Арил активации рецептора углеводородный путь усиливает клетку рака желудка инвазивность вероятно через с-Jun-зависимой индукции матрицы металлопротеиназы-9

активация рецептора арилуглеводородному путь усиливает клетку рака желудка инвазивность вероятно, через C-Jun-зависимой индукции матрицы металлопротеиназы-9
Аннотация
Справочная информация
Abberant арила углеводородное рецептора (AHR) экспрессия и активация пути AhR участвуют в желудочного канцерогенеза. Тем не менее, отношения между активации пути AhR и прогрессирования рака желудка до сих пор неясно. В настоящем исследовании мы использовали 2,3,7,8-ТЕТРАХЛОРДИБЕНЗО-пара-диоксин (ТХДД), классический и самый мощный лиганд, арил-активировать AhR пути и исследовали влияние AhR активации пути на рак желудка человека клетки AGS вторжение и разведанные соответствующий механизм.
Результаты
Чтобы определить, является ли AhR путь может быть активирован в AGS клетках, мы исследовали экспрессию CYP1A1, классический целевой ген AhR пути, после воздействия TCDD. ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализ показал, что как CYP1A1 мРНК и экспрессию белка были увеличены в зависимости от дозы, после обработки ТХДД и AhR антагонист ресвератрола (RSV) может изменить эту TCDD-индуцированной экспрессии CYP1A1. Для того, чтобы определить, является ли ТГЖД лечение AGS клеток приводит к индукции экспрессии ММР-9, мы обнаружили мРНК ММР-9 с использованием RT-PCR и детектировали ММР-9 ферментативной активности с использованием желатина зимографии. Результаты показали, что и ММР-9 экспрессия мРНК и ферментативную активность постепенно увеличивалась с увеличением концентрации ТХДД в средствах массовой информации, и эти изменения могут быть отменены лечения RSV в зависимости от дозы образом. Для того, чтобы изучить вопрос о AhR активации индуцированной ММР-9 экспрессии и активности в AGS клетках приводит к увеличению миграции и вторжения, мы провели ранозаживляющие анализ миграции и Transwell миграции и инвазии анализа. После обработки ТХДД, расстояние миграция и миграция и инвазия способности клеток AGS были увеличены с зависимым от дозы образом. Для демонстрации активации индуцированной экспрессии AhR ММР-9 опосредуется с-Jun, миРНК трансфекции проводили, чтобы заставить замолчать мРНК с-Jun в AGS клетках. Результаты показали, что ММР-9 экспрессия мРНК и активность в У необработанных контрольных AGS клеток были очень слабыми; После TCDD лечения (10 нмоль /л), 9-MMP экспрессию мРНК и активность были значимо возрастал; Это ТГЖД-индуцированной ММР-9 экспрессии и активности увеличение может быть отменена с-Jun миРНК трансфекции.
Заключение
AhR активация пути усиливает клетку рака желудка инвазивность вероятно через C-Jun-зависимой индукции ММР-9. Наши результаты дают представление о механизме и функции пути AhR и его влияния на прогрессирование рака желудка.
Фона
арилуглеводородному рецептора (AHR) представляет собой лиганд-активированный фактор транскрипции основной спираль-петля-спираль /Пер-Арнт-Sim семьи. В отсутствие лиганда, AhR присутствует в цитозоле в виде комплекса с двумя шаперонного Hsp90s, A Smal белок (p23), и иммунофилин-подобный белок (XAP2) [1, 2]. После лиганда, такого как 2,3,7,8-тетрахлорадибензо-пара-диоксин (ТХДД, самый мощный и классический экзогенный AhR лиганд) связывания, то Chaperon белки диссоциируют и AhR транслокации в ядро, чтобы образуют гетеродимер с его молекулой партнером арила углеводород рецептора ядерного транслокатор (ARNT) [3, 4]. Этот гетеродимер связывается с конкретным регионом ДНК элемент называется диоксин ответ (DRE), который имеет основную последовательность 5'-TNGCGTG-3 ', и тем самым активирует батарею экспрессии генов [5-7].
