Caractérisation de l'expression génique des profils pour les différents types de mastocytes mis en commun des sous-régions de l'estomac de la souris par un procédé d'amplification d'ARN

Caractérisation des profils d'expression des gènes pour différents types de mastocytes regroupées de sous-régions de l'estomac de la souris par une méthode d'amplification d'ARN
Résumé de l'arrière-plan
mastocytes (MC) jouent un rôle essentiel dans l'allergie et l'immunité innée et se composent de sous-classes hétérogènes . Cependant, la base moléculaire de déterminer les différentes caractéristiques de ces multiples sous-classes MC reste incertaine
. Résultats
Pour aborder cela, nous avons développé une méthode d'extraction d'ARN /amplification pour intact in vivo
MCs commun de sections de tissus congelés , ce qui nous a permis d'obtenir le schéma global de l'expression des gènes des MCs communs appartenant à la même sous-classe. MCs ont été isolés à partir de la sous-muqueuse (CML) et la muqueuse (RHM) des sections d'estomac de souris, respectivement, les 15 cellules ont été mises en commun, et leur ARN a été extrait, amplifié et soumis à une analyse de puces à ADN. Les gènes marqueurs connus spécifiques pour MMCS et CML ont montré attendus tendances d'expression, ce qui indique la précision de l'analyse.
Nous avons identifié 1272 gènes montrant significativement différents niveaux d'expression entre CML et MMCS, et les avons classés en groupes sur la base de la similitude de leurs profils d'expression par rapport aux MCs dérivées de la moelle osseuse, qui sont cultivées avec les MCs propriétés dites «immatures». Parmi eux, nous avons constaté que plusieurs gènes clés tels que Notch4
avaient expression smc-biaisée et Ptgr1
avait expression mmc-biaisée. En outre, il existe une différence dans l'expression de plusieurs gènes y compris les composants de la matrice extracellulaire de protéines, les molécules d'adhésion et les protéines de cytosquelette entre les deux sous-classes MC, ce qui peut refléter une adaptation fonctionnelle de chaque MC à l'environnement de la muqueuse ou de la sous-muqueuse de l'estomac.
Conclusion
en utilisant la méthode d'amplification de l'ARN de MCs intacts regroupés, nous avons caractérisé les profils d'expression des gènes distincts de CML et MMCS dans l'estomac de la souris. Nos résultats offrent un aperçu de possibles propriétés non identifiées spécifiques pour chaque sous-classe MC.
Fond
mastocytes (MC) sont dérivés de cellules souches hématopoïétiques et jouent un rôle important dans les réponses allergiques, l'immunité innée et de défense contre l'infection parasitaire. Contrairement à d'autres cellules sanguines, MCs migrent dans les tissus périphériques comme progéniteurs immatures et se différencient en des mastocytes matures. L'une des caractéristiques uniques de la MC est qu'ils présentent une variété de phénotypes en fonction des différents micro-environnement tissulaire de leur maturation [1]. Dans les pays méditerranéens, diverses sérine-protéases MC spécifiques sont stockés dans les granules sécrétoires et leur expression des gènes et des protéines sont modifiées de manière spectaculaire lorsque leur environnement cellulaire est altéré. Par exemple, Reynolds et al.
Ont montré qu'au moins six éléments distincts de sérine-protéases souris MC spécifiques sont exprimés dans différentes combinaisons dans les différentes populations de mastocytes [2]. En outre, des études récentes ont montré que les MCs matures varient en fonction de ce que la surface des récepteurs et des médiateurs lipidiques qu'ils expriment [3, 4]. Parce que chaque population de cellules de mât in vivo
doit jouer un rôle spécifique dans le corps, il est important de déterminer le caractère de chaque population de MCs.
Analyse détaillée de l'expression génique est une approche puissante pour comprendre la caractérisation des différents MC sous-populations. À ce jour, plusieurs études sur l'analyse des microréseaux de MCs ont été menées [5-7], mais la plupart d'entre eux traités MCs cultivés in vitro
. Alternativement, les profils d'expression des gènes de MCs isolés de la peau et des poumons ont été analysés [3, 8-10]. Cependant, le nombre de MCs analysés comme un échantillon étaient relativement élevés et ils ont été exposés à des forces physiques, des enzymes et l'anticorps anti-Kit pour la purification, au cours de laquelle les propriétés originales du MCs peuvent avoir été touchés.
