Caracterización de la expresión génica perfiles para diferentes tipos de mastocitos agrupados de subregiones de estómago de ratón por un método de amplificación de ARN

Caracterización de perfiles de expresión génica para diferentes tipos de mastocitos agrupados de subregiones de estómago de ratón por un método de amplificación de ARN
Abstract
Antecedentes
Los mastocitos (MC) juegan papeles fundamentales en la alergia y la inmunidad innata y constan de subclases heterogéneos . Sin embargo, la base molecular para determinar las diferentes características de estos múltiples subclases MC sigue siendo poco clara.
Resultados
a acercarse a esto, hemos desarrollado un método de extracción de RNA /amplificación para intactos in vivo
MCs agrupado a partir de secciones de tejido congelado , que nos ha permitido obtener el patrón de expresión génica global de MCs agrupadas pertenecientes a la misma subclase. MCs fueron aislados de la submucosa (CML) y la mucosa (MMC) de las secciones del estómago de ratón, respectivamente, se combinaron los 15 celdas, y se extrajo su ARN, amplifica y se sometieron a análisis de microarrays. genes marcadores conocidos específicos para MMCs y las SMC mostraron espera que las tendencias de expresión, lo que indica la exactitud del análisis.
Se identificaron 1.272 genes que muestran significativamente diferentes niveles de expresión entre las SMC y MMC, y se clasificaron en grupos sobre la base de similitud de sus perfiles de expresión en comparación con MCs derivadas de médula ósea, que son las MCs cultivadas con llamadas propiedades '' inmaduras. Entre ellos, se encontró que varios genes clave como Notch4
tenían expresión sesgada-SMC y Ptgr1
tenía expresión MMC-sesgada. Además, hay una diferencia en la expresión de varios genes incluyendo componentes de la matriz extracelular de proteínas, moléculas de adhesión, y proteínas del citoesqueleto entre los dos subclases MC, lo que puede reflejar la adaptación funcional de cada MC para el medio ambiente de la mucosa o submucosa en el estómago.
Conclusión
al utilizar el método de amplificación de ARN a partir de MCs intactos agrupados, se caracterizaron los distintos perfiles de expresión génica de las CML y MMC en el estómago de ratón. Nuestros resultados ofrecen información sobre las posibles propiedades específicas identificadas para cada subclase MC.
Antecedentes
Los mastocitos (MC) se derivan de las células madre hematopoyéticas y juegan un papel importante en las respuestas alérgicas, la inmunidad innata y la defensa contra la infección por parásitos. A diferencia de otras células de la sangre, MCs migran hacia los tejidos periféricos como progenitores inmaduros y se diferencian en los mastocitos maduros. Una de las características únicas de MCs es que muestran una variedad de fenotipos dependiendo de los diferentes microambiente del tejido de su maduración [1]. En MCs, diversas proteasas de serina específicos MC-se almacenan en los gránulos secretores, y sus expresiones de genes y proteínas se alteran drásticamente cuando se altera su entorno celular. Por ejemplo, Reynolds et al.
Han demostrado que al menos seis miembros distintos de serina proteasas ratón MC-específicos se expresan en diferentes combinaciones en diferentes poblaciones de células mástil [2]. Además, estudios recientes han demostrado que los MC maduras varían en términos de lo que la superficie receptores y mediadores lipídicos que expresan [3, 4]. Debido a que cada población de células cebadas in vivo
debe desempeñar un papel específico en el cuerpo, es importante para determinar el carácter de cada población de MCs.
Análisis amplio de la expresión génica es un enfoque poderoso para entender la caracterización de diversos MC subpoblaciones. Hasta la fecha, se han realizado varios estudios sobre el análisis de microarrays de MCs [5-7], pero la mayoría de ellos ocupado de MCs se cultivan in vitro
. Como alternativa, los perfiles de expresión génica de los MCs aisladas de piel y de pulmón han sido analizados [3, 8-10]. Sin embargo, el número de MC analizados como una muestra fueron relativamente alto y que fueron expuestos a fuerzas físicas, las enzimas y el anticuerpo anti-Kit para la purificación, durante los cuales pueden haber sido afectadas las propiedades originales de los MC.
