Arila aktivacija ogljikovodik receptorja pot izboljšuje želodčni rak celic invazivnosti verjetno skozi c-Jun odvisni indukcijo MMP-9

Aktivacija aril ogljikovodikov receptor pot poveča želodčni rak celic invazivnosti verjetno s c-Jun-odvisne indukcijo MMP-9
Abstract
Ozadje
Abberant aril ogljikovodikov receptor (Ahr) izraz in Ahr aktiviranje pot so vključeni v želodca nastanek raka. Vendar pa je razmerje med Ahr pot aktivacije in želodca napredovanje raka je še vedno nejasno. V tej raziskavi smo uporabili 2,3,7,8-tetraklorodibenzo-para-dioksin (TCDD), klasično in najbolj močan liganda Ahr, za aktiviranje Ahr poti in raziskovali učinek Ahr pot aktivacije na raka človeškega želodca AGS celice naselitev ter raziskati ustrezen mehanizem.
Rezultati
Da bi ugotovili, ali je Ahr pot lahko aktivira v AGS celicah, smo pregledali izražanje CYP1A1, klasičen ciljni gen Ahr poti, po izpostavljenosti TCDD. RT-PCR in western blot analiza je pokazala, da sta bila CYP1A1 mRNA in izražanje beljakovin na način, ki je odvisen od po zdravljenju TCDD in Ahr antagonista resveratrol (RSV), bi lahko spremenili to-TCDD inducirane CYP1A1 izraz povečala. Ugotoviti, ali TCDD zdravljenje AGS celic rezultatov v indukcijo MMP-9 izražanja smo odkrili MMP-9 mRNA uporabo RT-PCR in odkrite MMP-9 encimsko aktivnost z želatino cimografijo. Rezultati so pokazali, da sta bila MMP-9 mRNA izražanje in encimska aktivnost postopoma povečuje s povečanjem koncentracije TCDD v medijih in te spremembe se lahko obrne z obdelavo RSV na način, ki je odvisen od odmerka. Preučiti, ali Ahr aktiviranje-inducirane MMP-9 izražanja in dejavnost v AGS celicah ima za posledico povečane migracije in invazije, smo izvedli pri celjenju ran migracijske analize in transwell migracije in invazijo testom. Po zdravljenju TCDD, so migracije razdalji in sposobnosti migracije in invazije na AGS celic poveča, tako v odvisnosti od odmerka. Za demonstracijo Ahr-aktivacija inducirane MMP-9 izraz je posredovana s c-jun, je siRNA transfekciji izvedli utišati c-jun mRNA v AGS celicah. Rezultati so pokazali, da so MMP-9 mRNA izražanja in aktivnost neobdelano kontrolnih AGS celic je zelo šibka; Po TCDD (10 nmol /L) zdravljenja, so bili MMP-9 mRNA in aktivnost znatno povečana; To-TCDD inducirane MMP-9 izražanja in aktivnost povečanja se lahko odpravijo s c-Jun siRNA transfekciji.
Zaključek
Ahr aktivacijska pot izboljšuje želodčni rak celic invazivnosti verjetno skozi c-Jun-odvisne indukcijo MMP-9. Naši rezultati nudijo vpogled v mehanizem in funkcije Ahr poti in njen vpliv na želodčno napredovanje raka.
Ozadje
aril ogljikovodikov receptor (Ahr), je a-ligand aktivira transkripcijski faktor osnovne helix-loop-helix /Per-Arnt-Sim družino. V odsotnosti liganda, Ahr je prisotna v citosolu v obliki kompleksa z dvema Chaperone Hsp90s, smal protein (P23) in imunofilin podobnega proteina (XAP2) [1, 2]. Po ligand kot 2,3,7,8-tetraklorodibenzo-para-dioksinov (TCDD, najbolj učinkovit in klasično eksogeni Ahr ligand) zavezujoč, se spremljevalca proteini razdruževanje in Ahr translocira v jedru, da tvori heterodimer s svojo partner molekulo arila ogljikovodikov receptor jedrska translocator (EKBL) [3, 4]. To heterodimer veže na specifične DNA regije, imenovana odziv dioksin element (DRE), ki ima jedro sekvenco 5'-TNGCGTG-3 ', in s tem aktivira baterijo genov izražanja [5-7].
