Jellemzése génexpressziós profilokat különböző típusú hízósejtek egyesítjük egér gyomor alrégiók által egy RNS amplifikációs method

jellemzése génexpressziós profilokat különböző típusú hízósejtek egyesítjük egér gyomor alrégiók által egy RNS amplifikációs módszer
Abstract
Háttér
hízósejtek (MC) sarkalatos szerepet játszanak az allergiás és a veleszületett immunitás esetében, és heterogén alosztályok. Azonban a molekuláris alapját meghatározó különböző jellemzőit, ezeket a többszörös MC alosztályok tisztázatlan marad. Katalógusa Eredmények
megközelíteni ezt, kifejlesztettünk egy módszert RNS extrakció /erősítés ép in vivo katalógusa MCs gyűjtöttünk fagyasztott szöveti metszeteken , amely lehetővé tette számunkra, hogy a globális génexpressziós mintázatát egyesített MC egyazon alosztály. MC izoláljuk a submucosa (SMC-k) és a nyálkahártyák (MMC) az egér gyomor szakaszok rendre 15 sejteket összegyűjtöttük, és azok RNS-t extraháltunk, erősített és alá kell microarray. Ismert marker gének specifikus MMCS és SMC-kben mutatott várható kifejezés tendenciák, jelezve, pontosság az elemzés.
Azonosítottunk 1272 géneket mutatja jelentősen eltérő expressziós szint között SMC-k és MMC, és osztályozott őket klaszterek alapján hasonlósága azok expressziós profilok összehasonlítva a csontvelőből származó MC, amelyek a tenyésztett MC úgynevezett "éretlen" tulajdonságait. Ezek közül azt találtuk, hogy több kulcsfontosságú gének, mint például Notch4
volt SMC előfeszített expresszió és Ptgr1
volt MMC-előfeszített kifejezést. Továbbá van egy különbség a kifejezés számos gén, beleértve az extracelluláris mátrix fehérje komponensek, adhéziós molekulák, valamint citoszkeletális fehérjék a két MC alosztályok tartoznak, amelyek tükrözik a funkcionális adaptáció az egyes MC a nyálkahártya vagy nyálkahártya alatti környezetben a gyomorban.
Következtetés
módszerével RNS amplifikációs poolozott ép MCS jellemeztük az elkülönülő génexpressziós profilokat SMC-k és MMCS az egér gyomorban. Eredményeink kínálnak betekintést lehetővé azonosítatlan tulajdonságokkal specifikusak az egyes MC alosztálya. Katalógusa Háttér katalógusa hízósejtek (MC) származnak vérképző őssejtek és fontos szerepet játszanak az allergiás reakciók, veleszületett immunitás és a védelem ellen parazita fertőzés. Eltérően más vérsejtek, MC vándorolnak perifériás szövetekben éretlen progenitor és differenciálódnak érett hízósejtek. Az egyik egyedi jellemzőit MCS az, hogy mutatják a különböző fenotípusok függően különböző szöveti mikrokörnyezetében azok érését [1]. MCS, különböző MC-specifikus szerin-proteázok vannak tárolva a szekréciós granulátumok, és azok gén és fehérje kifejezések drámaian megváltozott, amikor a cella környezetet is módosul. Például, Reynolds et al.
Kimutatták, hogy legalább hat különböző tagjai egér MC-specifikus szerin-proteázok vannak kifejezve különböző kombinációkban különböző hízósejt populációk [2]. Emellett az újabb vizsgálatok kimutatták, hogy az érett MC változhat szempontjából milyen felületi receptorok és a lipid mediátorok kifejezik a [3, 4]. Mivel minden egyes hízósejt populáció in vivo
kell különleges szerepet játszanak a szervezetben, fontos, hogy meghatározzák a karakter minden egyes populáció MCS.
Átfogó génexpressziós analízis egy erőteljes megközelítés, hogy megértsék a jellemzésére különféle MC alcsoportokban. Eddig számos tanulmány microarray MCS végeztek [5-7], de a legtöbbjük foglalkozott MCs in vitro tenyésztett katalógusa. Alternatív módon, a génexpressziós profilok MCS izolált bőr és a tüdő elemezték [3, 8-10]. Azonban, a számok az MC elemzett, mint az egyik minta viszonylag magas volt, és ki vannak téve a fizikai erők, enzimek és az anti-Kit antitesttel tisztítás, amelynek során az eredeti tulajdonságait a MC kihathattak.
