Характеристика профилей экспрессии генов для различных типов тучных клеток объединенных из субрегионов желудка мыши с помощью РНК-амплификации method

Характеристика профилей экспрессии генов для различных типов тучных клеток объединенных из субрегионов желудка мышей с помощью метода РНК-амплификации
Аннотация
Справочная информация
Тучные клетки (MCS) играют центральную роль в аллергии и врожденного иммунитета и состоят из гетерогенные подклассов. Тем не менее, молекулярные основы определения различных характеристик этих нескольких подклассов MC остается неясным.

Результаты Чтобы приблизиться к этому, мы разработали метод экстракции РНК /амплификации неповрежденного в естественных условиях
MCs объединенном из замороженных срезов , что позволило нам получить глобальный характер экспрессии генов объединенных эмси, принадлежащих к одному подклассу. МЦ были выделены из подслизистой (SMCS) и слизистых оболочек (ММС) секций желудка мыши, соответственно, в 15 клетки собирали, и их РНК экстрагировали, усиливались и подвергали анализу микрочипов. Известные гены-маркеры, специфичные для ММС и SMCS показали ожидать экспрессии тенденции, что указывает на точность анализа.
Мы определили 1272 гены, показывающие существенно различные уровни экспрессии между SMCS и ММС, и классифицировали их в кластеры на основе сходства их профилей экспрессии по сравнению с костного мозга, полученных эмси, которые являются культивируемые МЕГАГЕРЦЫ с так называемыми «незрелых» свойствами. Среди них, мы обнаружили, что несколько ключевых генов, таких как Notch4
была СМЦ-пристрастное выражение и Ptgr1
была ММС-предвзятое выражение. Кроме того, существует разница в экспрессии некоторых генов, в том числе компонентов внеклеточного матрикса, белка, молекул адгезии и белков цитоскелета между двумя подклассами MC, что может отражать функциональную адаптацию каждого MC к слизистой оболочке или подслизистой среде в желудке.
Вывод изображения с помощью метода амплификации РНК из объединенных неповрежденных МЦ, мы охарактеризовали различные профили экспрессии генов SMCS и ММС в желудке мыши. Наши результаты предлагают представление о возможных неидентифицированных свойств, специфичных для каждого подкласса MC.
Фон
тучных клеток (MCS) получены из гемопоэтических стволовых клеток и играют важную роль в механизмах аллергических реакций, врожденного иммунитета и защиты от паразитарной инфекции. В отличие от других клеток крови, МЕГАГЕРЦЫ мигрируют в периферических тканях, как незрелых клеток-предшественников и дифференцируются в зрелые тучные клетки. Одной из уникальных особенностей МКН является то, что они показывают различные фенотипы в зависимости от различных тканей микросреде их созревания [1]. В МЦ, различные МС-специфические сериновых протеаз, хранятся в секреторных гранулах, и их экспрессия генов и белков резко меняется, когда их клеточной среды изменяется. Например, Рейнольдс и др.
Показали, что по крайней мере шесть различных членов мыши МК-специфических сериновых протеаз выражены в различных комбинациях в разных популяциях тучных клеток [2]. Кроме того, недавние исследования показали, что зрелые МЕГАГЕРЦЫ различаются с точки зрения того, что поверхностные рецепторы и липидных медиаторов они выражают [3, 4]. Поскольку каждая популяция тучных клеток в естественных условиях
должны играть определенную роль в организме, важно определить характер каждой популяции MCS.
Комплексный анализ экспрессии генов представляет собой мощный подход, чтобы понять характеристику различных MC субпопуляции. На сегодняшний день, несколько исследований по микрочипов анализа МЦ было проведено [5-7], но большинство из них рассматриваются MCs культивировали в пробирке