Исторически исследования из AhR пути были сосредоточены на регуляции транскрипции генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков, таких как ферментов цитохрома P450 [8]. Недавние исследования показали тесную связь между и арил-онкогенеза железы молочных желез [7, 9]. полиморфизм гена AhR были связаны с повышенным риском развития рака легких и рака молочной железы [10, 11]. Повышенная экспрессия арил-углеводорода было сообщено в легких, молочной железы и рака поджелудочной железы у человека [7, 12, 13]. Исследования также показывают, что конститутивно AhR может способствовать гепатоканцерогенезе у мышей [14]. Эти данные указывают на тесную связь между и онкогенеза арил-. Тем не менее, отношения между и арил-прогрессии опухоли не ясна.
Опухолевые клетки инвазии и метастазирования представляет собой сложный процесс, среди которых деградация внеклеточного матрикса (ЕСМ) и базальной мембраны является важным шагом. Опухоль инвазии и метастазирования зависит от экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММР), чтобы уничтожить ЕСМ и базальную мембрану, чтобы позволить миграцию клеток. ММР являются группой зависимых цинка metallopeptidases [15-17]. Матрица металлопротеиназы-9 (MMP-9) является одним из IV типа коллагеназы /желатиназ, которые деградируют базальную мембрану коллагенов и желатины [16]. ММР-9 широко ассоциируется с опухолевой инвазии и метастазирования [17]. Синтез ММР-9 регулируется несколькими факторами роста, цитокинов и гормонов [16, 18]. Недавние исследования, связанные ТГЖД-ассоциированных поражений с аномальным матрицей метаболизма [8]. Данные показывают, что Microarray ГЖДТ /AhR изменяют экспрессию генов связаны в матрице обмена веществ и осаждения [8]. Villano и др [19] и Хак и др [18] сообщили, что AhR агонист ГЖДТ может индуцировать экспрессию ММР-9 в huamn клетках меланомы и клетки рака простаты. Эти исследования показывают, что экспрессия ММР-9 может быть общим для конечной точки активации пути AhR [8, 19].
Рак желудка является четвертым наиболее распространенным злокачественным и второй наиболее частой причиной связанной с раком смерти в мир [20]. Клетки рака желудка инвазии и метастазирования часто приводят к плохим прогнозом. Несколько исследований связаны активации пути AhR рака желудка. Чен и др обнаружили повышенную экспрессию ПВДП двух желудочных человеческих клеточных линий рака (RF1 и RF48) с помощью микрочипов анализа [21]. Ма и др сообщили, что одновременное выражение и CYP1A1 арил-углеводорода коррелирует с развитием рака желудка [22]. Andersson и др обнаружили, что конститутивно активированный AhR может вызывать опухоли желудка в трансгенной модели мыши [23]. В другом из наших исследований, мы обнаружили, что экспрессия AhR и ядерной транслокации были значительными выше при раке желудка, чем в предраковых поражений и нормальной слизистой оболочки желудка [24]. Тем не менее, связь между активации пути AhR и желудочном инвазии и метастазирования рака до сих пор не ясна. Таким образом, мы исследовали влияние активации пути AhR на клеток рака желудка человека. Наши данные, представленные здесь, показывают, что AhR путь может быть активирован в рака желудка AGS клеток и активации пути AhR в AGS клетках индуцирует экспрессию ММР-9 и усиливает AGS клеток миграции и инвазии активность. Кроме того, наши данные показывают, что эта активация индуцированной экспрессии AhR ММР-9 опосредуется с-Jun.