Dans le gastro-intestinal voies, il y a des MCs qui sont principalement classés en deux sous-classes; muqueuse MCs (MMCS) et MCs muqueux (CML) sur la base de leur emplacement, de la morphologie (taille et forme) et le contenu des granules [11, 12]. MCMM se trouvent principalement dans la muqueuse du système gastro-intestinal, comprenant des granules contenant du sulfate de chondroïtine, qui sont colorées avec du bleu de toluidine, mais pas safranine, et leur activation se produit au cours de l'infection parasitaire [13], tandis que les CML sont localisés dans la sous-muqueuse du tractus gastro voies et leurs granules sont riches en héparine et colorées à la fois avec le bleu toluidine et safranine [1, 11]. Cependant, la base moléculaire de déterminer les différences dans les propriétés biochimiques de ces deux sous-classes MC reste incertain, en partie à cause de la difficulté de leur isolement.
Pour surmonter ces problèmes, ici, nous avons établi une méthode d'amplification de l'ARN de MCs intactes isolé à l'état congelé coupes de tissus, ce qui nous permet d'obtenir facilement le schéma global de l'expression des gènes des MCs dans divers tissus. Pour valider cette méthode, nous avons d'abord déterminé le nombre de cellules minimum requis pour atteindre reproductible amplification d'ARN. Nous avons ensuite comparé les profils d'expression des gènes obtenus à partir de petits nombres de MMCS et CML dans l'estomac de la souris, et nous avons trouvé plusieurs gènes clés pour être spécifiquement exprimés dans une sous-classe de MCs, ce qui peut refléter certains aspects des propriétés distinctes entre les deux sous-classes MC dans Résultats et discussion du tractus gastro-intestinal.
développement d'un protocole d'amplification d'ARN pour obtenir des profils d'expression génique à partir d'une petite quantité d'ARN
pour mieux comprendre les différences fonctionnelles entre les différentes sous-classes de MCs, nous avons utilisé trois tours de la méthode amplification d'ARN à base de T7. Sur la base des expériences préliminaires utilisant des MCs péritonéale et MCs dérivées de la moelle osseuse (BMMCs), on estime qu'un seul MC obtient 2 pg d'ARN. Avant que nous avons effectué une analyse comparative des MCs de différents tissus, nous avons d'abord évalué la précision et la reproductibilité des trois cycles du procédé d'amplification d'ARN à base de T7, en commençant par la quantité d'ARN qui peut être obtenu à partir d'un seul MC. Pour évaluer cela, nous avons d'abord comparé les résultats de microréseaux obtenus à partir de 5 ug d'ARN SHBM préparé par le protocole standard avec ceux obtenus à partir du même ARN dilué 10 5 ou 10 6 fois (30 pg, 10 pg et 2 pg) et soumis à trois cycles de l'amplification basée sur T7 (figure 1a-c). Bien que trois cycles d'amplification ont donné une quantité suffisante d'ARN pour l'analyse des microréseaux (> 20 ug), même dans le cas de 2 ARN pg, analyse de diagramme de dispersion a révélé que les qualités des résultats obtenus étaient très différentes entre les échantillons de 5 ug et 2 pg d'ARN. Les gènes jugés «présence» dans les deux 30 pg et 5 pg d'ARN ont été 8,149 gènes, ce qui correspond à 72% des gènes jugés «présence» dans la 5 ug d'ARN (11,344 gènes; figure 1a), alors que seulement 4116 gènes ont été jugés comme «présence» dans les deux 2 pg et 5 ug d'ARN, qui correspond à seulement 36% des gènes jugés «Présence» dans le 5 ug d'ARN (Figure 1c). La diminution du nombre de gènes jugés «présence» dans les échantillons dilués (30 pg, 10 pg et 2 pg) peut être due à la perte d'espèces d'ARN de faible nombre de copies pendant l'amplification. La figure 1 La comparaison des trois produits ronds amplifié à partir de très petites quantités d'ARN. (A-c) les biais d'amplification dans les produits à partir d'une petite quantité d'ARN. Les diagrammes de dispersion de l'intensité du signal obtenu à partir de 5 ug d'ARN SHBM préparé par le protocole standard et de 30 pg (un
), 10 pg (b
) et 2 pg (c
) de l'ARN SHBM préparé par trois cycles d'amplification sont présentés. (D, e) Reproductibilité de l'amplification de trois rondes d'une petite quantité d'ARN. Les diagrammes de dispersion de l'intensité du signal entre deux produits indépendants de 30 pg de SHBM ARN (SHBM 30 pg-1 et SHBM 30 pg-2) (d
) ou de 2 pg de SHBM ARN (SHBM 2 pg-1 et SHBM 2 pg-2) (e
), sont représentés. Les points rouges montrent des ensembles de sonde jugés «Présence», et des points jaunes représentent des ensembles de sonde jugés "Absence" dans les deux tableaux. Les points bleus montrent des ensembles de sonde jugés «Présence» seulement dans les deux tableau. Les coefficients de corrélation (r) sont présentés. Les mêmes seuils d'induction et de suppression, quatre plis sont indiqués sous forme de lignes diagonales. Les gènes jugés «Présence» sont placés dans des groupes correspondant à pairwise chevauchements présentés dans les diagrammes de Venn ci-jointes.