V preteklosti študije od Ahr poti, so se osredotočili na transkripcijske ureditvi genov, ki kodirajo ksenobiotskih presnovnih encimov kot so encimi citokroma P450 [8]. Nedavne študije so pokazale, tesen odnos med Ahr in tumorigeneze mlečne žleze [7, 9]. Ahr genski polimorfizmi so povezana z večjim tveganjem pljuč in dojke raka [10, 11]. Povečana ekspresija Ahr so ​​poročali v pljučih, prsi, trebušne slinavke in raka pri ljudeh [7, 12, 13]. Študije tudi kažejo, da lahko konstitutivno aktivno Ahr spodbujanje hepatocarcinogenesis pri miših [14]. Ti podatki kažejo na tesno povezavo med Ahr in tumorigeneze. Vendar pa je razmerje med Ahr in napredovanja tumorja ni jasno.
Tumorske celice invazija in metastaze je zapleten proces, med katerimi razgradnja zunajceličnega matriksa (ECM) in bazalne membrane je ključni korak. Tumorske invazije in metastaza opira na izražanje matriks metaloproteinaz (MMP) uničiti ECM in kleti membrano omogoča migracijo celic. MMP so skupina cinkovih odvisna metallopeptidases [15-17]. Matrix metalo-9 (MMP-9) je ena od tipa IV kolagenaze /želatinaze, ki razgradijo bazalne membrane kolagena in želatine [16]. MMP-9 je pogosto povezano s tumorsko invazijo in metastaziranje [17]. Sinteza MMP-9 ureja več rastnih faktorjev, citokinov in hormonov [16, 18]. Nedavna študija povezani-TCDD povezana lezije z odklonskega presnovo matrike [8]. podatkov mikromrež kažejo, da TCDD /Ahr spremeni izražanje genov vključiti v metabolizmu matrike in odlaganje [8]. Villano et al [19] in Haque et al [18] so poročali, da bi lahko Ahr agonist TCDD inducira MMP-9 izraz v huamn melanoma in rakavih celic prostate. Te študije kažejo, da lahko ekspresijo MMP-9 skupna končna točka za aktiviranje AHR poti [8, 19].
Rak želodca je četrti najpogostejši malignost in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svet [20]. Želodca rakave celice invazija in metastaze pogosto privede do slabo prognozo. Številne študije, povezane Ahr aktivacijo poti do želodca rakotvornost. Chen et al dalo povečano ekspresijo Ahr v dveh človeške želodčne raka celičnih linij (Rf1 in RF48) z uporabo analize mikromrež [21]. Ma et al so poročali, da je sočasno izražanje Ahr in CYP1A1 povezana z razvojem želodčnega raka [22]. Andersson sod ugotovili, da lahko konstitutivno aktivirano Ahr inducira želodčnih tumorjev v transgene mišjem modelu [23]. V drugi naših raziskavah smo ugotovili, da so bili Ahr izražanja in jedrsko translokacijo znatno višja v raka želodca kot predrakavih lezij in normalno želodčne sluznice [24]. Vendar pa je razmerje med Ahr pot aktivacije in želodca invaziji raka in metastaz še vedno ni jasno. Zato smo raziskali vpliv Ahr aktivacije pathway na človeške želodčne rakavih celic. Naši podatki so predstavljeni tukaj dokazujejo, da se Ahr pot lahko aktivira v želodčnih rakavih AGS celic in Ahr pot aktivacije v AGS celicah inducira MMP-9 izražanja in krepi AGS celice migracije in invazijo dejavnost. Poleg tega so naši podatki kažejo, da je ta Ahr-aktivacija inducirane MMP-9 izraz posreduje c-jun.