Результаты и обсуждение
активации пути AhR в клетках AGS
В другой из наших исследований, мы показали, что был высокий уровень экспрессии AhR в AGS клетках [24]. Для того, чтобы определить, является ли AhR путь может быть активирован в этой клеточной линии, мы исследовали экспрессию цитохрома Р-450 1А1 (CYP1A1), классический целевой ген AhR пути после AhR воздействия агонистов TCDD. ОТ-ПЦР и Вестерн-блот-анализ показал, что оба CYP1A1 мРНК (рис. 1А) и белок (рис. 1В) выражение в AGS клеток были увеличены в зависимости от дозы, после обработки ТХДД. Для того, чтобы определить, является ли это ГЖДТ-индуцированную экспрессию CYP1A1 является AhR-зависимой, AhR антагонист ресвератрол (RSV), был использован для блокирования AhR пути. Как показано на рис. 1C и 1D, РСВ может реверсировать экспрессию CYP1A1 TCDD индуцированных в зависимости от дозы образом. Эти данные показали, что AhR путь может быть активирован в AGS клетках ТГЖД. Рисунок 1 AhR агонист ТХДД и антагонист RSV экспрессия регулируется CYP1A11 AhR в клетках AGS. После различных концентраций (как показано выше) лечения ТХДД в течение 24 часов, (а) ОТ-ПЦР анализ экспрессии мРНК CYP1A1 в зависимости ответа от концентрации. (Б) Вестерн-блот-анализ экспрессии белка CYP1A1 в зависимости ответа от концентрации. После того, как сопутствующее лечение ТГЖД (1 нМ) и RSV (в различных концентрациях, как показано выше) в течение 24 ч, (С) экспрессии мРНК CYP1A1 определяли с помощью ОТ-ПЦР. (D) белок экспрессия CYP1A1 был обнаружен с помощью Вестерн-блоттинга.
AhR активации пути в клетках AGS индуцируют экспрессию ММР-9
Предыдущие исследования показали, что в некоторых раковых клетках, AhR подвергание агонист ГЖДТ активирует экспрессию гена ММР-9 [18, 19]. Для того, чтобы определить, является ли ГЖДТ лечение AGS клеток приводит в индукции экспрессии ММР-9, мы обнаружили мРНК ММР-9 с использованием ОТ-ПЦР после воздействия ТХДД. Как показано на фиг. 2А, экспрессия мРНК ММР-9 индуцировали в зависимости от дозы, после окончания лечения ТХДД. Для того, чтобы исследовать роль пути AhR в опосредовании ТГЖД-индуцированную экспрессию ММР-9 в клетках AGS, культуры были совместно обработаны ТХДД и антагонист ресвератрола AhR. Сопутствующее лечение ресвератрола отменена TCDD-индуцированный MMP-9 выражение (рис. 2в) показано, что ТХДД-активации экспрессии ММР-9 зависит от пути AhR. Приведенные выше данные показывают, что активация AhR пути в клетках AGS индуцирует экспрессию мРНК ММР-9. В большинстве типов клеток, ген транскрипции ММР-9 индуцируется, а после перевода фермент немедленно секретируется и активируется через механизм цистеин-переключателя [25]. Чтобы определить эти изменения в экспрессии генов после AhR затрагивающего пути результате активации в изменениях в ММР-9 ферментативной активности, мы выполнили ли желатин зимографии. Результаты показали, что ММР-9 активность в средах постепенно увеличивается с увеличением концентрации ТХДД в средствах массовой информации (рис. 2В), и эти изменения могут быть отменены лечения ресвератрола в зависимости от дозы (фиг. 2D). Эти данные свидетельствуют о том, что путь AhR Вызванные активацией увеличение экспрессии ММР-9 коррелирует с увеличением ММР-9 активности. Рисунок 2 AhR агонист ТХДД и AhR антагонист RSV регулируется ММР-9 экспрессии и активности в клетках AGS. После различных концентраций (как показано выше) лечения ТХДД в течение 24 часов, (а) ОТ-ПЦР анализ экспрессии мРНК ММР-9 в зависимости ответа от концентрации. (Б) Желатин зимографии анализ MMP-9 белковой активности в реакции на концентрацию. После того, как сопутствующее лечение ТГЖД (1 нМ) и RSV (в различных концентрациях, как показано выше) в течение 24 ч, (С) экспрессии мРНК ММР-9 был обнаружен с помощью RT-PCR. (D) Протеин активность ММР-9 была обнаружена желатиновой зимографии.