. В качестве альтернативы, профили экспрессии генов в МЦ выделенных из кожи и легких были проанализированы [3, 8-10]. Тем не менее, количество МЦ анализировали, как один образец были относительно высокими, и они подвергались воздействию физических сил, ферментов и анти-Kit антитела для очистки, в течение которого первоначальные свойства МЦ могут быть затронуты.
В желудочно-кишечного тракта кишечного тракта, есть МЦ, которые в основном разделяются на две подклассов; слизистых оболочек (MCS КММ) и подслизистые (MCS SMCS) на основе их местоположения, морфологии (размер и форма) и содержимое гранул [11, 12]. КММ в основном встречаются в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, имеющий хондроитин сульфат-содержащих гранул, которые окрашивали толуидиновым синим, но не Safranin, и их активация происходит во время паразитарной инфекции [13], в то время как SMCS локализованы в подслизистую желудочно-кишечного тракта кишечного тракта и их гранулы богаты гепарином и окрашивали и толуидиновым синим и сафранином [1, 11]. Тем не менее, молекулярные основы определения различий в биохимических свойствах этих двух подклассов MC остается неопределенным, частично из-за сложности их изоляции.
Чтобы преодолеть эти проблемы, здесь мы создали метод амплификации РНК из неповрежденных MCs выделенной из замороженного срезы ткани, что позволяет удобно получить глобальную картину экспрессии генов MCs в различных тканях. Для проверки этого метода, мы сначала определили минимальное количество клеток, необходимых для достижения воспроизводимой РНК амплификации. Затем мы сравнили профили экспрессии генов, полученных из небольшого числа КММ и SMCS в желудке мыши, и обнаружил несколько ключевых генов, которые будут специфически экспрессируется в одном подкласса эмси, которые могут отражать некоторые аспекты различных свойств между двумя подклассов MC в желудочно-кишечного тракта.
Результаты и обсуждение
Разработка протокола РНК амплификации, чтобы получить профили экспрессии генов из небольшого количества РНК
для того, чтобы получить представление о функциональных различиях между различными подклассов МЦ, мы использовали три раундов Т7 на основе метода РНК амплификации. На основании предварительных экспериментов с использованием перитонеального ГКС из костного мозга (MCS ВММС), мы подсчитали, что один MC дает 2 мкг РНК. Перед тем как мы провели сравнительный анализ MCs из различных тканей, мы сначала оценивали точность и воспроизводимость трех раундов Т7 на основе метода амплификации РНК, начиная с количества РНК, которые могут быть получены из одного MC. Для оценки этого, мы сначала сравнили результаты микрочипов получают из 5 мкг РНК ВММС, подготовленной по стандартному протоколу с данными, полученными из той же РНК, разбавленного 10 5- или 10 6-кратный (30 пг, 10 пг и 2 пг) и подвергали трех раундов амплификации T7 основе (рис 1а-с). Несмотря на три раунда амплификации получали достаточное количество РНК для анализа микрочипов (> 20 мкг), даже в случае 2 пг РНК, анализ график рассеяния показал, что качества полученных результатов были весьма различны между образцами от 5 мкг и 2 пг РНК. Гены оценивается как «присутствие» в обоих 30 пг и 5 мкг РНК были 8149 генов, которые соответствовали 72% генов оценивается как «присутствие» в 5 мкг РНК (11,344 генов; Рисунок 1а), в то время как только 4116 генов были оценены как «присутствие» в обоих 2 пг и 5 мкг РНК, что соответствует только 36% генов оценивается как «присутствие» в 5 мкг РНК (рис 1в). Уменьшение числа генов оценивается как «присутствие» в разбавленных образцов (30 пг, 10 пг и 2 пг) может быть связано с потерей низкого копировальной количество видов РНК в процессе амплификации. Рисунок 1 Сравнения трех круглых-амплифицированные продукты, начиная с очень небольших количеств РНК. (А-с) амплификацию с отклонениям в продуктах, начиная с небольшого количества РНК. Точечные графики интенсивности сигнала получают из 5 мкг РНК ВММС, подготовленный стандартным протоколом и от 30 пг (а