A gasztrointesztinális traktus, vannak MCs, amelyek főleg sorolt ​​két alosztályra; nyálkahártya MCs (MMC) és a nyálkahártya alatti MC (SMC) alapján azok helyét, a morfológia (méret és forma) és granulátum tartalma [11, 12]. MMCS elsősorban megtalálható a nyálkahártya a gyomor-bél rendszer, amelynek kondroitin-szulfát-tartalmú szemcsék, amelyek toluidinkékkel festettük, de nem safranint, és ezek aktiválás során fordul elő parazita fertőzés [13], míg a simaizomsejtek lokalizálódik a submucosa a gasztrointesztinális traktus és granulátumok gazdag heparin és megfestettük mind toluidin kék és szafranin [1, 11]. Azonban a molekuláris alapját meghatározó különbségek biokémiai tulajdonságai ezen két MC alosztályok továbbra is bizonytalan, részben annak köszönhető, hogy nehéz az izolálás.
Ezen nehézségek, itt létre egy módszert RNS amplifikációs intakt MC izolált fagyasztott szöveti metszeteken, amely lehetővé teszi, hogy kényelmesen megkapjuk a globális génexpressziós mintázat MCS különböző szövetekben. Érvényesíteni ezt a módszert, először meghatároztuk a minimális sejtszám eléréséhez szükséges reprodukálható RNS amplifikációs. Ezután összehasonlítottuk a génexpressziós profilokat nyert kisszámú MMCS és SMC-k az egér gyomorban, és megállapította, több kulcsfontosságú gének specifikusan kifejezve egyik alosztály MCS, amely lehet tükrözik néhány szempontból a különböző tulajdonságok a két MC alosztályokat a gyomor-bél traktus. katalógusa Eredmények és megbeszélés katalógusa kifejlesztése RNS amplifikációs protokollt, így génexpressziós profilokat kis mennyiségű RNS katalógusa, hogy betekintést nyerjünk a funkcionális különbségeket a különböző alosztályok az MC, mi foglalkoztatott három fordulóban a T7-alapú RNS amplifikációs módszerrel. Alapja az Előzetes kísérletek peritoneális MC és a csontvelő-eredetű MC (BMMCs), úgy becsültük, hogy egyetlen MC hozamok 2 pg RNS. Mielőtt elvégeztük összehasonlító elemzése MCS a különböző szövetekből, először értékeltük a pontosságát és reprodukálhatóságát három fordulóban a T7-alapú RNS amplifikációs módszer, kezdve az összeg RNS lehet beszerezni egy MC. Annak megállapítására, ezt, először összehasonlítottuk a microarray kapott eredményeket 5 ug BMMC RNS által készített a standard protokoll azokkal nyert azonos RNS hígított 10 5- vagy 10 6-szeres (30 pg, 10 pg és 2 pg), és vetjük alá három fordulóban a T7-alapú amplifikáció (1a ábra-C). Bár a három fordulóban amplifikációs engedett elég mennyiségű RNS microarray (> 20 ug), még abban az esetben 2 pg RNS szórásdiagramon elemzés feltárta, hogy a tulajdonságok a kapott eredmények meglehetősen különböző minták között 5 ng és 2 pg RNS. A gének ítéljük "jelenlét" mind a 30 pg és 5 ug RNS volt 8149 gének, amelyek megfeleltek 72% gének ítéljük "jelenlét", az 5 ng RNS-t (11.344 gének; 1a ábra), míg csak 4116 gének találták "jelenlét" mind a 2 pg és 5 ug RNS, amely megfelelt a csupán 36% -a gének ítéljük "jelenlét", az 5 ng RNS-t (1c ábra). A csökkenés a gének száma megítélni, mint "jelenlét" a hígított minta (30 pg, 10 pg és 2 pg) lehet az oka a veszteséget a kis kópiaszámú RNS amplifikáció során. 1. ábra Az összehasonlítást három kerek amplifikált termékek kezdve nagyon kis mennyiségű RNS-t. (A-C) amplifikáció torzítások a termékek Kiindulva egy kis mennyiségű RNS-t. Pontdiagramokat jelintenzitás kapott 5 ug BMMC RNS által készített a standard protokoll és 30 pg (a
), 10 pg (B
) és 2 pg (C