Активации пути AhR усиливает AGS клеток миграцию и инвазию
ММР-9 является одним из тип IV коллагеназы /желатиназ, которые могут ухудшить компоненты ECM. ММР-9 широко ассоциируется с опухолевой инвазии и метастазирования [17]. Исследования показали значительную корреляцию между ММР-9 и экспрессии инвазии и метастазов в лимфатических узлах желудка карцином [26-28]. Для того, чтобы изучить вопрос о AhR активации индуцированной ММР-9 экспрессии и активности в AGS клетках приводит к увеличению миграции и вторжения, мы провели ранозаживляющие анализ миграции и Transwell миграции и инвазии анализа. После обработки ТХДД, миграции клеток расстояние AGS была значительно увеличена с дозозависимым образом по сравнению с контрольными клетками (P &ЛТ; 0,01) (. Фиг.3А). Результаты Transwell показали значительное увеличение миграции (фиг.3В.) и инвазии (фиг.3С.) способности клеток AGS, когда клетки инкубировали с ТХДД в концентрациях от 0,1 нмоль /л (P ≪ 0,01) до 100 нмоль /л ( р &л; 0,01). не оказывает существенного влияния на миграцию и вторжение не было обнаружено при концентрации TCDD < 0,1 нмоль /л (р &ГТ; 0,05). Эти результаты показали, что активация AhR путь повышает рака желудка AGS клеток миграцию и инвазию. Деградация ECM и базальной мембраны является существенным шагом в опухолевой инвазии и метастазированию. Она включает в себя действия матричных металлопротеиназ (ММР). Наше исследование показало, что AhR активация пути может вызвать ММР-9 экспрессии и ферментативной активностью, а также содействовать AGS клеток миграции и инвазии. Другие исследования показали, что AhR активация пути может вызвать различные выражения ММР [19, 29]. AhR активация пути усиливает рака желудка AGS клеток миграции и вторжения могут быть также из-за другого выражения ММР помимо экспрессии ММР-9. Рисунок 3 Эффект AhR агонистов TCDD на AGS клеток миграции и вторжения. (A) Заживление ран анализа миграции. (Б) Transwell анализа миграции. (C) Transwell нашествие анализа.
С-Jun опосредованного ММР-9 экспрессия индуцируется активации пути AhR
Механизм изменения ГЖДТ-индуцированной экспрессии ММР-9 не совсем понятно. Недавние исследования сообщили, что ТХДД может индуцировать экспрессию с-Jun [30, 31] и с-июня является целевой ген AhR пути [8]; последовательность промотора в 5'-фланкирующей области человеческого гена ММР-9 содержит C-Jun сайты связывания [16] и с-Jun может индуцированный MMP-9 выражение [32]; транскрипция активность с-Jun является значительным Улучшено в раке желудка [33]. На основании этих результатов исследований, мы выдвинули гипотезу, что ТХДД-индуцированная экспрессия ММР-9 в AGS клетках, опосредованную с-Jun. Чтобы продемонстрировать эту гипотезу, мы впервые обнаружили экспрессию с-Jun в AGS клетках после лечения TCDD, и обнаружили, что оба с-Jun мРНК (рис. 4А и 4С) и белка (рис. 4В и 4D) выражение в AGS клеток были увеличены в дозе (фиг. 4А и 4В) и во времени (рис. 4С и 4D) зависимым образом после обработки ТХДД, и это ГЖДТ-индуцированную экспрессию C-Jun может быть зарезервирован AhR антагонистической ресвератрол (рис. 4E и 4F). Приведенные данные показали, что с-июня является целевой ген AhR пути в AGS клетках. Для дальнейшей демонстрации, что с-Jun может стать посредником TCDD-индуцированной экспрессии ММР-9, миРНК трансфекции проводили, чтобы заставить замолчать мРНК с-Jun в AGS клетках. Результаты показали, что с-июнь миРНК (конечная концентрация 50 нмоль /л) трансфекцию почти полностью отменили выражение C-Jun в AGS клетках как на уровне мРНК (рис. 4 г), так и в уровне белка (рис. 4H). Поэтому, после того, как C-Jun миРНК трансфекции в течение 48 часов, AGS клетки