En el tracto gastrointestinal tracto, hay MCs que se clasifican principalmente en dos subclases; mucosa MCs (MMCs) y MCs submucosos (SMCs) sobre la base de su localización, la morfología (tamaño y forma) y contenido de los gránulos [11, 12]. MMCs se encuentran principalmente en la mucosa del sistema gastrointestinal, que tiene gránulos que contienen sulfato de condroitina, que se tiñen con azul de toluidina, pero no safranina, y su activación se produce durante la infección del parásito [13], mientras que las SMC se localizan en la submucosa del tracto gastrointestinal tracto y sus gránulos son ricos en heparina y se tiñeron con azul de toluidina y tanto safranina [1, 11]. Sin embargo, la base molecular para determinar las diferencias en las propiedades bioquímicas de estas dos subclases MC sigue siendo incierto, en parte debido a la dificultad de su aislamiento.
Para superar estos problemas, aquí se estableció un método de amplificación de ARN a partir de MCs intactas aisladas de congelado secciones de tejido, lo que nos permite obtener convenientemente el patrón de expresión génica global de los MC en diversos tejidos. Para validar este método, primero se determinó el número de células mínimo requerido para lograr la amplificación del ARN reproducible. a continuación, se compararon los perfiles de expresión génica obtenidos a partir de un pequeño número de tarjetas MMC y las SMC en el estómago del ratón, y encontramos varios genes clave que se expresa específicamente en una subclase de MCs, lo que puede reflejar algunos aspectos de las distintas propiedades entre las dos subclases MC en el tracto gastrointestinal.
resultados y discusión
Desarrollo de un protocolo de amplificación de ARN para obtener los perfiles de expresión génica de una pequeña cantidad de ARN
para profundizar en las diferencias funcionales entre las diferentes subclases de MCs, se emplearon tres rondas del procedimiento de amplificación de ARN basada en T7. Sobre la base de los experimentos preliminares utilizando MCs peritoneales y MCs derivadas de médula ósea (BMMCs), se estimó que un solo MC produce 2 pg de ARN. Antes se realizó un análisis comparativo de MCs de diferentes tejidos, que primero evaluó la exactitud y reproducibilidad de tres rondas de el método de amplificación de ARN basada en T7, comenzando con la cantidad de ARN que se puede obtener a partir de un solo MC. Para evaluar esto, primero comparamos los resultados de los microarrays obtuvieron a partir de 5 g de ARN BMMC preparado por el protocolo estándar con los obtenidos a partir del mismo ARN diluido 10 5 ó 10 6 veces (30 pg, 10 pg y 2 pg) y se sometieron a tres rondas de amplificación a base de T7 (Figura 1a-c). Aunque tres rondas de amplificación produjo suficiente cantidad de ARN para el análisis de microarrays (> 20 g), incluso en el caso de 2 RNA pg, el análisis gráfico de dispersión reveló que las cualidades de los resultados obtenidos fueron muy diferentes entre las muestras de 5 g y 2 RNA pg. Los genes juzgadas como 'Presencia' tanto en 30 pg y 5 g de ARN eran 8.149 genes, lo que correspondió a 72% de los genes juzgadas como 'Presencia' en el 5 g de ARN (11.344 genes; Figura 1a), mientras que sólo 4.116 genes fueron juzgados como 'Presencia' tanto en 2 pg y 5 g de ARN, lo que corresponde a sólo el 36% de los genes juzgadas como 'Presencia' en el 5 g de ARN (Figura 1c). La disminución en el número de genes juzgadas como 'Presencia' en las muestras diluidas (30 pg, 10 pg y 2 pg) puede ser debido a la pérdida de especies de ARN número bajo de copias durante la amplificación. Figura 1 Las comparaciones de los tres productos amplificados redondas empezando con cantidades muy pequeñas de ARN. (A-c) sesgos de amplificación en los productos a partir de una pequeña cantidad de ARN. gráficos de dispersión de intensidad de la señal obtuvieron a partir de 5 g de ARN BMMC preparado por el protocolo estándar y de 30 pg (un
), 10 pg (b
) y 2 pg (c
) de ARN preparado por BMMC se muestran tres rondas de amplificación. (D, e) La reproducibilidad de la amplificación de tres rondas de una pequeña cantidad de ARN. Gráficos de dispersión de intensidad de la señal entre dos productos independientes de 30 pg de RNA BMMC (BMMC 30 pg-1 y BMMC 30 pg-2) (d
) o de 2 pg de ARN BMMC (BMMC 2 pg-1 y 2 BMMC pg-2) (e
), se muestran. Los puntos rojos muestran conjuntos de sonda juzgadas como "Presencia", y puntos amarillos representan conjuntos de sonda juzgadas como "Ausencia" en ambas matrices. Los puntos azules muestran conjuntos de sonda juzgadas como "presencia" o bien sólo en matriz. Se presentan los coeficientes de correlación (r). Los mismos, umbrales de inducción y de supresión de cuatro de plegado se indican como líneas diagonales. Genes juzgadas como "Presencia" se colocan en grupos correspondientes a pairwise superposiciones muestran en los diagramas de Venn que se acompañan.