Nous avons ensuite examiné la reproductibilité des résultats obtenus à partir de biopuces deux ensembles de 30 pg échantillons SHBM ARN (30 pg-1 et 30 pg-2) ou de deux ensembles d'échantillons 2 pg (2 pg-1 et 2 pg-2) (figure 1d et 1e). Dans les échantillons d'ARN 30 pg, 7537 (30 pg-1) et 8777 (30 pg-2) des gènes ont été jugés comme «présence». Toutefois, seuls 4324 (2 pg-1) et 4460 (2 pg-2) des gènes ont été jugés comme «présence» dans chaque échantillon d'ARN 2 pg, ce qui suggère à nouveau la perte du faible nombre de copies d'ARN lors de l'amplification à partir d'une petite quantité d'ARN. Quant à la reproductibilité, 86% des gènes de la «présence» dans les 30 pg-1 et 74% des gènes «présence» dans la pg-2 échantillon 30 ont été jugées comme «Présence» dans les deux échantillons d'ARN 30 pg, tandis que seulement 57 % des gènes "présence" dans le 2 pg-1 et 55% des gènes "présence" dans le 2 pg-2 échantillons ont été jugées «présence» dans les deux échantillons d'ARN 2 p. Ces résultats suggèrent que les produits amplifiés à partir de l'ARN à partir d'un seul MC (environ 2 pg), par la méthode actuelle peuvent comporter des artefacts d'amplification importants qui causent des problèmes en termes de précision et de reproductibilité. D'autre part, en raison de la reproductibilité plus élevée (> 74%), nous avons conclu que l'amplification de l'ARN 30 pg recueillies à partir de 15 MCs serait approprié pour l'analyse pratique des tissus MCs. Sur la base de ces résultats, nous avons fixé notre objectif dans cette étude pour acquérir des profils d'expression génique des MCs regroupées provenant de différentes régions. Afin de minimiser l'influence des variations de cellule à cellule dans les mêmes objets de classe et d'amplification potentielle, nous avons préparé trois séries de 15 MCs pour chaque région et des gènes par rapport à l'expression significativement différente entre les MCs des différentes régions (Figure 2b). Nous avons choisi l'estomac comme organe source, puisque nous pouvons isoler deux types de MCs de la muqueuse (mmc) et les sous-muqueuse (Smc) régions des mêmes sections, et MMCS et CML ont été suspectés d'être différent dans plusieurs propriétés MC tels que protéase profil d'expression et la sensibilité à la coloration à la safranine [1, 11]. Figure 2 profils d'expression de gènes de CML et MMCS de tissus de l'estomac. (A) Isolation de toluidine MCs bleu teinté dans la sous-muqueuse (smc, panneaux supérieurs
) et la muqueuse (mmc; panneaux inférieurs
) des sections de l'estomac. A smc (flèche
) et mmc (arrowhead
) qui a été metachromatically coloré avec du bleu de toluidine avant microdissection (panneaux de gauche
) ont disparu après microdissection avec une pipette de patch (panneaux de droite
). Bars
, 10 um. (B) Aperçu de la stratégie expérimentale. (C) marqués et ARN antisens fragmentées de trois échantillons smc individuels, trois échantillons de mmc individuels et les échantillons «pas de cellules 'ont été hybridées à une matrice murin. Les diagrammes de dispersion pour 'aucune cellule »(axe x) et SMC1 (axe y) (de
supérieur gauche),« aucune cellule »(axe x) et MMC1 (axe y) (inférieure
gauche), SMC1 (x axe) et SMC2 (axe y) (centre supérieur
), MMC1 (axe x) et mmc2 (axe y) (centre inférieur
), SMC1 (axe x) et MMC1 (axe y) (en haut à droite
) sont représentés. Les coefficients de corrélation (r) pour la comparaison au sein de sMC1-3, dans mMC1-3 et entre CML et MMCS sont présentés comme des moyens ± E.T. Les points rouges montrent des ensembles de sonde jugés «Présence», et des points jaunes représentent des ensembles de sonde jugés "Absence" dans les deux tableaux. Les points bleus montrent des ensembles de sonde jugés «Présence» seulement dans les deux tableau. Les mêmes seuils d'induction et de suppression, deux plis sont indiqués sous forme de lignes diagonales.