), 10 пг (б
) и 2 пг (С)
РНК ВММС подготовленного три раунда амплификации показаны. (Д, е) Воспроизводимость три этапа амплификации небольшого количества РНК в. Точечные графики интенсивности сигнала между двумя независимыми продуктами от 30 пг ВММС РНК (ВМСС 30 пг-1 и ВММС 30 пг-2) (d
) или от 2 пг ВММС РНК (ВМСС 2 пг-1 и ВММС 2 пг-2) (е
), показаны. Красные точки показывают наборы зондов оценивается как "присутствие", и желтые точки представляют собой наборы зондов оценивается как "Отсутствие" в обоих массивах. Синие точки показывают наборы зондов оценивается как «присутствие» только в любом массиве. Приведены коэффициенты корреляции (г). Те же, четырехкратные индукционные и подавления порогов обозначены как диагональными линиями. Гены, оценивается как «присутствие» помещаются в группы, соответствующие попарного трансгрессия показано на прилагаемых диаграммах Венна.
Затем мы исследовали воспроизводимости результатов микрочипов, полученных из двух наборов 30 пг образцов ВММС РНК (30 мкг-1 и 30 пг-2) или два набора образцов 2 пг (2 пг-1 и 2 пг-2) (рис 1д и 1е). В 30 пг образцов РНК, 7537 (30 пг-1) и 8777 (30 пг-2) гены были оценены как «присутствие». Тем не менее, только 4324 (2 пг-1) и 4460 (2 пг-2) гены были оценены как «присутствие» в каждой из 2 пг образца РНК, что еще раз подтверждает потерю низкого число копий РНК в процессе амплификации из небольшого количества РНК. Что касается воспроизводимости, 86% генов «присутствие» в 30 пг-1 и 74% генов, «присутствие» в 30 пг-2 образца были оценены как «присутствие» в обоих 30 пг образцов РНК, в то время как только 57 % генов «присутствие» в 2 пг-1 и 55% генов, «присутствие» в пг-2 образца 2 были оценены как «присутствие» в обоих образцах 2 пг РНК. Эти результаты свидетельствуют о том, что амплифицированные продукты из РНК из одного MC (около 2 мкг) с помощью настоящего способа могут включать в себя значительные артефакты амплификации, вызывающие проблемы в точности и воспроизводимости. С другой стороны, из-за более высокой воспроизводимости (&GТ; 74%), мы пришли к выводу, что усиление от 30 пг РНК, собранной из 15 МЦ будет пригоден для практического анализа тканей МЦ. Основываясь на этих результатах, мы ставим нашу цель в этом исследовании, чтобы приобрести профили экспрессии генов MCs объединенных из разных регионов. Для того, чтобы минимизировать влияние от клетки к клетке вариаций в пределах того же класса и потенциал усиления артефактов, мы подготовили три комплекта 15 МЦ для каждого региона и по сравнению с генами, значительно отличающейся экспрессии между МЦ из разных регионов (рис 2b). Мы выбрали желудок в качестве источника сигнала органа, так как мы можем выделить два вида эмси из слизистой оболочки (ММС) и подслизистой (ЦОА) регионах одних и тех же участков, и ММС и SMCS подозревались быть разными в нескольких свойств MC, таких как протеаза профиль экспрессии и чувствительности к Safranin окрашивания [1, 11]. Рисунок 2 профили экспрессии гена SMCS и ММС из ткани желудка. (А) Выделение толуидиновым сине-окрашенных MCs в подслизистой (ГУК, верхние панели
) и слизистую оболочку (ММС; нижние панели
) секций желудка. СМЦ (стрелка
) и ММС (стрелолист
), который был metachromatically окрашивали толуидиновым синим, прежде чем микродиссекции (слева панели
) исчезли после микродиссекции с исправлениями пипеткой (правая панели
). Бары
, 10 мкм. (Б) Схема экспериментальной стратегии. (С) Маркированный и фрагментарные антисмысловые РНК трех отдельных образцов СМТ, трех отдельных образцах ММС и «нет» клеточных образцов гибридизовали с мышиной Array. Точечные участки для 'не' ячейки (ось х) и Smc1 (ось) (верхний левый