) a BMMC RNS által készített három fordulóban erősítés látható. (D, E) reprodukálhatóság a három kör amplifikációja kis mennyiségű RNS-t. Pontdiagramokat jelintenzitás két egymástól független termékek 30 ug BMMC RNS (BMMC 30 pg-1 és BMMC 30 pg-2) (d katalógusa), vagy a 2 ug BMMC RNS (BMMC 2 pg-1 és 2 BMMC pg-2) (e katalógusa), jelennek meg. A piros pontok mutatják próba készletek ítéljük a "jelenlét", és sárga pontok jelentik próba készletek ítéljük "hiánya" mindkét tömbök. A kék pontok mutatják próba készletek ítéljük a "jelenlét" csak mindkét tömbben. A korrelációs együtthatók (r) mutatjuk be. Ugyanez, négyszeres indukció és elnyomás küszöbértékek vannak megadva, átlós vonalak. Gének ítéljük a "jelenlét" kerülnek csoportok megfelelő páronként átfedés a mellékelt ábra szerinti Venn diagramok. Katalógusa Mi mellett vizsgálta a reprodukálhatósága microarray eredmények nyert két 30 pg BMMC RNS minták (30 pg-1 és 30 pg-2) vagy két 2 pg mintát (2 pg-1 és 2 pg-2) (1D és 1E). A 30 pg RNS minták, 7537 (30 pg-1) és 8777 (30 pg-2) gén találták 'jelenlét'. Azonban csak 4324 (2 pg-1) és 4.460 (2 pg-2) gén találták 'jelenlét' minden 2 pg RNS-minta, ismét arra utal, a veszteség a kis kópiaszámú RNS amplifikáció során egy kis mennyiségű RNS-t. Ami a reprodukálhatóság, 86% a "jelenlét" gének a 30 pg-1 és 74% -a "jelenlét" gének a 30 pg-2 minta találták "jelenlét" mind a 30 pg RNS, míg csak 57 % a "jelenlét" gének a 2 pg-1 és 55% -a "jelenlét" gének a 2 pg-2 minta találták "jelenlét" mind a 2 pg RNS. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az amplifikált termékeket az RNS egyetlen MC (körülbelül 2 pg) a jelenlegi eljárás magában foglalhatja jelentős amplifikációs műtermékek problémákat okoz a pontosság és a reprodukálhatóság. Másrészt, mivel a magasabb reprodukálhatóság (> 74%), arra a következtetésre jutottunk, hogy az amplifikáció 30 pg RNS-t gyűjtöttünk 15 MC alkalmas lenne a gyakorlati elemzése a szöveti MCS-ben. Ezen eredmények alapján, mi meg a cél ebben a tanulmányban, hogy megszerezzék génexpressziós profilokat MC gyűjtöttünk különböző régiókban. Ahhoz, hogy minimálisra csökkentsék a befolyása a sejt-sejt belüli eltérések az azonos osztályba tartozó és a potenciális amplifikációs műtermékek, készítettünk három 15 MC minden egyes régió, és összehasonlítottuk a gének jelentősen különböző expressziós között MC a különböző régiók (2b ábra). Azért választottuk a gyomor, mint a forrás szerv, mivel tudjuk izolálni kétféle MCS a nyálkahártya (MMC), és a nyálkahártya alatti (SMC) régiói azonos szakaszok, és MMC és SMC-kben is feltételezték, hogy a különböző, több MC tulajdonságok, mint például proteáz expressziós profil és az érzékenység szafranin festés [1, 11]. 2. ábra génexpressziós profilokat SMC-k és MMCS gyomor szövetet. (A) izolálása toluidin kékkel festett MC a nyálkahártya alatti (SMC; felső panelek katalógusa), valamint a nyálkahártya (MMC alsó panelek katalógusa) a gyomor szakaszok. SMC (nyíl katalógusa) és MMC (nyílhegy katalógusa), amelyet metachromatically toluidine kék előtt mikrodisszekcióban (bal panel
) eltűntek után mikrodisszekcióban egy patch pipettával (jobb panelek katalógusa). Bárok
, 10 jim. (B) vázlata kísérleti stratégia. (C) A jelölt és töredékes antiszensz RNS-három egyéni SMC-mintából, három egyéni MMC minták és a "nem sejt" mintákat hibridizáltuk Rágcsáló Array. Pontdiagramokat a "nem sejt" (x tengely) és sMC1 (y tengely) (bal felső katalógusa), "nem sejt" (x tengely) és mMC1 (y tengely) (bal alsó katalógusa), sMC1 (x tengely) és sMC2 (y tengely) (felső középső katalógusa), mMC1 (x tengely) és mmc2 (y tengely) (alsó középső katalógusa), sMC1 (x tengely) és mMC1 (y tengely) (jobb felső
) jelenik meg. A korrelációs együtthatók (R) az összehasonlítás belül sMC1-3 belül mMC1-3 közötti és SMC-kben és MMCS van bemutatva átlagérték ± S.D. A piros pontok mutatják próba készletek ítéljük a "jelenlét", és sárga pontok jelentik próba készletek ítéljük "hiánya" mindkét tömbök. A kék pontok mutatják próba készletek ítéljük a "jelenlét" csak mindkét tömbben. Ugyanez a két-szeres indukció és szuppresszió küszöbértékeket feltüntetve, átlós vonalak.