Profils d'expression génique de la sous-muqueuse et MCs muqueuse de l'estomac
Pour visualiser deux types de MCs dans l'estomac sans causer de dégradation de l'ARN, les sections étaient fixe avec le fixateur de Carnoy et metachromatically colorées au bleu de toluidine pendant quelques secondes. CML et MMCS ont été microdisséquées à l'aide d'une pipette de patch (Figure 2a et 2b). Nous avons préparé trois séries de 15 MCs pour chaque région, extrait de leur ARN et les amplifié individuellement (smc 1, smc 2, smc 3, et mmc 1, mmc 2, mmc 3). Pour améliorer la récupération de l'extraction aussi faible que 30 pg d'ARN, on a utilisé 'poly G' en tant que support, ce qui ne perturbe pas l'amplification de l'ARN suivant ou l'hybridation du produit amplifié à la matrice (données non présentées). Pour examiner les effets des produits d'artefact non spécifique amplifiés, nous avons effectué la procédure d'extraction d'ARN /amplification sans ajout de cellules microdissection ( "pas de cellule") en tant que témoin négatif (décrit dans "Matériels et méthodes
"). Les ARNs amplifiés des CML, MMCS et le contrôle "pas de cellule" ont été séparément hybridées à un microréseau murin. Les valeurs de signal dans l'échantillon «non cellulaire» étaient faibles en général, semblables à des niveaux de fond (figure 2c). Les diagrammes de dispersion des échantillons préparés indépendamment au sein du même groupe (par exemple smc 1 vs smc 2) a montré un profil d'expression similaire; le coefficient de corrélation moyenne pour l'ensemble sonde-ensembles était de 0,945 ± 0,004 et 0,893 ± 0,019 dans CML et MMCS, respectivement (n
= 3). En revanche, le coefficient de corrélation moyenne entre CML et MMCS était 0,752 ± 0,034 (n =
3), ce qui était beaucoup plus bas que ceux dans le même groupe, ce qui suggère que leurs profils d'expression de gènes sont différents.
Nous avons évalué plus la précision et la reproductibilité de notre méthode par d'autres analyses complètes (analyse de classification hiérarchique et analyse en composantes principales [APC]) en utilisant tous les ensembles de sondes. données de biopuces obtenues à partir de CML, MMCS, MCs dérivés de la peau, MCs péritonéale, BMMCs et non MCs (macrophages et les fibroblastes) ont été appliqués à ces analyses. On a d'abord vérifié si le processus d'amplification dans notre procédé affecte le profil global de l'expression due à l'amplification non linéaire. Les résultats des échantillons SHBM utilisant l'ARN préparé par le protocole standard (SHBM-std) ou la méthode d'amplification (SHBM-amp) ont été soumis à ces analyses. Les deux analyses de classification hiérarchique et de l'APC ont révélé que les données de puces à ADN de SHBM-std et SHBM-amp ont été regroupés dans le même groupe (Figure 3a et 3b), ce qui suggère que la similitude globale dans les profils d'expression des gènes est maintenue pendant le processus d'amplification. Nous avons ensuite examiné la similitude des profils d'expression dans trois échantillons smc ou mmc indépendants. Après analyse de la concentration et de l'APC, smc 1-3 et mmc 1-3 ont été regroupés dans le même groupe, respectivement. PCA a également montré que les profils d'expression des CML, MMCS et BMMCs sont mutuellement différentes (Figure 3b). Figure 3 gène mondial analyse de l'expression de smc 1-3 et mmc 1-3. (A) le regroupement hiérarchique de l'expression génique globale de diverses préparations de MCs et non MCs. Trois rounds de produits amplifiés sMC1-3, mMC1-3, peau MC et BMMCs, et les produits standard de BMMCs, MCs péritonéale, les macrophages et les fibroblastes ont été analysés. (B) L'analyse en composantes principales (ACP) révèle différents profils d'expression génique de sMC1-3, mMC1-3, et deux préparations de BMMCs. Le carré en pointillés bleu indique MMCS, le carré rouge en pointillé indique CML, et le carré en pointillés noir indique BMMCs.
