerelle [8] induce; de Promoteur Haaptrei am 5'-Reliefsailen Regioun vum Mënsch MMP-9 Gentherapie enthält c-Jun Siten bindend [16] an c-Jun entschlof kann MMP-9 Ausdrock [32]; der Transkriptiouns Aktivitéit vun c-Jun ass bedeitend verstäerkt am gastric Kriibs [33]. Qatar op dës Etude Resultater, proposéiert mir eng Hypothes, datt TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock vun AGS Zellen vun c-Jun mediated ass. Fir dëst Hypothes hindeiten, nogewise mir éischter der c-Jun Ausdrock vun AGS Zellen folgenden TCDD Behandlung, an fonnt dass souwuel c-Jun mRNA (Figebam. 4A an 4C) an FAQ (Figebam. 4B an 4D) Ausdrock vun AGS Zellen eropzesetzen an enger Portioun (Figebam. 4A an 4B) an Zäit (Figebam. 4C an 4D) ofhängeg Manéier folgenden TCDD Traitement, an dësem TCDD-entschlof c-Jun Ausdrock hätt vun Ahr neien resveratrol (Figebam. 4E an 4F) reservéiert ginn. Virun Donnéeën bewisen, dass c-Jun eng Zilscheif Gentherapie vun Ahr Passerelle an AGS Zellen ass. Fir weider dass beweisen c-Jun kann TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock, siRNA transfection Mediate war standing c-Jun mRNA zu AGS Zellen a Rou. D'Resultater bewisen, dass c-Jun siRNA (final Konzentratioun 50 nmol /L) transfection bal komplett c-Jun Ausdrock vun AGS Zellen ofgeschaf souwuel zu mRNA Niveau (Figebam. 4G) an zu FAQ Niveau (Figebam. 4H). Dofir, der c-Jun siRNA transfection fir 48 Stonnen, sech AGS Zellen fir 24 Stonnen mat TCDD um Konzentratioun 10 nmol /L behandelt, Zell PELLET a Kultur Medien sech gesammelt, an MMP-9 mRNA Ausdrock an Aktivitéit huet gemooss. Als zu Figebam gewisen. 4I an 4J, MMP-9 mRNA Ausdrock an Aktivitéit an onbehandelt Kontroll AGS Zellen sech ganz schwaach; No TCDD (10 nmol /L) Behandlung, MMP-9 mRNA Ausdrock an Aktivitéit huet bedeitend fräi; Dëst TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock an Aktivitéit Erhéijung konnt vun c-Jun siRNA transfection ofgeschaaft ginn an net duerch Kontroll siRNA transfection beaflosst ginn. Virun Donnéeën bewisen, dass c-Jun MMP-9 Ausdrock vun Ahr Passerelle Aktivatioun vun AGS Zellen entschlof mediated. Figur 4 c-Jun mediates TCDD-entschlof MMP-9 Ausdrock an Aktivitéit. (A) TCDD induces c-Jun mRNA Ausdrock vun enger Portioun-ofhängeg täteg. (B) TCDD induces c-Jun FAQ Ausdrock vun enger Portioun-ofhängeg täteg. (C) TCDD induces c-Jun mRNA Ausdrock vun enger Zäit-ofhängeg täteg. (D) TCDD induces c-Jun FAQ Ausdrock vun enger Zäit-ofhängeg täteg. (E) Island reverses TCDD-entschlof c-Jun mRNA Ausdrock. (F) Island reverses TCDD-entschlof c-Jun FAQ Ausdrock. (G) c-Jun siRNA silences c-Jun mRNA Ausdrock. (H) c-Jun siRNA silences c-Jun FAQ Ausdrock. (Ech) c-Jun siRNA bremst TCDD-entschlof MMP-9 mRNA Ausdrock. (J) c-Jun siRNA bremst TCDD-entschlof MMP-9 Aktivitéit Erhéijung. VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung An Conclusioun, déi heiteg Etude bewisen, datt Ahr Passerelle kann zu gastric Kriibs AGS Zellen an Ahr Passerelle Aktivéierung induces-MMP 9 ageschalt sinn Ausdrock an Aktivitéit déi AGS Wanderung an Invasioun kënschtlech dréit schlussendlech fir. Ausserdeem, weisen eis Daten datt dës Ahr Aktivéierung-entschlof MMP-9 Ausdrock vun c-Jun mediated ass. Well ofgeschnidden vun ECM an Keller Membran e wesentleche Schrëtt zu entholl Invasioun an Metastasen ass, eis Resultater Asiicht an de Mechanismus bidden a Funktioun vun der