Rezultati in razprava
Ahr pot aktivacije v AGS celicah
V drugi naših raziskavah smo pokazali, da je je bila visoka stopnja Ahr izražanja v AGS celic [24]. Da bi ugotovili, ali je Ahr pot lahko aktivira v tej celični liniji, smo pregledali izražanje citokroma P-450 1A1 (CYP1A1), klasično ciljnega gena Ahr poti, po Ahr izpostavljenosti agonist TCDD. RT-PCR in western blot analiza je pokazala, da sta bila CYP1A1 mRNA (sl. 1A) in beljakovin (sl. 1B) izražanje v AGS celic na način, odvisen od doze po zdravljenju TCDD povečala. Da bi ugotovili, ali je to-TCDD povzroča CYP1A1 izraz Ahr-odvisne, je Ahr antagonist resveratrol (RSV) za blokiranje Ahr pot. Kot je prikazano na sliki. 1C in 1D, lahko RSV obratno TCDD inducirane CYP1A1 izraz na način, ki je odvisen od odmerka. Ti podatki kažejo, da se Ahr pot lahko aktivira v AGS celic z TCDD. Slika 1 Ahr agonist TCDD in Ahr antagonist RSV urejeno CYP1A11 izraz v AGS celicah. Po različnih koncentracijah (kot je prikazano zgoraj) zdravljenja TCDD 24 ur (a) analizi RT-PCR CYP1A1 mRNA izražanja v koncentracijskem odziva. (B) Western blot analizo izražanja CYP1A1 beljakovin v koncentracijskem odziva. Po sočasnim zdravljenjem z TCDD (1 nM) in RSV (pri različnih koncentracijah kot je prikazano zgoraj), 24 ur (C) mRNA Izražanje CYP1A1 bila odkrita RT-PCR. (D) Protein izraz CYP1A1 je bila odkrita Western blot.
Ahr pot aktivacije v AGS celicah inducira MMP-9 izraz
so Prejšnje študije so pokazale, da je v nekaterih rakavih celic, Ahr izpostavljenost agonist TCDD aktivira MMP-9 izražanje genov [18, 19]. Da bi ugotovili, ali TCDD zdravljenje AGS celic rezultatov v indukcijo MMP-9 izražanja, smo zaznali MMP-9 mRNA s pomočjo RT-PCR po izpostavljenosti TCDD. Kot je prikazano na sliki. 2A, je bil MMP-9 mRNA izraz inducirane na način, odvisen od doze po zdravljenju TCDD. Preučiti vlogo na poti Ahr pri posredovanju TCDD-inducirane MMP-9 izražanja v AGS celicah, so bili sočasno zdravljeni z TCDD in antagonista resveratrola Ahr kulture. Sočasno zdravljenje z resveratrolom odpravijo-TCDD inducirane MMP-9 izražanja (sl. 2C) je pokazala, da je TCDD-aktivacija MMP-9 izražanja odvisna od Ahr poti. Navedeni podatki kažejo, da aktiviranje Ahr pot v AGS celicah inducira MMP-9 mRNA izraz. V večini tipov celic, gen prepis MMP-9 je inducibilen in po prevodu je encim takoj izloča in aktivira prek mehanizma cistein-stikala [25]. Če želite ugotoviti, ali so te spremembe v izražanju genov naslednje Ahr pathway posledica aktivacije v spremembah MMP-9 encimske aktivnosti smo izvedli želatino cimografijo. Rezultati so pokazali, da so MMP-9 aktivnosti v medijih postopoma povečuje z naraščanjem koncentracije TCDD v medijih (sl. 2B) in te spremembe se lahko obrne z obdelavo resveratrola na način, odvisen od doze (sl. 2D). Ti podatki kažejo, da Ahr pot aktivacije-inducirano povečanje MMP-9 izražanja v korelaciji s povečanjem MMP-9 aktivnosti. Slika 2 Ahr agonist TCDD in Ahr antagonist RSV urejeno MMP-9 izražanja in dejavnost v AGS celicah. Po različnih koncentracijah (kot je prikazano zgoraj) zdravljenja TCDD 24 ur (a) analizi RT-PCR MMP-9 mRNA ekspresije v koncentracijskem odziva. (B) Analiza želatina cimografijo izmed MMP-9 aktivnosti proteina v koncentracijskem odziva. Po sočasnim zdravljenjem z TCDD (1 nM) in RSV (pri različnih koncentracijah kot je prikazano zgoraj), 24 ur (C) mRNA ekspresije MMP-9 je bila odkrita z RT-PCR. (D) Protein aktivnost MMP-9 smo zaznali z želatinasto cimografijo.