Nous avons ensuite comparé les MCs d'estomac dérivés (CML et MMCS) avec MC dérivés de la peau, MCs péritonéale, BMMCs et non -MCs (macrophages et les fibroblastes) par le regroupement d'analyse. Les MCs dérivés de tissus (estomac MCs et de la peau MCs) ont été regroupés séparément des MCs péritonéale et BMMCs. Ces résultats peuvent refléter des propriétés différentes entre les MCs dérivés de tissus avec adhésion ferme aux cellules voisines et MCs flottant sans contact étroit. Quant à la similitude des MCs avec des fibroblastes et des macrophages, il est raisonnable que les fibroblastes sont les plus éloignés de MCs et les macrophages sont plus proches de MCs comme une famille leucocytaire.
Validation des résultats de puces à ADN par analyse en temps réel RT-PCR
Nous prochaine enquête si les signaux d'hybridation des gènes marqueurs connus spécifiques pour CML et MMCS ont montré les tendances d'expression attendus [12, 14]. Les gènes spécifiques mmc, protéase mastocytes 1 (Mcpt1
) et 2 (Mcpt2
) ont montré des valeurs plus élevées dans MMCS, tandis que les gènes marqueurs smc-spécifiques, la protéase de mastocytes 4 (Mcpt4
) et chymase 2 (CMA2
), ont montré des valeurs de signal plus élevés dans les CML (tableau 1 et figure 4a) [15-29]. D'autre part, les marqueurs MC-communs tels que kit oncogène (Kit
) et récepteur Fcs (Fcer1a de
) ont montré des valeurs de signaux significatifs sans biais entre MMCS et CML. Pour évaluer davantage les résultats, nous avons mesuré les niveaux d'expression de ces gènes marqueurs en temps réel RT-PCR en utilisant l'ARN provenant MCs isolés indépendamment (figure 4b). De plus, nous avons choisi au hasard trois gènes montrant l'expression 'mmc biaisée »et trois autres gènes montrant« smc-biaisée' expression; l'expression de ces gènes dans les pays méditerranéens n'a pas été rapportée précédemment (figure 4a). Il n'y avait pas de différences significatives dans les niveaux de Kit
et Fcer1a
entre MMCS et CML expression. En revanche, les marqueurs spécifiques mmc Mcpt1
et Mcpt2
et les gènes «mmc biaisée», Anxa10, CTSE
et Fos
a montré une expression plus élevée dans MMCS, et des marqueurs du smc spécifique Mcpt4
et CMA2
et les gènes «smc biaisés», Cnn1, Ces3
et Cpe
a montré une expression plus élevée dans les CML. Ces résultats indiquent que les résultats de biopuces sont fiables et reflètent les profils d'expression génique des CML intactes et MMCS dans l'estomac. Figure 4 Validation des gènes exprimés de manière différentielle entre CML et MMCS. marqueurs (a) smc-spécifiques (CMA2 de
, Mcpt4 de
), mmc spécifique (Mcpt1
, Mcpt2 de
) et MC-communs (Fcer1a
et Kit
) (gauche panneau
) et six gènes sélectionnés au hasard (Ces3
, Cnn1
, Cpe
, Anxa10
, CTSE
et Fos
) (panneau de droite
) sont indiqués dans la dispersion de corrélation représentant des graphes entre SMC1 et MMC1. Les mêmes seuils d'induction et de suppression, deux plis sont indiqués comme une ligne jaune, bleu et rouge, respectivement. (B) Les niveaux des gènes de (a) ont été vérifiées en temps réel par RT-PCR de l'expression. Les valeurs représentent le rapport entre les niveaux d'expression relatifs de MMCS à CML, et sont présentées comme moyenne ± E.T. (N = 3). La spécificité du produit de PCR a été confirmée par électrophorèse et l'analyse de la température de fusion du gel. Le niveau de chaque gène d'expression a été normalisé à 28S ARN ribosomal.