Ahr Passerelle a sengen Auswierkungen op dës Prozesser während gastric Kriibs Werdegang. VerfÜgung Method VerfÜgung Zell Kultur VerfÜgung Gastric Kriibs Zell Linn AGS war vun der American Type Kultur Collection (ATCC, Rockville, MD) kritt, an ass zu RPMI 1640 mëttelfristeg (Hyclone) ergänzt mat 2 mm glutamine, 10% an et Bovine serum (Hyclone) haten, 100 Unitéiten /ml vun penicillin, an 100 μg /ml vun gentamycin. Bewosst Ëmwelt war um 5% CO 2 an 37 ° C haten. Zellen sech aus den exponential Wuesstem Phase gesammelt an total RNS an FAQ waren ënnert ëmschriwwen virbereet. VerfÜgung Prefabrizéierten vun Zellen VerfÜgung TCDD an Resveratrol sech aus Fläch chemesche Company (Bellefonte, PA, USA) kaaft. No incubation fir 24 Stonnen, waren d'Zellen mat TCDD bei verschiddene Konzentratioune behandelt (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nm) oder TCDD (1 nm) plus Resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 μM) fir 24 Stonnen, oder mat TCDD (1 nm) fir verschidden Zäit behandelt (0, 1, 6, 24, 48, 72 Stonnen) bzw.. All Drogen waren a Police sulphoxide (DMSO) opgeléist. Kontroll Zellen scho 0,1% DMSO nëmmen. VerfÜgung RNS Synthes klenger interfering VerfÜgung klenger interfering RNAs (siRNAs) waren Wierderbuch an héich-Performance sidd (Ribo Déi, lousoihong). c-Jun siRNAs (Sënn, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; antisense, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) a Kontroll siRNAs (Sënn, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; antisense, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), keen homology mat all bekannt mënschleche Genen dotéiert, sech an RNase-gratis ddH opgeléist 2O zu enger definitiver Konzentratioun vun 20 μmol /L. VerfÜgung klenger RNS transfection interfering VerfÜgung BTS (5 × 10 5) huet sech op Wells vu sechs-gutt Zell Kultur Placke plated an erlaabt fir ze halen 24 Stonnen. Véier microliters Lipofectamine2000 (Invitrogen) pro gutt bäigebaut zu serum-gratis Opti Mem (Invitrogen) fir eng final complexing Volume vun 250 μl, verbannen gemëscht, an bei Raumtemperatur fir 5 Minutten incubated. Fënnef microliters vun siRNA Léisung pro gutt sech mat 250 μl serum-gratis Opti Mem verdënntem. Mix d'verdënntem siRNA Léisung an der verdënntem Lipofectamine2000 verbannen, an incubate bei Raumtemperatur fir 30 Minutten. D'Lipofectamine2000 /siRNA komplex war an der Wells dobäi wouvun 1500 μl RPMI 1640 mat 10% FBS an normal Zell Kultur Konditiounen incubated. All vun der assays sech no 48 Stonnen. VerfÜgung RNS Isolatioun an RT-Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNS vun Zellen Leeschtung war mat der Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) laut den Hiersteller d'Instruktioune ofgebaut. cDNA war mat 1 μg total RNS benotzt ëmgedréint transcriptase, ReverTra AceTM (Toyobo Co, Rekorder, Japan) ënnert folgenden Conditioun Wierderbuch: 30 ° C fir 10 min, 42 ° C fir 20 min, 99 ° C fir 5 min, a 4 ° C fir 5 min. Hinnen alleguer vun cDNA war zu enger Reaktioun Mëschung (30 μl) mat 2 μl vun Skelett cDNA, 2,5 mm MgCl duerchgefouert 2, 200 μM dNTPs, 0.3 μM primer 1 an 2, an 1 Eenheet vun Taq DNA polymerase (New England Biolabs). Amplification war mat der folgender Conditioun gesuergt: 94 ° C fir 5 min, gefollegt vun 25-32 Monaco (fir 45 Spiller fir 30 ass, an verlängeren denature fir 30 ass bei 72 ° C an 94 ° C, anneal), an dann 72 ° C fir 7 min. D'Detailer vun primers, annealing Temperatur, amplification Monaco, an Hinnen alleguer Produit Gréisst fir all Gentherapie zu Table opgezielt sinn 1. D'Hinnen alleguer Produiten sech op 1,5% agarose gelies, Kierchefënster mat ethidium bromide, an visualized mat enger ultra-violett (UV) electrophoresed transilluminator. Band intensities an RT-Hinnen alleguer waren mat laachen ech sinn One Imaging Analyse Software. Band intensities vun CYP 1A1, MMP-9 an c-Jun mRNA sech mat entspriechende Band intensities vun Beta-actin normalized. Donnéeën war wéi heeschen ± SD.Table 1 Primer Message an Hinnen alleguer amplification Konditiounen gemellt VerfÜgung Gene
Primers (5 '→ 3')
Annealing Temperatur (° C)
Cycles
Product Gréisst (BP)
CYP1A1 VerfÜgung S: CCATGTCGGCCACGGAGTT VerfÜgung 59 zu 32 VerfÜgung 174 VerfÜgung A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT VerfÜgung MMP-9 VerfÜgung S: CAACATCACCTATTGGATCC VerfÜgung 52,5 VerfÜgung 37 VerfÜgung 480 VerfÜgung A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT VerfÜgung c-Jun VerfÜgung S : TCAGACAGTGCCCGAGAT VerfÜgung 55,2 VerfÜgung 30 VerfÜgung 292 VerfÜgung A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG VerfÜgung Beta-actin VerfÜgung S: CTCGCTGTCCACCTTCCA VerfÜgung 52 zu 30 VerfÜgung 256 VerfÜgung A: GCTGTCACCTTCACCGTTC VerfÜgung Croix: S, Sënn primer; A, antisense primer VerfÜgung Western blot Analyse VerfÜgung Zell Pellets sech zu engem lysis gefiermt mat 20 mm Hepes, 1 mm EGTA, 50 mm β-glycerophosphate, 2 mm Natrium orthovanadate, 10% Glycerol, 1% Triton X homogenized 100, 1 mm DTT, an 1 × Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Däitschland). Lysate war um 13000 Ziichter a 4 iwer fir 10 Minutten centrifuged. D'supernatant war den Total Zell lysate. Protein Konzentratioun war mat der BCA FAQ assay Kit (Pierce chemesche Co., Rockford, IL) gemooss. Drësseg micrograms vun FAQ war pro Geschäftswelt iwwerlaascht, vun 10% SDS-polyacrylamide gelies electrophoresis getrennt, an op equilibrated polyvinylidene difluoride Membran transferéierte electroblotting. Schläimhait sech virbildlech mat TBS-T gefiermt mat 5% (w /v) nonfat dréchen Mëllech. Ahr, CYP1A1, c-Jun a Beta-actin fir 2 Stonnen nogewise goufen antibodies géint Ahr (SC-5579, Santa Cruz Déi, schaffen dilution 1: 150) benotzt, CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, schaffen dilution 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz déi, dilution schaffen 1: 200) an Beta-actin (DZ0, Zell sécher Technology, schaffen dilution 1: 1000). No Secondaire antibody incubation (schaffen dilution 1: 2000), verstäerkte chemiluminescence (Pierce Déi Galaxy) war vun aussetzt x-Ray Film alles. Band intensities am Western blot sech mat laachen ech sinn One Imaging Analyse Software. Band intensities vun CYP 1A1 an c-Jun sech normalized mat Band intensities vun Beta-actin entspriechend. Donnéeën war gemellt wéi heeschen ± Fils. VerfÜgung gelatin zymography VerfÜgung Media aus TCDD behandelt Kulturen war electrophoresed op SDS-PAGE wou d'gelies 0,1% enthält (w /v) gelatin. D'gelies huet Iwwernuechtung an engem Zn 2+ an Ca 2+ wouvun gefiermt incubated der MMPs ze erlaben hir eegen Struktur ze Kredibilitéit an der gelatin am gelies dauert. Kloer wäisser Bande op den Coomassie Kierchefënster gelies duerops MMP Aktivitéit sinn. Band intensities