обрабатывали ТХДД в концентрации 10 нмоль /л в течение 24 ч, были собраны осадок клеток и культуральные среды, и измеряли ММР-9 экспрессии мРНК и активность. Как показано на фиг. 4I и 4J, 9-MMP экспрессию мРНК и активность в неочищенных контрольных AGS клеток были очень слабыми; После TCDD лечения (10 нмоль /л), 9-MMP экспрессию мРНК и активность были значимо возрастал; Это ТГЖД-индуцированной ММР-9 экспрессии и активности увеличение может быть отменена с-Jun миРНК трансфекции, а не под влиянием управления миРНК трансфекции. Приведенные данные показали, что с-Jun опосредованного ММР-9 экспрессию, индуцированной активации пути AhR в AGS клетках. Рисунок 4 с-Jun посредничает TCDD-индуцированной ММР-9 экспрессию и активность. (А) ГЖДТ индуцирует экспрессию с-июнь мРНК в зависимости от дозы образом. (В) ГЖДТ индуцирует экспрессию белка C-Jun в зависимости от дозы образом. (C) ТГЖД индуцирует экспрессию с-Jun мРНК в зависимости от времени. (D) ТГЖД индуцирует экспрессию белка с-Jun в зависимости от времени. (Е) RSV меняет TCDD-индуцированной экспрессии с-Jun мРНК. (F) RSV меняет TCDD-индуцированной экспрессии белка с-Jun. (G) с-Jun миРНК заглушает экспрессию мРНК с-Jun. (H) C-Jun миРНК заглушает экспрессию белка с-Jun. (I) с-Jun миРНК ингибирует экспрессию TCDD-индуцированной ММР-9 мРНК. (J) с-Jun миРНК ингибирует TCDD-индуцированный MMP-9 повышение активности.
Заключение
В заключение, данное исследование показывает, что AhR путь может быть активирован в рака желудка AGS клеток и активации пути AhR индуцирует MMP-9 выражение и деятельность, которая в конечном счете, способствует AGS миграции и вторжения в пробирке. Кроме того, наши данные показывают, что эта активация индуцированной экспрессии AhR ММР-9 опосредуется с-Jun. Поскольку деградация ECM и базальной мембраны является существенным шагом в опухолевой инвазии и метастазирования, наши результаты дают представление о механизме и функции пути AhR и его влияния на эти процессы во время прогрессии рака желудка.
Методы
Культура клеток линии клеток рака
Желудочный АГС была получена из американской коллекции типовых культур (АТСС, Rockville, MD), и поддерживали в среде RPMI 1640 (Hyclone) с добавлением 2 мМ глутамина, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone), 100 ед /мл пенициллина и 100 мкг /мл гентамицина. Клеточная среда поддерживалась на уровне 5% CO <югу> 2 и 37 ° С. Клетки собирали из экспоненциальной фазы роста и тотальной РНК и белка были получены, как описано ниже.
Обработка клеток
ТГЖД и ресвератрол были приобретены у Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, США). После инкубации в течение 24 часов клетки обрабатывали ТГЖД при различных концентрациях (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 нМ) или ТГЖД (1 нМ) плюс Ресвератрол (0, 1, 5, 10, 20 мкМ) в течение 24 часа, или обрабатывают ТХДД (1 нм) в течение различного времени (0, 1, 6, 24, 48, 72 часов) соответственно. Все препараты растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО). Контрольные клетки получали 0,1% ДМСО только.
малых интерферирующих РНК синтез
малых интерферирующих РНК (миРНК) были синтезированы и высокопроизводительную очищенный (Рибо биотехнологии, Гуанчжоу). C-Jun миРНК (чувство, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT; антисмысловые, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) и контроля миРНК (смысл, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT антисмысловой, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), не неся при этом никакой гомологии с какими-либо известными генами человека, растворяли в РНКазы DDh <суб> 2O до конечной концентрации 20 мкмоль /л.