), 'нет' ячейки (ось х) и MMC1 (ось у) (левый нижний
), Smc1 (х ось) и SMC2 (ось у) (верхний центр
), MMC1 (ось х) и mmc2 (ось у) (нижний центр
), Smc1 (ось х) и MMC1 (ось у) (верхний правый
) показаны. Коэффициенты корреляции (г) для сравнения в пределах sMC1-3, в пределах mMC1-3 и между SMCS и КММ представлены как средние значения ± S.D. Красные точки показывают наборы зондов оценивается как "присутствие", и желтые точки представляют собой наборы зондов оценивается как "Отсутствие" в обоих массивах. Синие точки показывают наборы зондов оценивается как «присутствие» только в любом массиве. То же самое, двукратные индукционные и подавления порогов обозначены как диагональными линиями.
Профили экспрессии генов подслизистой и слизистой оболочке MCs из желудка
Чтобы визуализировать два вида МЦ в желудке, не вызывая деградации РНК, Срезы фиксировали закрепителя Carnoy и metachromatically окрашивали толуидиновым синим в течение нескольких секунд. SMCS и КММ были микродиссекции с помощью патч-пипетки (рис 2а и 2b). Мы подготовили три комплекта 15 МЦ для каждого региона, экстрагируют их РНК и индивидуально усиливается их (СМЦ <суб> 1, СМТ <суб> 2, СМТ <суб> 3, и ММС <суб> 1, ММС <суб> 2, ММС <суб> 3). Для улучшения восстановления извлечения всего 30 мкг РНК, мы использовали 'поли G' в качестве носителя, который не препятствует следующей амплификации РНК или гибридизации продукта амплификации в массив (данные не показаны). Для изучения влияния неспецифически усиленных артефактными продуктов, мы выполнили процедуру экстракции РНК /амплификации без добавляя микродиссекции клеток ( "нет") клетки в качестве отрицательного контроля (описано в разделе "Материалы и методы
"). Усиленные РНК из SMCS, ММС и контроля "нет" клетки были отдельно гибридизировали с мышиной микрочипов. Значения сигнала в образце "нет" клетки были низкими в целом и похожи на фоновых уровней (рис 2С). Разброс участки образцов подготовлены независимо в пределах одной группы (например, СМЦ <суб> 1 против СМЦ <суб> 2) показал аналогичный паттерн экспрессии; средний коэффициент корреляции для всех зондов наборов был 0,945 ± 0,004 и 0,893 ± 0,019 в SMCS и КММ соответственно (п
= 3). В отличие от этого, средний коэффициент корреляции между SMCS и ММС была 0,752 ± 0,034 (п
= 3), который был значительно ниже, чем те, в пределах той же группы, что предполагает, что их экспрессии генов различны.
Мы далее оценивали точность и воспроизводимость нашего метода другими комплексного анализа (иерархический кластерный анализ и анализ главных компонентов [PCA]) с использованием всех наборов зондов. Данные, полученные из микрочипов SMCS, КММ, кожи, полученных эмси, перитонеальный MCs, ВММС и не-MCS (макрофаги и фибробласты) были применены к этим анализам. Сначала мы проверили, влияет ли процесс амплификации в нашем методе глобальный профиль экспрессии вследствие нелинейного усиления. Результаты образцов ВММС с использованием РНК, полученной с помощью стандартного протокола (ВММС-Std) или метод амплификации (ВММС-АМФ), были подвергнуты этих анализов. И иерархический анализ кластеризации и РСА показал, что микрочипов данные ВММС-Std и ВММС усилителя были сгруппированы в той же группе (рис 3a и 3b), предполагая, что глобальное сходство профилей экспрессии генов поддерживается в процессе амплификации. Далее мы исследовали сходство паттернов экспрессии в трех независимых СМЦ или ММС образцов. При кластерный анализ и PCA, СМТ <суб> 1-3 и ММС <суб> 1-3 были сгруппированы в той же группе, соответственно. PCA также показал, что профили экспрессии SMCS, ММС и ВММС попарно различны (рис 