Génexpressziós profilokat nyálkahártya alatti és nyálkahártya MC a gyomorból
megjelenítéséhez kétféle MCS a gyomorban anélkül RNS-lebomlás, a szakaszok voltak fixáltuk Carnoy fixáló és metachromatically toluidinkékkel festettük néhány másodpercig. SMC és MMCS arra mikrodisszektált folt alkalmazásával pipettával (ábra a 2a és 2b). Készítettünk három 15 MCs minden egyes régió, kivont RNS és egyedileg erősített őket (SMC 1, SMC 2, SMC 3, és az MMC 1, MMC 2, MMC 3). Hogy javítsa a helyreállítási a kitermelése mindössze 30 pg RNS, használtuk 'poli G', mint egy hordozó, amely nem zavarja a következő RNS-amplifikációs vagy hibridizációs Az amplifikált terméket a tömb (az adatokat nem mutatjuk be). Hatásainak vizsgálata a nem specifikusan amplifikált tárgy termékek végeztünk az RNS kivonása /amplifikációs eljárás anélkül mikrometszett sejtek ( "nem sejt") negatív kontroll (lásd: "Anyagok és módszerek
"). Az amplifikált RNS SMC, MMC és a "nem sejt" vezérlés külön-külön hibridizáltuk egér microarray. A jel értékeket a "nem sejt" mintában általában alacsony, és a háttérhez hasonló szinten (2c ábra). A pontdiagramot minták önállóan készített egy másik csoportba tartozó (például SMC 1 vs SMC 2) mutatott hasonló expressziós mintázat; az átlagos korrelációs együttható az összes próba-készlet volt 0,945 ± 0,004 és 0,893 ± 0,019 a SMC-kben és MMC volt (N
= 3). Ezzel szemben az átlagos korrelációs együttható között simaizomsejtek és MMC volt 0,752 ± 0,034 (n
= 3), amely sokkal alacsonyabb volt, mint az ugyanazon csoportba tartozó, ami arra utal, hogy a gén expressziója minták különböző.
Mi tovább értékeltük pontossága és reprodukálhatósága a módszer egyéb átfogó elemzések (hierarchikus klaszterezést analízis és a főkomponens analízis [PCA]) segítségével az összes próba készletek. Microarray adatok nyert SMC, MMC, bőr eredetű MCs, hashártya MC, BMMCs és nem MC (makrofágok és fibroblasztok) vittük fel ezeket az elemzéseket. Először ellenőrizzük, hogy az amplifikációs folyamat a mi módszer befolyásolja a globális expressziós profil miatt nem lineáris amplifikáció. Az eredmények a BMMC mintákból RNS-t állítunk elő a standard protokoll (BMMC-STD), vagy az amplifikációs módszerrel (BMMC-AMP) vetettük alá ezeket az elemzéseket. Mindkét hierarchikus klaszterezést elemzés és PCA feltárta, hogy microarray adatok BMMC-STD és BMMC-AMP csoportosítottuk az azonos csoportba (ábra 3a és 3b), ami arra utal, hogy a globális hasonlóság génexpressziós profilok esetén megmarad az amplifikációs folyamat. Mi a következő vizsgált hasonlósága expressziós mintázat három független SMC vagy MMC mintákat. Amikor csoportosítás elemzés és PCA, SMC 3/1 és MMC 1-3 csoportosultak az azonos csoportba, ill. PCA is kimutatta, hogy az expressziós profilok SMC-k, MMC és BMMCs kölcsönösen különböző (3b ábra). 3. ábra A globális génexpressziós elemzésben a SMC 1-3 és az MMC 1-3. (A) A hierarchikus klaszterezés globális génexpressziós különböző készítmények MC és nem MC. Három forduló amplifikált termékek sMC1-3, mMC1-3, bőr MC és BMMCs, és a standard termékek BMMCs, hashártya MC, makrofágok és fibroblasztok elemezték. (B) A főkomponens analízis (PCA) feltárja a különböző génexpressziós profilokat sMC1-3, mMC1-3, és két készítmények BMMCs. A kék pontozott négyzet jelzi MMC, a piros pontozott négyzet jelzi SMC, és a fekete szaggatott négyzet jelzi BMMCs. Katalógusa Ezután képest a gyomor-eredetű MC (SMC és MMC) bőrrel származó MC, hashártya MC, BMMCs és nem -MCs (makrofágok és fibroblasztok) által létrejövő elemzés. A szöveti eredetű MCs (gyomor MCs és bőr MC) csoportosultak külön peritoneális MCs és BMMCs. Ezek az eredmények tükrözik a különböző tulajdonságok között szöveti eredetű MCs cég tapad a szomszédos cellák és a lebegő MC nélkül is szoros kapcsolatot. Ami a hasonlóság MCS a fibroblasztok és a makrofágok, indokolt, hogy a fibroblasztok legtávolabb MC és makrofágok közelebb vannak az MCS mint egy leukocita család.