A continuación examinó la reproducibilidad de los resultados de los microarrays obtenidos a partir de dos conjuntos de 30 pg muestras de ARN BMMC (30 pg-1 y 30 pg-2) o dos conjuntos de muestras de 2 pg (2 pg-1 y 2 pg-2) (Figura 1d y 1e). En las 30 muestras de ARN PG, 7.537 (30 pg-1) y 8.777 (30 pg-2) genes fueron juzgados como "Presencia". Sin embargo, sólo 4.324 (2 pg-1) y 4460 (2 pg-2) genes fueron juzgados como 'Presencia' en cada muestra de ARN 2 pg, sugiriendo de nuevo la pérdida de ARN bajo número de copias durante la amplificación de una pequeña cantidad de ARN. En cuanto a la reproducibilidad, el 86% de los genes de la "presencia" en la 30 pg-1 y el 74% de los genes "presencia" en la pg-2 muestra de 30 fueron juzgados como "Presencia" en ambas muestras de ARN de 30 pg, mientras que sólo el 57 % de los genes "presencia" en la 2 pg-1 y 55% de los genes "presencia" en la 2 pg-2 muestra fueron juzgados como 'Presencia' en ambas muestras de ARN 2 pg. Estos resultados sugieren que los productos amplificados a partir del ARN de un solo MC (alrededor de 2 pg) por el método corriente pueden incluir artefactos de amplificación considerables que causan problemas en la precisión y la reproducibilidad. Por otra parte, debido a la reproducibilidad más alta (> 74%), se concluyó que la amplificación de RNA 30 pg recogido de 15 MCs sería adecuado para el análisis práctico de tejido MCs. Sobre la base de estos resultados, establecemos nuestro objetivo en este estudio para adquirir los perfiles de expresión génica de los MCs combinados de diferentes regiones. Para minimizar la influencia de las variaciones de célula a célula dentro de los mismos artefactos de clase y de amplificación de potencial, hemos preparado tres conjuntos de 15 MCs para cada región y genes en comparación con la expresión significativamente diferente entre MCs de las diferentes regiones (Figura 2b). Elegimos el estómago como órgano de origen, ya que podemos aislar dos tipos de MCs de la mucosa (MMC) y los (SMC) regiones de submucosa de las mismas secciones, y MMC y las SMC se ha sospechado de ser diferente en varias propiedades MC como proteasa perfil de expresión y la sensibilidad de la tinción de safranina [1, 11]. Figura 2 perfiles de expresión génica de las CML y MMC de tejido del estómago. (A) El aislamiento de toluidina MCs teñidas de azul en la submucosa (SMC; paneles superiores
) y la mucosa (MMC;
paneles inferiores) de las secciones del estómago. Un SMC (flecha
) y MMC (punta de flecha
) que fue metacromáticamente tiñó con azul de toluidina antes de microdisección (paneles de la izquierda
) desaparecieron después de microdisección con una pipeta de parche (paneles de la derecha
). Bares
, 10 micras. (B) Esquema de la estrategia experimental. (C) El etiquetado y la ARN antisentido fragmentadas de tres muestras individuales SMC, tres muestras individuales MMC y de las muestras de células sin 'se hibridan con una matriz de murino. Los diagramas de dispersión para 'ninguna célula' (eje x) y SMC1 (eje y) (superior izquierda
), 'ninguna célula' (eje x) y MMC1 (eje y) (abajo a la izquierda
), SMC1 (x eje y) y SMC2 (eje y) (parte superior central
), MMC1 (eje x) y mmc2 (eje y) (parte inferior central
), SMC1 (eje x) y MMC1 (eje y) (parte superior derecha
) se muestran. Los coeficientes de correlación (r) para la comparación dentro sMC1-3, dentro mMC1-3 y entre las CML y MMC se presentan como medias ± S. D. Los puntos rojos muestran conjuntos de sonda juzgadas como "Presencia", y puntos amarillos representan conjuntos de sonda juzgadas como "Ausencia" en ambas matrices. Los puntos azules muestran conjuntos de sonda juzgadas como "presencia" o bien sólo en matriz. Los mismos, umbrales de inducción y de supresión de dos veces se indican como líneas diagonales.