Малые интерферирующих РНК трансфекцию
Клетки (5 × 10 5) высевали на чашки лунки шесть-луночные планшеты для культивирования клеток и дают возможность прилипать к 24 часа. Четыре микролитров Lipofectamine2000 (Invitrogen) на лунку добавляли в бессывороточной Opti MEM (Invitrogen) для конечного объема комплексообразователь 250 мкл, осторожно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут. Пять микролитров миРНК раствора на лунку, разводили 250 мкл не содержащей сыворотки Opti MEM. Смешайте разбавленный раствор миРНК и разбавленный Lipofectamine2000 осторожно, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Комплекс Lipofectamine2000 /миРНК добавляли в лунки, содержащие 1500 мкл среды RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и инкубировали в нормальных условиях культивирования клеток. Все анализы были выполнены через 48 ч. Изоляция
РНК и RT-PCR
Общая РНК клеток экстрагировали с помощью Quiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. кДНК синтезировали с 1 мкг суммарной РНК с использованием обратной транскриптазы, ReverTra AceTM (Toyobo Co, Осака, Япония) при следующих условиях: 30 ° C в течение 10 мин, 42 ° С в течение 20 мин, 99 ° С в течение 5 мин и 4 ° С в течение 5 мин. ПЦР кДНК проводили в реакционной смеси (30 мкл), содержащую 2 мкл кДНК шаблона, 2,5 мМ MgCl <суб> 2, 200 мкМ дНТФ, 0,3 мкМ праймера 1 и 2, и 1 единицу Taq ДНК-полимеразы (New England Biolabs). Амплификацию проводили с использованием следующего условия: 94 ° С в течение 5 мин с последующим 25-32 циклов (денатурации в течение 45 с при 94 ° С, отжиг в течение 30 с, и продолжается в течение 30 с при 72 ° С), а затем 72 ° С в течение 7 мин. Детали грунтовок, температуры отжига, циклов амплификации и размер ПЦР-продукта для каждого гена, приведены в таблице 1. Продукты PCR-подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием, и визуализировали с помощью ультрафиолетового (УФ) трансиллюминатор. интенсивностей полос в RT-PCR количественно определяли с помощью одного программного обеспечения Количество От анализа изображений. интенсивностей полос CYP 1A1, MMP-9 и С-Jun мРНК нормализовали с соответствующими интенсивностей полос бета-актина. Данные представлены как среднее ± SD.Table 1 Последовательности праймеров и условия ПЦР-амплификации
Gene

Грунтовки (5 '→ 3')

температура отжига (° C) завод
Циклы
Главная размер продукта (BP)

CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
A: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
ММР-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
A: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
с-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55,2
30
292
A: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
бета-актина
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
A: GCTGTCACCTTCACCGTTC
Сокращения: S, смыслового праймера; А, антисмысловой праймер
Вестерн-блот-анализ
осажденные клетки гомогенизируют в буфере для лизиса, содержащем 20 мМ HEPES, 1 мМ EGTA, 50 мМ β-глицерофосфата, ортованадата 2 мМ натрия, 10% глицерине, 1% Тритон Х- 100, 1 мМ ДТТ и 1 × Ингибитор Коктейль Протеаза (Roche, Mannheim, Германия). Лизат центрифугировали при 13000 оборотах в минуту и ​​4 ° С в течение 10 минут. Супернатант был общий клеточный лизат. Концентрацию белка измеряли с помощью анализа белка ВСА набора (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Тридцать микрограммов белка, были загружены на полосу, разделенных 10% электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и переносили на уравновешенной поливинилидендифторидную мембрану электроблотинга. Мембраны были заблокированы TBS-T-буфера, содержащего 5% (вес /объем) обезжиренного сухого молока. AhR, CYP1A1, с-Jun и бета-актина были обнаружены в течение 2 часов с использованием антител против арил-(SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, работая разведение 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, рабочее разведение 1: 500) , C-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, разведение 1 работая: 200) и бета-актина (DZ0, Cell Signaling Technology, рабочее разведение 1: 1000). После вторичного инкубации антител (рабочее разведение 1: 2000), усиленной хемилюминесценции (Pierce Biotechnology, Inc.) определяется воздействием рентгеновской пленки. интенсивностей полос в Вестерн-блоттинга были количественно с помощью одного программного обеспечения Количество От анализа изображений. интенсивностей полос CYP 1A1 и С-Jun были нормализованы с соответствующими интенсивностей полос бета-актина. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
Желатин зимографии Основной
из ГЖДТ обработанных культурах подвергали электрофорезу в SDS-PAGE, где гель содержит 0,1% (вес /объем) желатин. Гель инкубировали в течение ночи в Zn 2+ и Ca 2+, содержащей буфер, чтобы позволить ММР, чтобы восстановить их правильную структуру и ухудшать желатин в геле. Четкие белые полосы на кумасси гель свидетельствуют о ММР активности. интенсивностей полос были определены количественно с помощью One Количество программного обеспечения для анализа изображений.