Ahr pot aktivacije povečuje AGS celice migracije in invazijo
MMP-9 je eden izmed kolagenaze tipa IV /želatinaze, ki lahko razgradijo ECM komponent. MMP-9 je pogosto povezano s tumorsko invazijo in metastaziranje [17]. Študije so pokazale pomembno povezanost med MMP-9 izražanja in invazivnosti in bezgavkah metastaze želodca karcinomov [26-28]. Preučiti, ali Ahr aktiviranje-inducirane MMP-9 izražanja in dejavnost v AGS celicah ima za posledico povečane migracije in invazije, smo izvedli pri celjenju ran migracijske analize in transwell migracije in invazijo testom. Po obdelavi TCDD je migracija razdalja AGS celic znatno povečala z način, odvisen od odmerka, v primerjavi s kontrolnimi celicami (P < 0,01) (sl. 3A). Rezultati Transwell pokazali znatno povečanje migracije (slika 3B). in invazijo (slika 3C). sposobnosti AGS celic, ko so celice inkubiranih z TCDD v koncentracijah od 0,1 nmol /L (P < 0,01) do 100 nmol /l ( p < 0,01). pomembnega vpliva na migracije in invazije je bilo na koncentracijo TCDD < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Ti rezultati pokazali, da je aktivacija Ahr pot povečuje raka želodca AGS celice migracije in invazijo. Razgradnja ECM in bazalne membrane je pomemben korak v tumorske invazije in metastaz. Gre za delovanje matričnih metaloproteinaz (MMP). Naša raziskava je pokazala, da bi Ahr aktiviranje pot inducira MMP-9 izražanja in encimsko aktivnost, ter spodbujati AGS celice migracije in invazijo. Druge študije so pokazali, da bi lahko Ahr aktivacija poti povzroči različne MMP izražanja [19, 29]. Ahr aktiviranje pot povečuje raka želodca AGS celic migracije in invazije lahko tudi posledica drugih MMP izražanja poleg MMP-9 izražanja. Slika 3 Učinek Ahr agonisti TCDD na AGS celic migracije in invazije. (A) celjenje ran migracije testom. (B) Transwell migracije test. (C) Transwell invazija test.
C-Jun posredovano MMP-9 izraz, ki ga Ahr pot aktivacije povzroča
Mehanizem sprememb-TCDD inducirane v MMP-9 izražanja ni povsem jasno. Nedavne študije so poročali, da lahko TCDD povzroči c-jun izraz [30, 31] in c-Jun je cilj gen Ahr poti [8]; promotor sekvenco v 5'-bočno regijo humanega MMP-9 gena vsebuje c-Jun vezavnih mest [16] in c-Jun lahko inducirane MMP-9 izražanja [32]; prepis aktivnost c-Jun je pomembno, okrepljeno z rakom želodca [33]. Opirajoč se na teh študijskih rezultatov, smo predlagali hipotezo, da je TCDD-inducirane MMP-9 izraz v AGS celic, posredovane s c-jun. Za prikaz te hipotezo, smo najprej odkrili c-jun izraz v AGS celic po zdravljenju TCDD, in ugotovila, da sta bila c-Jun mRNA (sl. 4A in 4C) in beljakovin (sl. 4B in 4D) izraz v AGS celicah poveča na odmerek (sl. 4A in 4B) in takrat lahko (sl. 4C in 4D) odvisna od načina po zdravljenju TCDD, in to-TCDD inducirane c-Jun izraz je rezerviran s Ahr antagonista resveratrola (sl. 4E in 4F). Zgoraj podatkov je pokazala, da je c-Jun ciljni gen Ahr pot v AGS celicah. Da bi še dodatno dokazati, da je c-Jun lahko posreduje-TCDD inducirane MMP-9 izražanja, je siRNA transfekciji izvedli utišati c-jun mRNA v AGS celicah. Rezultati so pokazali, da c-Jun siRNA (končna koncentracija 50 nmol /L) transfekciji skoraj popolnoma odpravljena c-jun ekspresijo v celicah AGS tako na ravni mRNA (sl. 4G) in na nivoju proteinov (sl. 4H). Zato, ko c-Jun siRNA transfekciji 48 urah smo AGS celice obdelamo s TCDD na koncentracijo 10 nmol /L 24 ur, celični pelet in kultura mediji so bili zbrani, in smo izmerili MMP-9 mRNA izražanja in aktivnost. Kot je prikazano na sliki. 