Validálása microarray eredmények valós idejű RT-PCR analízis
Mi következő vizsgáltuk, hogy a hibridizációs jeleket ismert marker gének specifikus SMC és MMC, a várakozásnak kifejezés trendek [12, 14]. Az MMC-specifikus géneket, hízósejt-proteáz-1 (Mcpt1
) és 2 (Mcpt2
) azt mutatták, magasabb értékeket MMCS, míg az SMC-specifikus marker gének, hízósejt-proteáz-4 (Mcpt4
) és kimáz 2 (Cma2 katalógusa), magasabb volt a jel értékeket SMC (1. táblázat és 4a ábra) [15-29]. Másrészt, az MC-közös markerek, mint a készlet onkogént (Kit
) és az Fc ER-receptor (Fcer1a
) mutatott szignifikáns jelek értéke nincs torzítás között MMCS és SMC-kben. Ahhoz, hogy tovább értékelni az eredményeket, mértük az expressziós szintjét ezeknek a marker gének real-time RT-PCR segítségével RNS-t az egymástól függetlenül izolált MC (4b ábra). Sőt, véletlenszerűen kiválasztott három géneket "MMC előfeszített" kifejezés és a másik három géneket "SMC előfeszített" kifejezés; Az ilyen gének expressziójának MCS még nem számoltak be korábban (4a ábra). Nem volt szignifikáns különbség a kifejezés szintjén Kit katalógusa és Fcer1a katalógusa között MMC és SMC. Ezzel ellentétben, az MMC-specifikus markerek Mcpt1 katalógusa és Mcpt2 katalógusa és az "MMC-elfogult" gének, Anxa10, Ctse katalógusa, és Fos katalógusa szintén magasabb expressziót MMC, és az SMC-specifikus markerek Mcpt4 katalógusa és Cma2 katalógusa, és a "SMC-elfogult" gének, cnn1, Ces3 katalógusa, és CPE katalógusa szintén magasabb expressziót SMC. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a mikroarray eredményeinek megbízható, és tükrözik a génexpressziós profilokat intakt SMC-k és MMCS a gyomorban. 4. ábra validálása differenciáltan expresszálódó gének között SMC és MMC. (A) SMC-specifikus (Cma2 katalógusa, Mcpt4 katalógusa), MMC-specifikus (Mcpt1 katalógusa, Mcpt2 katalógusa), az MC-common markerek (Fcer1a katalógusa és Kit katalógusa) (bal panel katalógusa) és hat véletlenszerűen kiválasztott gének (Ces3 katalógusa, cnn1 katalógusa, CPE katalógusa, Anxa10 katalógusa, Ctse katalógusa és Fos katalógusa) (jobb panel katalógusa) jelzi a reprezentatív szórás összefüggést ábrázolja között sMC1 és mMC1. Ugyanez a két-szeres indukció és szuppresszió küszöbértékek vannak feltüntetve, mint a sárga, kék és piros vonal, ill. (B) Az expressziós szintje a gének (a) igazoltuk real-time RT-PCR-rel. Az értékek aránya relatív expressziós szintjének MMCS az SMC-k, és mutatjuk átlag ± S.D. (N = 3). A sajátossága a PCR termék igazoltuk gélelektroforézis és elemzése az olvadási hőmérséklet. Az expressziós szintjét az egyes gének normalizáltuk 28S riboszóma RNS. Katalógusa 1. táblázat gének által vizsgált real-time PCR analízis. Katalógusa Gene Symbol katalógusa
Gene Név Matton RefSeq Transcript ID Matton Referencia Matton Kit Matton kit onkogén katalógusa NM_021099 katalógusa 15 katalógusa Fcer1a katalógusa
Fc töredéke IgE nagy affinitású I. receptora α polipeptid katalógusa NM_010184
16 katalógusa Mcpt1 Matton hízósejtek proteáz 1 katalógusa NM_008570 katalógusa 17, 18
Mcpt2 Matton hízósejtek proteáz 2 | NM_008571 katalógusa 19 katalógusa Mcpt4 Matton hízósejtek proteáz 4 katalógusa NM_010779 katalógusa 2, 20 katalógusa Cma2
katalógusa kimáz 2, hízósejtek (hízósejtek proteáz 10) hotelben NM_001024714
14 * katalógusa Anxa10 Matton annexin A10 katalógusa NM_011922 katalógusa 21 katalógusa Ctse