3b). Рисунок 3 Анализ экспрессии гена Глобальный СМЦ 1-3 и ММС 1-3. (А) Иерархическая кластеризация глобальной экспрессии генов различных препаратов эмси и не-MCS. Три раунда амплифицированные продукты sMC1-3, mMC1-3, кожи эмси и ВММС и стандартных продуктов ВММС, были проанализированы перитонеальные MCS, макрофаги и фибробласты. (Б) Анализ главных компонент (РСА) показывает различные профили экспрессии генов sMC1-3, mMC1-3 и двух препаратов ВММС. Синий пунктир квадрат обозначает КММ, красная пунктирная квадрат обозначает SMCS, а черный пунктир квадрат обозначает ВММС.
Затем мы сравнили полученные желудка (MCS SMCS и ММС) с кожи, полученных MCs, перитонеальный MCs, ВММС и не -MCS (макрофаги и фибробласты), сгруппировав анализа. Ткань происхождения (MCS желудка MCS и кожи MCS) были сгруппированы отдельно от перитонеального MCs и ВММС. Эти результаты могут отражать различные свойства между тканей, полученных MCs с твердой адгезии к соседним клеткам и плавающих MCs без плотного контакта. Что касается сходства MCs с фибробластами и макрофагами, разумно, что фибробласты являются наиболее удаленных от МЦ и макрофаги ближе к MCs как лейкоцитарной семьи.
Проверка результатов микрочипов с помощью анализа в реальном масштабе времени RT-PCR
Мы далее исследовали показали ли гибридизация сигналы известных генов-маркеров, специфичных для SMCS и ММС ожидаемые тенденции экспрессии [12, 14]. ММС-специфических генов, тучных клеток протеазы 1 (Mcpt1
) и 2 (Mcpt2
) показали более высокие значения в ММС, в то время как СМЦ-специфические гены-маркеры, тучных клеток протеазы 4 (Mcpt4
) и химазы 2 (CMA2
), показали более высокие значения сигнала в SMCS (Таблица 1 и Рисунок 4а) [15-29]. С другой стороны, МС-общие маркеры, такие как набор онкоген (Kit
) и Fcε рецептора (Fcer1a
) показали значительные величины сигнал без смещения между КММ и SMCS. Для дальнейшей оценки результатов, мы измерили уровни экспрессии этих генов-маркеров от реального времени RT-PCR с использованием РНК из независимо друг от друга изолированных МЦ (4б). Кроме того, мы случайным образом выбраны три гена, показывающие 'ММС-смещена' выражение и еще три гена, показывающие "СМЦ-смещена 'выражение; экспрессия этих генов в МЦ не сообщалось ранее (рисунок 4а). Там не было никаких существенных различий в уровне экспрессии Kit
и Fcer1a
между КММ и SMCS. В противоположность этому, ММС-специфических маркеров Mcpt1
и Mcpt2
и "ММС-предвзятым" генов, Anxa10, Ctse
и Fos
показали более высокую экспрессию в ММС и СМЦ специфические маркеры Mcpt4
и CMA2
и 'СМЦ-пристрастными "гены, Cnn1, Ces3
и Cpe
показали более высокую экспрессию в SMCS. Эти результаты указывают на то, что результаты микроматричные надежны и отражают профили экспрессии генов в интактных SMCS и ММС в желудке. Рисунок 4 Проверка дифференциально выраженных генов между SMCS и ММС. (А) СМЦ-специфические (CMA2
, Mcpt4
), ММС-специфические (Mcpt1
, Mcpt2
) и MC-общие маркеры (Fcer1a
и Кит
) (слева панель
) и шесть случайно выбранных генов (Ces3
, Cnn1
, CPE
, Anxa10
, Ctse
и Fos
) (правая панель
) указаны в представительском разброс корреляции графов между Smc1 и MMC1. То же самое, двукратные индукционные и подавления пороги показаны в виде желтого, синего и красной линии, соответственно. (Б) Уровни экспрессии генов в (а), были проверены в режиме реального времени RT-PCR. Значения представляют отношение относительных уровней экспрессии КММ к SMCS, и показаны как среднее значение ± S.D. (П = 3). Специфичность продукта ПЦР была подтверждена с помощью электрофореза и анализа температуры плавления геля. Уровень экспрессии каждого гена была нормирована на 28S рибосомальной РНК.
Таблица 1 Сводка генов, исследованных в режиме реального времени ПЦР-анализа.
Джин Символ