4I in 4J, MMP-9 mRNA in aktivnost v neobdelano kontrolnih AGS celice so bile zelo šibka; Po TCDD (10 nmol /L) zdravljenja, so bili MMP-9 mRNA in aktivnost znatno povečana; To-TCDD inducirane MMP-9 izražanje in aktivnost povečanje se lahko odpravijo s c-Jun siRNA transfekciji in ne smejo biti pod vplivom nadzorni siRNA transfekciji. Nad podatkov je pokazala, da je c-Jun posredovano MMP-9 izražanje Ahr pot aktivacije inducira v AGS celicah. Slika 4 c-Jun posreduje-TCDD inducirane MMP-9 izražanja in aktivnosti. (A) TCDD povzroča c-Jun mRNA izraz na način, ki je odvisen od odmerka. (B) TCDD povzroča c-jun beljakovin izraz na način, ki je odvisen od odmerka. (C) TCDD inducira c-Jun mRNA ekspresije v odvisnosti od časa način. (D) TCDD inducira c-jun proteinov ekspresijo v odvisnosti od časa način. (E) RSV obrne-TCDD inducirane c-Jun mRNA izraz. (F) RSV obrne-TCDD inducirane c-jun beljakovin izraz. (G) c-Jun siRNA utiša c-jun mRNA ekspresije. (H) c-Jun siRNA utiša c-jun proteinov ekspresije. (I), c-Jun siRNA inhibira TCDD inducirane MMP-9 mRNA ekspresije. (J) c-Jun siRNA zavira-TCDD inducirane MMP-9 povečanje aktivnosti.
Zaključek
Skratka, ta študija je dokazala, da se Ahr pot lahko aktivira v želodčnih rakavih AGS celic in Ahr pot aktivacije inducira MMP-9 izražanja in dejavnost, ki v končni fazi prispeva k AGS migracije in invazije in vitro. Poleg tega naši podatki kažejo, da je ta Ahr aktivacija inducirane MMP-9 izraz posredovana s c-jun. Ker degradacija ECM in bazalne membrane je pomemben korak v tumorske invazije in metastaz, naši rezultati nudijo vpogled v mehanizem in odvisnosti od poti Ahr in njen vpliv na te postopke med želodca napredovanju raka.
Metode
celične kulture
želodca karcinom linija AGS dobimo iz American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) in smo vzdrževali v RPMI 1640 medija (Hyclone), dopolnjenem z 2 mM glutamina, 10% fetalni goveji serum (Hyclone), 100 enot /ml penicilina in 100 ug /ml gentamicina. Celični okolje smo vzdrževali pri 5% CO 2 in 37 ° C. Celice so bile pridelane iz eksponentne faze rasti in celotne RNA in beljakovin so bili pripravljeni, kot je opisano v nadaljevanju.
Zdravljenje celic
TCDD in Resveratrol bili kupljeni pri Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, ZDA). Po inkubaciji 24 ur, smo celice obdelali s TCDD v različnih koncentracijah (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) ali TCDD (1 nM) plus resveratrol (0, 1, 5, 10, 20 uM) za 24 ur, ali obdelan z TCDD (1 nM) za drugačen čas (0, 1, 6, 24, 48, 72 ur) oz. Vsa zdravila smo raztopili v dimetilsulfoksidu (DMSO). Kontrolne celice prejela 0,1% DMSO samo.