katalógusa katepszin E katalógusa NM_007799 katalógusa 22 katalógusa Fos Matton FBJ osteosarcoma onkogén katalógusa NM_010234 katalógusa 23 katalógusa Ptgr1 Matton prosztaglandin-reduktáz 1 (leukotrién B4 12-hydroxydehydrogenase) hotelben NM_025968 katalógusa 24 (sertés) hotelben cnn1 Matton calponin 1 katalógusa NM_009922 katalógusa 25 katalógusa Ces3 Matton karboxileszteráz 3
NM_053200 katalógusa 26 katalógusa CPE Matton karboxi E katalógusa NM_013494 katalógusa 27 (szarvasmarha) hotelben Notch4 Matton Notch gén homológ 4 katalógusa NM_010929 katalógusa 28
28S rRNS katalógusa 28S riboszóma RNS katalógusa NR_003279 katalógusa 29 katalógusa *, Beinszertáltuk jelen tanulmányban bemutatott az N-terminális csonka formája Cma2 katalógusa, míg a RefSeq " NM_001024714 "a teljes szekvenciáját Cma2 katalógusa.
Klaszterezési elemzést a génexpressziós profilokat és funkcionális kategorizálás között simaizomsejtek és MMCS
a ~ 12.000 gének képviselve a oligonukleotid tömb, mi kiválasztott 1272 gének, amelyek expressziós szintje között SMC 3/1 és MMC 1-3 szignifikánsan különbözött (p katalógusa < 0,05, Limma t katalógusa teszt). Az expressziós szintjét az egyes gének normalizálása a szintje BMMCs, amelyek tenyésztett MCs úgynevezett "éretlen" tulajdonságok és a kiválasztott gének soroltuk hét klaszterek segítségével k katalógusa -means csoportosítási algoritmus (CL1-7 ábra az 5a és kiegészítő fájl 1). Azt is lehet osztályozni a géneket funkcionális kategóriákba, és a képviselő gének vannak felsorolva (5b ábra). Közülük 666 gén (52,4%) mutatott SMC elfogult kifejezés (CL1-3 katalógusa); 78% (519 gén) SMC gazdag gének expressziós szintje viszonylag alacsony BMMCs és fokozta az SMC (CL1 & 2 |). Például az expressziós szintjének Mcpt4 katalógusa viszonylag alacsony volt BMMCs, és ha a kifejezés profilja BMMCs tükrözi éretlen tulajdonságait MC progenitorok, Mcpt4
lehet következtetni, hogy indukált során a végső érés be simaizomsejtek. Érdekes, hogy az SMC marker gének Mcpt5 katalógusa és Mcpt6 katalógusa soroltuk CL2 /3 katalógusa, ami arra utal, hogy ezek a gének fejeztük bizonyos mértékig "éretlen" BMMCs, de a kifejezés elnyomták az érlelés során figyelembe MMCS. Másrészt, 606 gén (47,6%) mutatott MMC-előfeszített expresszió (CL4-7
); 51% (334 gén) MMC-gazdag gének, azok expressziós szinteket BMMCs alacsony volt, de voltak fokozta az MMC (CL4 & 5 katalógusa). Például kifejezése Mcpt1 katalógusa alacsony volt a "éretlen" BMMCs de drasztikusan indukált érés során figyelembe MMCS. 5. ábra Klaszterezési elemzést a génexpressziós profilok között SMC és MMCS. (A) ábrázolása mRNS expressziós szintje sMC1-3 és mMC1-3 képest BMMCs. A szín a sávok arányát jelenti a jel intenzitása között független minta és BMMCs szerint a skála látható a jobb felső katalógusa. Gének jelentősen eltérő expressziója között SMC és MMC (p katalógusa < 0,05, Limma t katalógusa teszt) került kiválasztásra (1272 gének) és sorolják 7 klasztert a k katalógusa -means algoritmus (CL1-7
). (B) Funkcionális kategorizálása képviselője gének (a). Katalógusa fehérjeexpresszióját Notch4 az SMC és Ptgr1 az MMC a gyomor szöveteiben
között géneket eltérés kifejezése (5b ábra), akkor a további összpontosított kifejezése Notch4
SMC-kben és Ptgr1
MMCS, mindkettő, amelyek soha nem korábban jellemezve MCS-ben. A Notch4