Джин Название

RefSeq Стенограмма ID
справочнике

Kit

комплект онкоген
NM_021099
15
Fcer1a

Fc фрагмент IgE, высокое сродство I, рецептор альфа полипептида
NM_010184
16
Mcpt1

тучных клеток протеазы 1
NM_008570
17, 18 <бр> Mcpt2

тучных клеток протеазы 2
NM_008571
19
Mcpt4

тучных клеток протеазы 4
NM_010779
2, 20
CMA2 <бр>
химазы 2, тучных клеток (тучных клеток протеазы 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10

аннексина A10
NM_011922
21
Ctse <бр>
катепсина E
NM_007799
22
Fos

FBJ остеосаркома онкоген
NM_010234
23
Ptgr1

простагландин редуктазы 1 (лейкотриенов B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (свиная)
Cnn1

calponin 1
NM_009922
25
Ces3

карбоксилэстеразы 3 <бр> NM_053200
26
CPE

карбоксипептидазы E
NM_013494
27 (крупного рогатого скота)
Notch4

Notch гена гомолога 4
NM_010929
28
28S рРНК
28S рибосомальной РНК
NR_003279
29
*, последовательность кодирования в данной работе является N-конец усеченного форма CMA2
, в то время как RefSeq " NM_001024714 "является полная последовательность CMA2
.
кластеризация анализ профилей экспрессии генов и функциональной категоризации между SMCS и ММС
генов в ~ 12000, представленных в массиве олигонуклеотида, мы выбрали 1272 генов, уровни экспрессии между СМЦ <суб> 1-3 и ММС <суб> 1-3 значительно отличались (р
&л; 0,05, т тест Limma профиль |). Уровень экспрессии каждого гена нормализовали по уровню в ВММС, который культивируют МЕГАГЕРЦЫ с так называемыми «незрелых» свойствами, а выбранные гены были разделены на семь кластеров с помощью K
-средних алгоритм кластеризации (CL1-7; Рисунок 5а и Дополнительный файл 1). Мы также классифицировал гены в функциональные категории, а также представительные гены перечислены (рисунок 5б). Среди них, 666 генов (52,4%) показали СМЦ-пристрастное выражение (CL1-3
); в 78% (519 генов) из листового формовочного богатых генов, уровни экспрессии были относительно низкими в ВММС и дополненной в СМЦ (CL1 &Amp; 2
). Например, уровень экспрессии Mcpt4
была относительно низкой в ​​ВММС, и если выражение профиля ВММС отражает незрелых свойства MC клеток-предшественников, Mcpt4
можно сделать вывод, индуцированным во время окончательного созревания в SMCS. Интересно, что гены-маркеры СМЦ Mcpt5
и Mcpt6
были разделены на CL2 /3
, предполагая, что эти гены были выражены в какой-то степени в «незрелых» ВММС, но выражение их было подавлено во время созревания в ММС. С другой стороны, 606 генов (47,6%) показали, ММС смещенным выражение (CL4-7
); в 51% (334 генов) ММС-богатых генов, их уровни экспрессии в ВММС были низкими, но были увеличены в ММС (CL4 &Amp; 5
). Например, экспрессия Mcpt1
была низкой в ​​«незрелых» ВММС но резко индуцируется во время созревания в ММС. Рисунок 5 Кластеризация анализ профилей экспрессии генов между SMCS и ММС. (А) представление уровней экспрессии мРНК sMC1-3 и mMC1-3 по сравнению с ВММС. Цвет баров представляет собой отношение интенсивности сигнала между независимых выборок и ВММС, в соответствии со шкалой, показанной на верхнем правом
. Гены с существенно различным выражением между SMCS и ММС (р
&ЛТ; 0,05, т
тест Limma в) были выбраны (1,272 генов), и подразделяются на 7 кластеров с использованием K
-средних алгоритм (CL1-7
). (Б) Функциональная категоризация представительных генов (а).
Экспрессии белка из Notch4 в SMCS и Ptgr1 в ММС в ткани желудка
Среди генов, показывающих дифференциальное выражение (5б), мы также сфокусированы на выражении Notch4
в SMCS и Ptgr1
в ММС, оба из которых никогда ранее характеризуется в МЦ. В Notch4