Tableau 1 Résumé des gènes examinés par analyse PCR en temps réel.
Gene Symbole

kit de Gene Nom
RefSeq Transcript ID
référence
kit oncogène
NM_021099
15
Fcer1a
fragment
Fc d'IgE, une affinité élevée I, récepteur de polypeptide α
NM_010184
16
Mcpt1
mât protease cellulaire 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mât protease cellulaire 2
NM_008571
19
Mcpt4
mât protease cellulaire 4
NM_010779
2, 20
CMA2

chymase 2, mastocytes (mât de protéase de cellule 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
annexine A10
NM_011922
21
CTSE

cathepsine E
NM_007799
22
Fos
FBJ ostéosarcome oncogène
NM_010234
23
Ptgr1
réductase prostaglandine 1 (leucotriènes B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (porcine)
Cnn1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
carboxylestérase 3

carboxypeptidase E 26
Cpe de NM_053200
27 (bovine) de NM_013494
Notch4
Notch gène homologue 4
NM_010929
les 28S de 28
28S rRNA ARN ribosomique
29
* de NR_003279, la séquence codante présentée dans ce document est l'extrémité N-terminale tronquée-forme de CMA2
, tandis que le RefSeq " NM_001024714 "est la séquence complète de CMA2
.
analyse de clustering des profils d'expression génique et la catégorisation fonctionnelle entre CML et MMCS
Parmi les ~ 12.000 gènes représentés sur le réseau d'oligonucléotides, nous avons sélectionné 1272 gènes dont les niveaux d'expression entre smc 1-3 et mmc 1-3 étaient significativement différentes (p
< 0,05, t
test de Limma). Le niveau de chaque gène d'expression a été normalisée par son niveau de BMMCs, qui sont MCs cultivées avec soi-disant propriétés «immatures», et les gènes sélectionnés ont été classés en sept groupes en utilisant le clustering l'algorithme du k
(CL1-7; la figure 5a et fichiers supplémentaires 1). Nous avons également classé les gènes dans des catégories fonctionnelles, et les gènes représentatifs sont inscrites (figure 5b). Parmi eux, 666 gènes (52,4%) ont montré l'expression smc polarisée (CL1-3
); dans 78% (519 gènes) des gènes smc riches, les niveaux d'expression étaient relativement faibles en BMMCs et augmentées en smc (CL1 & 2
). Par exemple, le niveau de Mcpt4
d'expression était relativement faible en BMMCs, et si le profil d'expression de BMMCs reflète les propriétés immatures de progéniteurs MC, Mcpt4
peut être conclu à être induite au cours de la maturation finale en CML. Fait intéressant, les gènes marqueurs smc Mcpt5
et Mcpt6
ont été classés en CL2 /3
, suggérant que ces gènes ont été exprimés dans une certaine mesure 'immature' BMMCs, mais leur expression a été supprimée lors de la maturation en MMCS. D'autre part, 606 gènes (47,6%) ont montré l'expression mmc biaisée (
CL4-7); dans 51% (334 gènes) des gènes mmc riches, leurs niveaux d'expression dans BMMCs étaient bas, mais ont été augmentés en MMCS (CL4 & 5
). Par exemple, l'expression de Mcpt1
était faible dans 'immature' BMMCs mais a été fortement induite lors de la maturation en MMCS. Figure 5 Analyse Clustering des profils d'expression génique entre CML et MMCS. (A) Représentation des niveaux de sMC1-3 et mMC1-3 d'expression d'ARNm par rapport BMMCs. La couleur des barres représente le rapport de l'intensité du signal entre les échantillons indépendants et BMMCs, selon l'échelle indiquée sur le dessus
droite. Les gènes avec une expression significativement différente entre CML et MMCS (p
< 0,05, t
test de Limma) ont été sélectionnés (1272 gènes) et classés en 7 groupes utilisant le k
algorithme -un moyen (CL1-7
). (B) la catégorisation fonctionnelle des gènes représentatifs (a). Expression
Protein de Notch4 en CML et Ptgr1 en MMCS dans les tissus de l'estomac
Parmi les gènes présentant une expression différentielle (figure 5b), nous avons encore concentré sur l'expression de Notch4
à CML et Ptgr1