ранозаживляющие анализа миграции
Для измерения миграции клеток во время заживления ран, AGS клетки высевают в отдельные лунки планшета для культуры 6-луночного. Когда клетки достигли сливающийся состояния, клеточные слои получили ранения с пластиковым наконечником микропипетки, имеющий большое отверстие. Среда и мусор отсасывали прочь и заменены 2,5 мл свежей сыворотки среде, которые содержали различные концентрации тетраХДД (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 нм). Клетки фотографировали через каждые 12 ч после ранения с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для оценки «закрытия раны," пять случайно выбранных точках вдоль каждой раны были отмечены, и измеряли расстояние по горизонтали мигрирующих клеток от первоначальной раны. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.
Transwell миграция и инвазия анализ
Обработанные или необработанные контрольные клетки были высеяны в трех экземплярах в верхней камере Transwell вставки (Corning, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США) в бессывороточной среда при плотности 1 × 10 5 на лунку. Для миграции анализов, среды, содержащей 5% сыворотки помещали в нижнюю камеру, чтобы выступать в качестве хемоаттрактанту, и клетки дополнительно инкубировали в течение 18 часов. Оседлых клетки удаляли из верхней камеры путем соскоба, а клетки, оставшиеся на нижней поверхности пластины, окрашивали с помощью 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 15 минут. Клетки подсчитывают под микроскопом. Invasion анализы проводили, как для миграции анализов, описанных выше, за исключением того, вставки предварительно покрытые с внеклеточным матриксом (ECM) заменителя Матригель (BD Biosciences) и инкубировали в течение 24-часового периода. Каждый клон высевают в трех экземплярах в каждом эксперименте, и каждый эксперимент повторяли по крайней мере, трижды. Миграция клеток (или вторжения) способность = (число клеток обработанной группы /число клеток контрольной группы) × 100%.
Примечания
Tie-Ли Пэн, Jie Chen внесли одинаковый вклад в эту работу.
Заявления
Благодарности
Эта работа была поддержана следующими грантами: гранты от Национального фонда естественных наук Китая (№ 30670949, № 30671904 и No.30871145), гранта, предоставленного для нового учителя из китайского министерства Образование (No.20070558288), грант присужден руководителю кандидатской от китайского Министерства образования (№ 20060558010), гранты от фонда естественных наук провинции Гуандун (No.5300767 и No.7001641).
первоначальных авторов представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на оригинальные файлы представленных авторов для изображений. 'Исходный файл для Рисунок 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Авторского 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff авторов исходного файла для Рисунок 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Авторского исходного файла для фигурного 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Авторского исходного файла для фигуры 4

• Анализ Условный выживаемости у корейских пациентов с раком желудка, перенесших целебной гастрэктомии
• Возможность повышения нефтеотдачи после операции в желудочной хирургии: ретроспективный study