benotzt ech sinn One Imaging Analyse Software laachen. VerfÜgung Meter Migratioun assay VerfÜgung verkënnegt Fir d'Moosse vun Zell Migratioun während Meter verkënnegt, goufen AGS Zellen rakommen an eenzelne Wells vun enger 6-gutt Kultur zappen. Wann d'Zellen e Spuenien wär Staat erreecht, Zell Schichten huet mat enger Plastikstut micropipette blesséiert Tipp eng grouss orifice mussen. Déi mëttel- a Stëps sech aspirated ewech a vun 2,5 ml vu frësch serum-gratis mëttelfristeg ersat déi verschidden Konzentratioune vun TCDD Texter (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nm). Zellen sech all 12 h der wounding vun Phase Géigesaz microscopy fotografeschen. Fir eng Evaluatioun vun "Meter Zoumaache," fënnef zoufälleg laanscht all Meter ausgewielt Punkten waren markéiert, an déi horizontal Distanz vun gemooss Zellen aus der initialen Meter war wanderen. Donnéeën war wéi heeschen ± Fils gemellt. VerfÜgung Transwell Wanderung an Invasioun assay VerfÜgung Traité oder onbehandelt Kontroll Zellen sech am triplicate an der ieweschter ëmkomm vun engem Transwell rakommen g (Corning, New York, NY, USA) zu serum-gratis mëttelfristeg op eng Dicht vun 1 × 10 5 pro gutt. Fir Migratioun assays, mëttel- 5% serum wouvun war an der ënneschter Chamber ze handelen als chemoattractant gesat, an Zellen sech weider fir 18 h incubated. Nonmigratory Zellen sech aus der ieweschter Chambre geläscht Dat well, an d'Zellen op den ënneschten Uewerfläch vun der Neiegkeet Rescht huet fir 15 Minutten 0,1% glaskloer mauve Kierchefënster benotzt. Zellen sech ënnert engem microscope gezielt. Invasioun assays sech als fir d'Wanderung assays uewen beschriwwen gemaach, ausser Text mat der extracellular Matrixentgasung (ECM) Auswiesselspiller Matrigel (BD Biosciences) an incubated iwwer eng 24-h Period precoated goufen. All Klon gouf zu triplicate an all Experimenter plated an all Experiment war op d'mannst dräimol widderholl. Zell Migratioun (oder Invasioun) Fähegkeet = (d'Zell Zuel vun behandelt Grupp /de Zell Zuel vun Kontroll Grupp) × 100%. VerfÜgung Notes VerfÜgung Sech-Li Peng, Jie Chen matgehollef gläich un dëser Aarbecht. VerfÜgung Deklaratioune VerfÜgung Merci VerfÜgung Dës Aarbecht vun de folgende Subventioune ënnerstëtzt war: d'Subventioune vum National Natural Science Foundation of China (Nr 30670949, Nr 30671904 an No.30871145), Subventiounen un nei Prof aus Chinese Ministère ausgezeechent vun Educatioun (No.20070558288), Subventiounen Eelefmeter fir Dokteraarbecht Opsiicht vum Chinese Erzéiungsministère (N ° 20060558010), déi Subventioune vun der Natural Science Foundation vun Guangdong Province (No.5300767 an No.7001641). VerfÜgung Auteuren 'original deposéiert Fichieren fir Biller VerfÜgung sinn ennen d'Linken op der original deposéiert Fichieren fir Biller "Auteuren. 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff Auteuren 'original Datei fir Figur 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Auteuren' original Datei fir Figur 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Auteuren 'original Datei fir Figur 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Auteuren' original Datei fir Figur 4

• Geplangten Iwwerliewe Analyse vun Koreanesch Patienten mat gastric Kriibs amgaang curative gastrectomy
• Machbarkeet vu verstäerkte Relance an der Chirurgie an gastric Agrëff: eng Retrospektiv study