à MMCS, qui ont tous deux jamais été précédemment caractérisé en MCs. Le produit du gène de Notch4 est un membre de la famille de Notch, comprenant des récepteurs transmembranaires qui sont activés par des ligands de surface cellulaire sur des cellules adjacentes. Des études récentes ont suggéré que la signalisation Notch est impliquée dans la différenciation des lymphocytes et mastocytes [30, 31]. Nous avons d'abord confirmé que Notch4 de l'expression est significativement plus élevée dans les CML regroupées séparément que MMCS par temps réel RT-PCR (données non présentées). Nous avons ensuite cherché à savoir si la protéine Notch4 est exclusivement présent dans les CML par immunocoloration de tissu de l'estomac (figure 6a). signaux NOTCH4 ont été détectés dans les structures du noyau comme des CML, mais pas dans ceux de MMCS. En outre, les signaux NOTCH4 ont également été trouvés dans les pays méditerranéens de la peau, qui sont regroupés côte à côte avec les CML (figure 3a). Ces résultats montrent que Notch4 est présent dans les CML, mais pas dans MMCS, et suggèrent que Notch4 participe à la transcription smc spécifique des gènes Notch-cibles, ce qui peut être nécessaire pour certaines fonctions smc. Dans les cellules hématopoiétiques, il a été rapporté que Notch4 constitutivement active favorise l'expansion des cellules souches et inhibe la différenciation myéloïde [32]. Comme il a été montré des ligands de Notch à exister dans les tissus conjonctifs tels que le derme de la peau [33], il sera intéressant de voir si Notch4 joue un rôle dans la différenciation des CML et le maintien des fonctions smc. Figure 6 L'analyse immunohistochimique des Notch4 et Ptgr1 en CML et MMCS dans les tissus de l'estomac. (A) l'estomac sous-muqueuse (CML; panneaux de gauche
), la muqueuse de l'estomac (des MMCS, panneaux du milieu
) et la peau (MCs de la peau; panneaux de droite
) sections ont été colorées avec un anticorps anti-Notch4 (panneaux inférieurs
) et au bleu de toluidine (panneaux supérieurs
). CML colorées avec l'anticorps anti-Notch4 dans la sous-muqueuse gastrique et de la peau du derme sont indiqués par des flèches. Aucune coloration n'a été observée dans les MCMM (pointes de flèches
) localisé dans la muqueuse gastrique. CML et MMCS ont été metachromatically colorées avec du bleu de toluidine. (B) l'estomac sous-muqueuse (CML; panneaux de gauche
) et de la muqueuse de l'estomac (des MMCS, panneaux de droite
) sections ont été colorées avec un anticorps anti-Ptgr1 (panneaux inférieurs
) et avec du bleu de toluidine (panneaux supérieurs
). Aucune coloration avec l'anticorps anti-Ptgr1 a été trouvé dans les CML (flèche
). Les petits signaux ont été observés dans les MMCS (pointes de flèches
). CML et MMCS ont été metachromatically colorées avec du bleu de toluidine. Bars
, 25 um (a, b). Le plus produit The Ptgr1, 15-oxo-prostaglandine 13-réductase /leucotriènes (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase est une enzyme essentielle pour l'inactivation des eicosanoïdes tels que la prostaglandine E 2 (PGE 2) et LTB 4 [34]. Bien qu'il ait été rapporté que les voies de la synthèse des eicosanoïdes diffèrent entre les différentes sous-classes MC [1, 4], nos résultats suggèrent que le système d'inactivation des eicosanoïdes varie également entre les sous-classes MC. Ptgr1 de l'expression a été jugée nettement plus élevées dans les MCMM groupées séparément en temps réel, une RT-PCR (données non présentées). Nous avons également examiné l'expression Ptgr1 dans les sections de l'estomac par immunocoloration. Signaux pour la protéine Ptgr1 ont été trouvés dans les structures granulaires comme des MMCS dans la muqueuse de l'estomac, mais pas dans les CML (Figure 6b), ce qui suggère que l'enzyme Ptgr1 peut être libéré de MMCS sur dégranulation. Depuis PGE 2 joue un rôle critique dans le maintien de l'intestin homéostasie grâce à la protection de la muqueuse et l'inhibition de la sécrétion acide, il est possible que lorsqu'il est activé, MMCS réguler négativement les actions cytoprotecteurs de PGE 2 à inactivation rapide par Ptgr1.