генный продукт является членом семейства Notch, состоящий из трансмембранных рецепторов, которые активируются с помощью клеточной поверхности лигандов на соседних клетках. Недавние исследования показали, что передача сигналов Notch участвует в лимфоцитов и тучных дифференцировки клеток [30, 31]. Сначала мы подтвердили, что Notch4
выражение значительно выше в отдельно объединенных SMCS чем ММС по реального времени RT-PCR (данные не показаны). Далее мы исследовали, может ли это исключительно присутствует в SMCS иммунным окрашиванием ткани желудка (рис 6а) белок Notch4. Notch4 сигналы были обнаружены в ядре-подобных структур SMCS, но не в тех КММ. Кроме того, Notch4 сигналы были также найдены в МЦ кожи, которые были смежно сгруппированных с SMCS (рис 3а). Эти результаты показывают, что Notch4 присутствует в SMCS, но не в ММС, и предполагают, что Notch4 участвует в СМЦ-специфической транскрипции Notch-генов-мишеней, которые могут потребоваться для некоторых функций СМЦ. В гемопоэтических клетках, было сообщено, что конститутивно Notch4 способствует расширению клеток-предшественников и ингибирует дифференциацию миелоидных клеток [32]. Так как лиганды Notch было показано, что существуют в соединительной ткани, такие как дермы кожи [33], то это будет интересно исследовать, играет ли Notch4 роль в дифференциации SMCS и поддержания функций СМЦ. Рисунок 6 иммуногистохимический анализ Notch4 и Ptgr1 в SMCS и ММС в ткани желудка. (А) Желудок подслизистая (SMCS; левые панели
), слизистую оболочку желудка (КММ, средние панели
) и кожи (MCS кожи; правая панели
) срезы окрашивали анти-Notch4 антителом (нижние панели
) и с толуидиновым синим (верхние панели изображения). SMCS окрашивали анти-Notch4 антителом в желудочном подслизистой основы и кожи дермы обозначены стрелками. Нет окрашивания не наблюдалось в ММС (Arrowheads
), локализованных в слизистой оболочке желудка. SMCS и КММ были metachromatically окрашивали толуидиновым синим. (Б) Желудок подслизистой (SMCS; левые панели
) и слизистую оболочку желудка (ММС, правая панели
) срезы окрашивали антителами против Ptgr1 (нижние панели
) и толуидиновым синим (верхние панели
). Ни один окрашивание с антителом анти-Ptgr1 не было найдено в SMCS (стрелка
). Малые сигналы наблюдались в ММС (наконечники стрел
). SMCS и КММ были metachromatically окрашивали толуидиновым синим. Бары
, 25 мкм (а, б).
Ptgr1
продукт, 15-оксо-простагландина 13-редуктазы /лейкотриенов (LT) B <суб> 4 12-hydroxydehydrogenase является одним из важнейших ферментов для инактивации эйкозаноидов, таких как простагландин Е <суб> 2 (PGE <суб> 2) и LTB <суб> 4 [34]. Хотя сообщалось, что проводники синтеза эйкозаноидов отличаются среди различных подклассов MC [1, 4], наши результаты свидетельствуют о том, что инактивацию система эйкозаноидов также варьирует среди подклассов MC. Ptgr1
выражение было установлено, что значительно выше, в отдельно объединенных КММ по реальном времени RT-PCR (данные не показаны). Мы также исследовали экспрессию Ptgr1 в секциях желудка иммунным окрашиванием. Сигналы для белка Ptgr1 были обнаружены в гранулярных подобных структур КММ в слизистой оболочке желудка, но не в SMCS (Фиг.6В), предполагая, что фермент Ptgr1 может быть освобожден от КММ на дегрануляции. Так как PGE <суб> 2 пьесы критически важную роль в поддержании кишечной гомеостаза через защиту слизистых оболочек и ингибирование секреции кислоты, то возможно, что при активации ММС негативно регулирует Цитопротекторное действия PGE <суб> 2 путем быстрой инактивации Ptgr1.
