Karakterisering av genuttryck profiler för olika typer av mastceller poolats från mus magen underregioner av ett RNA amplifieringsmetod

Karakterisering av genuttryck profiler för olika typer av mastceller poolats från mus magen underregioner av ett RNA amplifieringsmetoden Bild Sammanfattning
Bakgrund
Mastceller (MC) spelar avgörande roller vid allergi och medfödd immunitet och består av heterogena subklasser . Men fortfarande oklart den molekylära grunden att bestämma de olika egenskaperna hos dessa olika MC klasser.
Resultat
att närma sig detta, har vi utvecklat en metod för RNA-extraktion /förstärkning för intakt in vivo
MC poolade från frysta vävnadssnitt , vilket gjorde det möjligt för oss att skaffa den globala genuttryck mönster av poolade MCs tillhör samma underklass. MCs isolerades från submukosa (SMC) och slemhinnor (MMC: er) av mus magen sektioner, respektive, var 15 celler poolade, och deras RNA extraherades, amplifierades och underkastades microarray analys. Kända markörgener som är specifika för MMC och SMC visade förväntade uttrycks trender, vilket indikerar noggrannheten av analysen.
Vi identifierade 1,272 gener som visar signifikant olika uttrycksnivåer mellan SMC och MMC och klassificerade dem i kluster på grund av likheten mellan deras uttrycksprofiler jämfört med benmärgshärledda MCs, som är de odlade MCs med så kallade omogna "egenskaper. Bland dem fann vi att flera viktiga gener såsom Notch4
hade SMC-partisk uttryck och Ptgr1
hade mmc-partisk uttryck. Dessutom finns det en skillnad i uttrycket av flera gener, inklusive extracellulära matrisproteinkomponenter, adhesionsmolekyler och cytoskelettproteiner mellan de två MC subklasser, vilket kan återspegla funktionell anpassning av varje MC till den mukosala eller submukös miljön i magen.
Slutsats
Genom att använda metoden av RNA förstärkning från poolade intakta MCs, vi kännetecknas de distinkta genuttrycksprofilerna av SMC och MMC i musen magen. Våra resultat ger en inblick i eventuella oidentifierade egenskaper som är specifika för varje MC underklass.
Bakgrund
Mastceller (MCS) härrör från hematopoetiska stamceller och spelar en viktig roll i allergiska reaktioner, medfödd immunitet och försvar mot parasitinfektion. Till skillnad från andra blodkroppar, MC migrera till perifera vävnader som omogna stamceller och differentieras till mogna mastceller. En av de unika egenskaperna hos MC är att de visar en mängd olika fenotyper beroende på de olika vävnadsmikro av deras mognad [1]. I MCs, är olika MC-specifika serinproteaser lagras i sekretoriska granuler och deras gen- och proteinuttryck är dramatiskt förändras när deras cellmiljön förändras. Till exempel Reynolds et al.
Har visat att åtminstone sex distinkta medlemmar av mus MC-specifika serinproteaser är uttryckta i olika kombinationer i olika mastcellpopulationer [2]. Dessutom har nya studier visat att mogna MCs varierar i termer av vilken yta receptorer och lipidförmedlare de uttrycker [3, 4]. Eftersom varje mast cellpopulation in vivo
måste spela en viss roll i kroppen, är det viktigt att bestämma karaktären av varje population av MC.
Omfattande genexpressionsanalys är en kraftfull metod för att förstå karakterisering av olika MC subpopulationer. Hittills har flera studier på microarray analys av MC genomförts [5-7], men de flesta av dem behandlas MCs odlas in vitro
. Alternativt har genuttrycksprofilerna av MCs isolerade från huden och lungorna analyserats [3, 8-10]. Men antalet MC analyseras som ett prov var relativt hög och de utsattes för fysiska krafter, enzymer och anti-Kit antikropp för rening, under vilka de ursprungliga egenskaperna hos MC kan ha påverkats.
I mag tarmkanalen, det finns MCs som huvudsakligen klassificeras i två underklasser; mucosal MCs (MMC) och submukosala MC (SMC) på grundval av deras placering, morfologi (storlek och form) och granulat innehåll [11, 12]. MMC återfinns huvudsakligen i slemhinnan i mag-tarmkanalen, med kondroitinsulfat granulat, som är färgade med toluidinblått men inte safranin och deras aktivering sker under parasitinfektion [13], medan SMC är lokaliserade i submucosa av mag tarmkanalen och deras granulat är rika på heparin och färgades med både toluidinblått och safranin [1, 11]. Emellertid den molekylära grunden bestämning av skillnaderna i biokemiska egenskaperna hos dessa två MC subklasser är fortfarande osäker, delvis på grund av svårigheten att deras isolering.
För att övervinna dessa problem, här etablerade vi en metod för RNA-amplifiering från intakta MCs isolerades från frysta vävnadssnitt, som gör att vi kan bekvämt få den globala genuttrycket av MCs i olika vävnader. För att validera denna metod bestäms först vi det minsta antalet celler som krävs för att uppnå reproducerbar RNA förstärkning. Vi jämförde sedan de genuttrycksprofilerna erhållits från ett litet antal MMC och SMC i musen magen, och hittade flera viktiga gener som specifikt uttrycks i en underklass av MC, som kan återspegla några aspekter av olika egenskaper mellan de två MC klasser i mag-tarmkanalen.
Resultat och diskussion
utveckling av en RNA-förstärkning protokoll för att erhålla genuttrycksprofilerna från en liten mängd RNA
att få insikt i de funktionella skillnaderna mellan de olika underklasser av MC, använde vi tre omgångar av T7-baserad RNA-amplifieringsmetoden. Baserat på de preliminära experiment med användning av peritoneala MCs och benmärgshärledda MC (BMMCs), uppskattade vi att en enda MC ger 2 pg av RNA. Innan vi utförde jämförande analys av MCs från olika vävnader, första utvärderade vi exaktheten och reproducerbarheten hos tre omgångar av T7-baserad RNA-amplifieringsmetoden, som börjar med den mängd RNA som kan erhållas från en enda MC. För att bedöma detta först jämfört vi microarray resultat som erhållits från 5 mikrogram av BMMC RNA framställd genom standardprotokollet med de som erhållits från samma RNA utspädd 10 5- eller 10 6-faldigt (30 pg, 10 pg och 2 pg) och utsattes för tre omgångar av T7-baserad amplifiering (figur 1 a-c). Även om tre rundor av amplifiering gav tillräckligt mängd RNA för microarray analys (> 20

• En patient med magcancer med peritoneal karcinomatos behandlas med intraperitoneal kemoterapi som överlevde mer än 5 år att ta emot upprepade laparoskopiska undersökningar: ett fall report
• Immunisering med det immunodominanta Helicobacter suis ureas-subenhet B inducerar partiellt skydd mot H. suis-infektion i en mus model