motif d'expression génique des composants de la matrice extracellulaire, les molécules d'adhésion et les protéines de cytosquelette dans les CML et MCMM
phénotypes MC a été démontré que de dépendre de leurs interactions avec les matrices autour extracellulaires (ECM) et les cellules voisines [1]. L'un des résultats les plus remarquables dans la présente étude est la différence dans l'expression du gène de l'ECM composants protéiques, des molécules d'adhésion, et les protéines du cytosquelette, ce qui peut refléter une adaptation fonctionnelle de chaque type de MC à l'environnement de la muqueuse ou de la sous-muqueuse de l'estomac (figure 5b) . MMCS expriment des gènes pour les protéines d'ECM spécifiques tels que la muqueuse Muc1
(mucine) et (facteur Trefoil) de TFF1, tandis que les CML expriment des gènes pour les protéines d'ECM classiques tels que (le procollagène) de Col4a et LAMA2
(laminine). En outre, les CML expriment des gènes pour des molécules d'adhésion telles que les hôtels et Alcam VCAM1
et des gènes pour les protéines du cytosquelette ordinaires tels que (l'actine) de ACTA2, tandis que les MCMM expriment des gènes desmosome composants tels que
(DSC2 Desmocolline) et (le desmogléine de DSG2), et les gènes pour les filaments intermédiaires de kératine tels que KRT8
et KRT19
. Desmosomes ont été signalés à être présents dans l'épithélium de l'estomac [35], et il a été constaté que les structures de desmosome-like sont détectés dans un type particulier de MC [36]. Il est donc possible que MMCS interagissent avec épithéliums adjacente par desmosomal adhérence dans l'estomac. En revanche, les CML semblent interagir avec les cellules voisines via des molécules d'adhésion telles que VCAM-1, ALCAM et VE-cadhérine (VCAM1
, Alcam1
et Cdh5
). Comme il a été montré que ces molécules d'adhésion d'être impliqués dans la régulation dynamique du cytosquelette d'actine [37, 38], de telles interactions moléculaires médiée avec des cellules de la sous-muqueuse peut être critique pour maintenir les propriétés fonctionnelles et morphologiques des CML. En effet, il convient de noter que la plupart des COGES sont de forme variable, et sont souvent tendues et l'enroulement par rapport à MMCS [1].
Conclusion
Nous avons mis en place une méthode d'amplification de l'ARN de MCs intacts communs isolés à partir de tissus congelés sections, ce qui nous permet d'obtenir facilement le schéma global de l'expression des gènes des MCs de divers tissus, les organes et les espèces, y compris les humains. En utilisant cette méthode, nous avons démontré pour la première fois les profils d'expression génique distincts de sous-muqueuse et la muqueuse MCs dans l'estomac de la souris. . Les matériaux de méthodes Nos résultats offrent un aperçu de possibles propriétés non identifiées spécifiques pour chaque sous-classe MC
ont été obtenus à partir des sources Les matières suivantes indiquées: purifiée par HPLC T7 (dT) 24 amorce [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] de GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Angleterre), RNase eau, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E .
coli ADN polymerase I, l'ADN de E. coli de la ligase, l'ADN polymerase T4 et des hexamères aléatoires de Invitrogen (San Diego, CA), un inhibiteur de la RNase, le glycogène, et un kit MEGAscript T7 d'Ambion (Austin, TX). des souris Balb /c ont été obtenues auprès JapanClea (Hamamatsu, Japon). Cette étude a été approuvée par le Comité de la recherche animale de l'Université de Kyoto Graduate School of Pharmaceutical Sciences. Souris BMMCs interleukine-3-dépendantes de l'amplification
ARN et oligonucléotide microréseaux ont été préparés comme décrit précédemment [39]. L'ARN total de BMMCs a été extrait en utilisant RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA).

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