géntermék tagja a Notch család, amely a transzmembrán receptorok, amelyek aktivált sejtfelszíni ligandumok a szomszédos sejteket. A legújabb vizsgálatok arra utaltak, hogy a Notch jelátvitel részt vesz a limfocita és hízósejt differenciálódás [30, 31]. Először megerősítette, hogy Notch4
expressziója lényegesen magasabb a külön-külön egyesítjük, SMC-k, mint MMCS real-time RT-PCR (az adatokat nem mutatjuk be). Mi következő vizsgáltuk, hogy a Notch4 fehérje kizárólag jelen SMC-k által immunfestése gyomor szövet (6a ábra). Notch4 jelek voltak a sejtmagban detektáltuk a-szerű struktúrák SMC-k, de nem azok MMCS. Továbbá Notch4 jeleket is találtak a bőr MCs, amelyek szomszédosak csoportosulnak a simaizomsejtek (3a ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Notch4 van jelen SMC-kben, de nem MMCS, és azt sugallják, hogy Notch4 részt vesz a SMC-specifikus transzkripciós Notch-célgének, amely szükséges lehet bizonyos SMC funkciókat. A hematopoietikus sejtek, arról számoltak be, hogy a konstitutívan aktív Notch4 elősegíti a bővítése progenitor sejtek és gátolja a myeloid differenciálódás [32]. Mivel Notch ligandumok már kimutatták, hogy létezik a kötőszövetekben, mint például a bőr irha [33], érdekes lesz, hogy vizsgálja meg, hogy Notch4 szerepet játszik a differenciálás SMC-k, és a fenntartó SMC funkciókat. 6. ábra immunhisztokémiai vizsgálatát Notch4 és Ptgr1 az SMC és MMC a gyomor szöveteiben. (A) Gyomor nyálkahártya alatti (SMC; bal panelek katalógusa), gyomor nyálkahártya (MMC; középső panelek katalógusa) és bőrön (MCs; jobboldal katalógusa) metszeteket anti-Notch4 antitest (alsó panelek
) és toluidinkékkel (felső panelek
). simaizomsejtek megfestettük az anti-Notch4 antitest a gyomor nyálkahártya alatti és a bőr dermis nyilakkal jelöljük. Nem volt festődés MMCS (nyílhegyek
) lokalizálódik a gyomor nyálkahártyáját. SMC és MMC arra metachromatically toluidine kék. (B) Gyomor submucosa (SMC-k; bal panelek
) és a gyomor nyálkahártyájának (MMC; jobb panelek
) metszeteket megfestettük anti-Ptgr1 antitest (alsó panelek katalógusa), és toluidin kékkel (felső panelek
). Nincs festés az anti-Ptgr1 antitestet találtunk az SMC-k (nyíl katalógusa). Kis jeleket figyeltünk meg a MMCS (nyílhegyek
). SMC és MMC arra metachromatically toluidine kék. Bárok
, 25 um (A, B).
A Ptgr1
termék, 15-oxo-prosztaglandin-13-reduktáz /leukotrién (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase alapvető enzim inaktiválás az eikozanoidok, a prosztaglandin E 2 (PGE 2) és LTB 4 [34]. Bár azt jelentette, hogy a útvonalait eikozanoid szintézist eltérőek a különböző MC alosztályok [1, 4], eredményeink arra utalnak, hogy az inaktiválás rendszer eikozanoidok is változik között az MC alosztályok. Ptgr1
kifejezés azt találták, hogy szignifikánsan magasabb a külön-külön egyesítjük MMCS real-time RT-PCR (az adatokat nem mutatjuk be). Azt is megvizsgálták, Ptgr1 kifejezést gyomor szakaszok immunfestéssel. Jelek a Ptgr1 fehérje találtak szemcse-szerű struktúrák MMCS a gyomorban nyálkahártya, de nem SMC-kben (6b ábra), ami arra utal, hogy a Ptgr1 enzim lehet felszabaduló MMCS upon degranulációt. Mivel PGE 2 játszik kritikus szerepet a fenntartásához bél homeosztázis keresztül nyálkahártya védelme és savszekréció gátlása, lehetséges, hogy amikor aktiválva van, MMCS negatívan szabályozzák a citoprotektív intézkedések a PGE 2 keresztül gyors inaktiválás által Ptgr1.