Mala motečih RNA sinteze
mala motečih RNA (siRNAs) smo sintetizirali in visoko zmogljivost očistimo (ribonukleinsko biotehnologija, Guangzhou). c-Jun siRNAs (občutek, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; protismiselne, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) in nadzor siRNAs (občutek, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT; protismiselna, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), pri čemer ne homologijo z vsemi znanimi človeških genov, smo raztopili v RNaze brez DDH 2O do končne koncentracije 20 mol /L.
mala interferenčna RNA transfekciji
celice (5 x 10 5) smo nanesli na vdolbino šestimi vdolbinami celične kulture ploščama in pustimo, da držijo za 24 ur. Štiri mikrolitrov Lipofectamine2000 (Invitrogen) na jamico dodamo k seruma Opti MEM (Invitrogen) v končnem volumnu kompleksirnega 250 ul, rahlo pomešamo in inkubiramo pri sobni temperaturi 5 minut. Pet mikrolitrov iz siRNA raztopine na jamico smo razredčili s 250 ul seruma Opti MEM. razredčeno raztopino siRNA in razredčeno Lipofectamine2000 zmešajte previdno, in inkubiramo pri sobni temperaturi 30 minut. Lipofectamine2000 /siRNA kompleksu dodamo v jamice, ki vsebujejo 1500 ul RPMI 1640 z 10% FBS in inkubirali v normalnih pogojih celične kulture. Vse teste smo izvedli po 48 urah.
RNA izolacija in RT-PCR
Celotna RNA celic smo ekstrahirali z Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) po navodilih proizvajalca. cDNA smo sintetizirali z 1 ug celotne RNA z uporabo reverzno transkriptazo, ReverTra AceTM (Toyobo Co, Osaka, Japonska) pod naslednjimi pogoji: 30 ° C za 10 minut, 42 ° C za 20 minut, 99 ° C 5 min in 4 ° C 5 min. PCR cDNA je bila izvedena v reakcijski zmesi (30 ul), ki vsebuje 2 xl cDNA šablonske, 2,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP-jev, 0,3 uM oligonukleotidov 1 in 2, ter 1 enota polimeraze Taq DNA (New England Biolabs). Pomnoževanje smo izvedli s pomočjo naslednji pogoj: 94 ° C za 5 minut, čemur sledi 25-32 ciklov (denaturira 45 sekund pri 94 ° C, žarjenje za 30 sekund, in razširi za 30 sekund pri 72 ° C), nato pa 72 ° C za 7 min. Podrobnosti primerji, temperaturo kaljenja, pomnoževalnih ciklov in velikost proizvoda PCR za vsako gena, so navedeni v tabeli bile 1. PCR produkti elektroforezo na 1,5% agaroznem gelu, obarvane z etidijevim bromidom in vizualizirali z ultravijolično (UV) transilluminator. Band intenzivnosti v RT-PCR so količinsko, z uporabo količina ena programsko opremo za analizo slikanje. Band intenzivnosti CYP 1A1, MMP-9 in c-Jun mRNA smo normalizirali z ustreznimi pasu intenzivnosti beta-aktina. Podatki so poročali kot povprečje ± SD.Table 1 Temeljni premaz sekvenc in pomnoževanje pogoji
Gene
premazi (5 '→ 3')

temperature Žarjenje (° C)
cikli
velikost izdelka (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta-aktin
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Kratice: S, občutek premaz; A protismerni oligonukleotidni
bile Western blot analizo
Cell peletov homogenizirali v liznem pufru, ki vsebuje 20 mM Hepes, 1 mM EGTA, 50 mM β-glicerofosfat, 2 mM natrijev ortovanadata, 10% glicerol, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT in 1 x proteaze Inhibitor koktajl (Roche, Mannheim, Nemčija). Lizat smo centrifugirali pri 13000 obratih na minuto in 4 ° C za 10 minut. Supernatant je bil celotni celični lizat. Koncentracija proteina je bila izmerjena z BCA protein preizkusnega kompleta (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Trideset mikrogramov proteina smo nanesli na stezo, ločeni z 10% SDS-poliakrilamidnem gelsko elektroforezo in prenese na uravnotežen poliviniliden difluorid membrane electroblotting. Membrane smo blokirali s TBS-T pufer, ki vsebuje 5% (m /v), nemastno mleko v prahu. Ahr, CYP1A1, c-Jun in beta-aktina so odkrili 2 uri, ki uporabljajo protitelesa proti Ahr (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, redčenje 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, delovna razredčitev 1: 500) , c-Jun (SC-1694, santa Cruz Biotechnology, redčenje 1: 200) in beta-aktin (DZ0, celična signalizacija tehnologijo, delovno redčenje 1: 1000). Po srednji inkubaciji protiteles (obdelovalne redčenje 1: 2000), izboljšano kemiluminescence (Pierce Biotechnology, Inc.) smo določili z izpostavljenostjo rentgenskega filma. Band intenzivnosti v zahodni blot so količinsko, z uporabo količina ena programsko opremo za analizo slikanje. Band intenzivnosti CYP 1A1 in c-Jun smo normalizirali z ustreznimi pasu intenzivnosti beta-aktina. Podatki so poročali kot povprečje ± SD.