экспрессии генов внеклеточного матрикса компонентов, молекул адгезии и белков цитоскелета в SMCS и ММС
MC фенотипы было показано, что зависит от их взаимодействия с окружающими внеклеточного матрикса (ЕСМ) и соседних клеток [1]. Одним из самых замечательных результатов в этом исследовании является различие в экспрессии генов компонентов ECM белков, молекул адгезии и белков цитоскелета, которые могут отражать функциональную адаптацию каждого типа MC в окружающую среду через слизистую оболочку или подслизистого в желудке (рис 5б) , КММ экспрессируют гены слизистой оболочке специфических белков ЕСМ, такие как MUC1
(муцин) и Tff1
(трилистник фактор), в то время как SMCS экспрессируют гены обычных ECM белков, таких как Col4a
(проколлагена) и Lama2
(ламинин). Кроме того, SMCS экспрессируют гены молекул адгезии, таких как ALCAM
и VCAM-1
и гены для обычных белков цитоскелета, таких как Acta2
(актин), в то время как ММС выразить десмосома компонентные гены, такие как DSC2
( desmocollin) и Dsg2
(Desmoglein), и гены кератина промежуточных филаментов, таких как Krt8
и Krt19
. Десмосомы, как сообщалось, в желудке эпителий [35], и было установлено, что десмосома-подобные структуры обнаружены в определенном типе MC [36]. Таким образом, возможно, что КММ взаимодействуют с прилегающей эпителиев через десмосом адгезии в желудке. В противоположность этому, SMCS по всей видимости, взаимодействуют с соседними клетками посредством молекул адгезии, таких как VCAM-1, ALCAM и VE-кадгерин (VCAM-1
, Alcam1
и Cdh5
). Так как эти молекулы адгезии, как было показано, участвуют в динамической регуляции актинового цитоскелета [37, 38], такая молекула-опосредованного взаимодействия с подслизистых клетками может иметь решающее значение для поддержания функциональных и морфологических свойств SMCS. Действительно, следует отметить, что большинство SMCS изменчивы по форме, и часто растягиваются и обмоткой по сравнению с ММС [1].
Заключение
Мы разработали способ амплификации РНК из объединенных интактных МЦ, выделенных из замороженной ткани секций, что позволяет удобно получить глобальный паттерн экспрессии генов MCs из различных тканей, органов и видов, включая человека. Используя этот метод, мы показали, впервые различающиеся профили экспрессии генов подслизистой и слизистой оболочке MCs в желудке мыши. .
Следующие материалы были получены из источников Наши результаты дают представление возможных неидентифицированных свойств, специфичных для каждого подкласса MC
методов
Материалы показали: очищенную с помощью ВЭЖХ T7- (дТ) <суб> 24 праймер [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) <суб> 24] от GE Healthcare UK Ltd. (Бакингемшир, Англия), РНКазы вода, дНТФ, SusperScript II, кишечная палочка
(E.coli
) РНКазы Н, Е . палочка
ДНК-полимеразы I, E. Coli
ДНК лигазы Т4 ДНК-полимеразы и случайные гексамеры из Invitrogen (San Diego, CA), ингибитор РНКазы, гликоген и MEGAscript T7 комплект из Ambion (Austin, TX). BALB /C мышей, были получены из JapanClea (Хамамацу, Япония). Данное исследование было одобрено Комитетом по исследованиям животных Киотского университета Высшая школа фармацевтических наук по. Амплификации
РНК и олигонуклеотид Microarray
Mouse интерлейкин-3-зависимые ВММС получали, как описано ранее [39].

• Пациент с раком желудка с перитонеального карциноматозом обрабатывали внутрибрюшинной химиотерапии, котора…
• Иммунизация с иммунодоминантном Helicobacter суис уреазы субъединицей B индуцирует частичную защиту от инфекции H.…