génexpressziós mintázata az extracelluláris mátrix komponensek, adhéziós molekulák, és citoszkeletális fehérjék SMC-kben és MMCS
MC fenotípusok kimutatták, hogy függ a kölcsönhatások a környező extracelluláris mátrixok (ECM), és a szomszédos sejtek [1]. Az egyik leginkább figyelemre méltó eredményeket ebben a vizsgálatban a különbség a génexpressziójának a ECM fehérje komponensek, adhéziós molekulák, és citoszkeletális fehérjék, amelyek tükrözik funkcionális alkalmazásra minden egyes típusú MC a nyálkahártya vagy nyálkahártya alatti környezetben a gyomorban (5b ábra) . MMCS kifejezni gének nyálkahártya-specifikus ECM fehérjék, mint például a MUC1 katalógusa (mucin) termelést és Tff1 katalógusa (Trefoil faktor), míg a simaizomsejtek kifejezni géneket hagyományos ECM fehérjék, mint például Col4a katalógusa (prokollagén) és Lama2 katalógusa (laminin). Sőt, simaizomsejtek kifejezni gének adhéziós molekulák, például Alcam
és Vcam1
, és a gének a hétköznapi citoszkeletális fehérjék, mint például Acta2 katalógusa (aktin), míg MMCS kifejezni dezmoszóma-komponens gének, mint például DSC2 katalógusa ( desmocollin) és Dsg2 katalógusa (desmoglein), és génjei keratin intermedier filamentumok, mint Krt8 katalógusa és Krt19 katalógusa. Dezmoszómák számoltak, hogy jelen legyen a gyomor hámban [35], és azt találták, hogy dezmoszóma-szerű szerkezeteket kimutatható egy bizonyos típusú MC [36]. Lehetséges tehát, hogy MMCS kölcsönhatásba szomszédos hámban keresztül dezmoszómális tapadás a gyomorban. Ezzel szemben, a simaizomsejtek tűnik, hogy kölcsönhatásba lépnek a szomszédos sejtek keresztül adhéziós molekulák, mint például a VCAM-1, Alcam és a VE-kadherin (Vcam1
, Alcam1
és Cdh5
). Mivel ezek adhéziós molekulákról kimutatták, hogy részt vesz a dinamikus szabályozása az aktin citoszkeleton [37, 38], ilyen molekula által közvetített kölcsönhatások a nyálkahártya alatti sejtek kritikus lehet, hogy fenntartsák a funkcionális és morfológiai tulajdonságait SMC-k. Valóban, meg kell jegyezni, hogy a legtöbb SMCS változó alakúak, és gyakran nyúlt és kanyargós képest MMCS [1].
Következtetés
Létrehoztunk egy módszert RNS amplifikációs poolozott intakt MC izolált fagyasztott szöveti szakaszok, amely lehetővé teszi, hogy kényelmesen megkapjuk a globális génexpressziós mintázat MCS különböző szövetek, szervek, és fajok, köztük emberekben. Ezzel a módszerrel kimutattuk, az első alkalommal a különböző génexpressziós profilokat nyálkahártya alatti és nyálkahártya MC az egér gyomorban. Eredményeink kínálnak betekintést lehetővé azonosítatlan tulajdonságokkal specifikusak az egyes MC alosztálya. Katalógusa módszerek katalógusa anyagok katalógusa A következő anyagokat kaptuk a források szerint: HPLC tisztított T7- (dT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] a GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Anglia), RN-áz-mentes vízben, dNTP-t, SusperScript II, az Escherichia coli katalógusa (E. coli
) RN-áz H, E . coli
DNS-polimeráz I, az E. coli
DNS-ligázt, T4 DNS polimerázt és random hexamerek (Invitrogen, San Diego, CA), RN-áz inhibitor, glikogén, és MEGAscript T7 kitet Ambion (Austin, Texas). Balb /c egereket szereztünk be a JapanClea (Hamamatsu, Japán). Ez a tanulmány a bizottság által jóváhagyott állat Kutató Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences. Katalógusa RNS amplifikációs és oligonukleotid microarray katalógusa egér interleukin-3-függő BMMCs készítünk a korábban leírtak [39].

• A beteg gyomorrák peritoneális carcinomatosis intraperitoneálisan kemoterápia, aki túlélte több mint 5 éve kapó ismételt laparoszkópos vizsgálatok: a esetismertetés
• Immunizálás immundomináns Helicobacter suis ureáz B alegységet indukál részleges védelmet nyújt H. suis fertőzés egy egér modell