Želatina cimografijo
medije iz TCDD obdelanih kultur je elektroforezo na SDS-PAGE, kjer gel vsebuje 0,1% (m /v) želatino. Gel smo inkubirali preko noči pri Zn 2+ in Ca 2+ vsebuje buffer omogoči MMP ponovno pridobiti njihovo ustrezno strukturo in razgradijo želatino v gelu. Jasno bele črte na Coomassie barvilom obarvajo gel kažejo na MMP aktivnosti. intenzivnosti Band so količinsko, z uporabo Količina One programsko opremo za analizo slikanje.
celjenju ran migracije Preskusno
Za merjenje celični migraciji med celjenjem ran, so AGS celice zasejali v posameznih vodnjakih kulture plošče s 6 vdolbinami. Ko celice dosegli zlito stanja so celične plasti ranjenci s plastično mikropipeto namig imajo veliko odprtino. Medij in umazanijo smo odsesali stran in jo nadomestiti z 2,5 ml svežega medija brez seruma, ki vsebujejo različne koncentracije TCDD (0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 nm). Celice so fotografirali vsakih 12 ur po tem, ko ranjenih s fazno kontrastno mikroskopijo. Za oceno "celjenje zaprtje," je zaznamovalo pet naključno izbranih točk vzdolž vsake rane, in je bila izmerjena vodoravna razdalja migracija celic iz prvotne rane. Podatki so poročali kot povprečje ± SD.
Transwell migracije in invazije test PODJETJA
obdelane ali neobdelane kontrolne celice smo posejali v treh izvodih v zgornjo komoro Transwell vstavite (Corning, New York, NY, ZDA) v serumu brez medij z gostoto 1 x 10 5 na dobro. Za migracijskih testih, je medij, ki vsebuje 5% seruma nameščena v spodnjem komori deluje kot chemoattractant in celice nadalje inkubiramo 18 ur. Nonmigratory celice so bile odstranjene iz zgornje komore s strganjem in celice ostanejo na spodnji površini vložka smo obarvali z uporabo 0,1% kristal vijolično 15 minut. Celice preštejemo pod mikroskopom. Invasion teste smo izvedli kot pri migracijskih testih zgoraj opisanih, razen bili vložki predhodno prevlečene s ekstracelularni matriks (ECM) nadomestek Matrigelove (BD Biosciences) in inkubiramo v obdobju 24-h. Vsak klon smo zasadili v treh izvodih v vsakem poskusu in vsak poskus smo ponovili vsaj trikrat. Celične migracije (ali invazije) sposobnost = (število celic tretiranih skupino /število celic iz kontrolne skupine) x 100%.
Ugotavlja
Tie-Li Peng, Jie Chen prav tako prispevali k temu delu.
izjave
Zahvala
to delo je bilo podprto z naslednjimi podpor: nepovratna sredstva iz državnega Natural Science Foundation Kitajske (št 30670949, št 30671904 in No.30871145), dotacijo novega učitelja iz kitajskega ministrstva za izobraževanje (No.20070558288), dotacija dodeli nadzorniku PhD iz kitajskega ministrstva za šolstvo (št 20060558010) donacij iz Natural Science Foundation provinci Guangdong (No.5300767 in No.7001641).
prvotna avtorjev predloženi datoteke za slike
Spodaj so povezave do originalnih predloženih spisov avtorjev za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff avtorjev 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff avtorjev prvotni datoteki Slika 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff avtorjev prvotni datoteki številka 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff avtorjev prvotni datoteki sliki 4

• Pogojno analizo preživetja pri korejskih bolnikih z rakom želodca v postopku kurativno gastrectomy
• Izvedljivosti okrepljenega okrevanja po operaciji v želodčni operaciji: retrospektiva study