Perfiles de expresión génica de la submucosa y la mucosa MCs desde el estómago
para visualizar dos tipos de MCs en el estómago sin causar la degradación del ARN, las secciones se fijo con fijador de Carnoy y metacromáticamente teñidas con azul de toluidina durante unos segundos. CML y MMC se microdissected usando una pipeta de parche (Figura 2a y 2b). Hemos preparado tres series de 15 MCs para cada región, extrajeron su ARN y ellos fueron amplificados por separado (SMC 1, SMC 2, SMC 3, y MMC 1, MMC 2, MMC 3). Para mejorar la recuperación de la extracción de tan poco como 30 pg de RNA, se utilizó 'poli G' como un vehículo, que no interfiera con la siguiente amplificación de ARN o la hibridación del producto amplificado a la matriz (datos no mostrados). Para examinar los efectos de los productos de artefactos no específicamente amplificados, se realizó el procedimiento de extracción de ARN /amplificación sin la adición de células microdissected ( "no celular") como un control negativo (que se describe en "Materiales y métodos
"). Los ARN amplificados de las CML, MMC y el control "ninguna célula" se hibridaron por separado a un microarray murino. Los valores de la señal de la muestra "ninguna célula" fueron bajas en general y similar a los niveles de fondo (Figura 2C). Los gráficos de dispersión de las muestras preparadas de forma independiente dentro del mismo grupo (por ejemplo, SMC 1 vs SMC 2) mostró un patrón de expresión similar; el coeficiente de correlación promedio para todas sonda de conjuntos fue 0,945 ± 0,004 y 0,893 ± 0,019 en las CML y MMC, respectivamente (n = 3
). Por el contrario, el coeficiente de correlación promedio entre las CML y MMC fue 0,752 ± 0,034 (n = 3
), que fue mucho más bajos que los de un mismo grupo, lo que sugiere que sus patrones de expresión de genes son diferentes.
Evalúan a continuación la precisión y reproducibilidad de nuestro método por otros análisis completos (análisis de agrupamiento jerárquico y análisis de componentes principales [PCA]) usando todos los conjuntos de sonda. microarrays de datos obtenidos a partir de las CML, MMC, MC derivadas de la piel, MCs peritoneales, BMMCs y no MCs (macrófagos y fibroblastos) se aplicaron a estos análisis. En primer lugar, comprueba si el proceso de amplificación en nuestro método afecta el perfil de expresión global debido a la amplificación no lineal. Los resultados de las muestras de BMMC utilizando ARN preparado por el protocolo estándar (BMMC-std) o el método de amplificación (BMMC-amp) fueron sometidos a estos análisis. Tanto el análisis de agrupamiento jerárquico y PCA revelaron que datos de microarrays de BMMC-std y BMMC-amp se agruparon en el mismo grupo (Figura 3a y 3b), lo que sugiere que la similitud global en los perfiles de expresión de genes se mantiene durante el proceso de amplificación. A continuación examinó la similitud de los patrones de expresión en tres muestras independientes SMC o MMC. Tras el análisis de agrupamiento y PCA, SMC 1-3 y MMC 1-3 se agruparon en el mismo grupo, respectivamente. PCA también mostró que los perfiles de expresión de las CML, MMC y BMMCs son diferentes entre sí (Figura 3b). Figura análisis de la expresión génica global de 3 SMC 1-3 y 1-3 MMC. (A) La agrupación jerárquica de la expresión génica global de diversas preparaciones de MC y no MC. Tres asaltos productos amplificados de sMC1-3, mMC1-3, la piel y MCs BMMCs, y los productos estándar de BMMCs, se analizaron MCs peritoneales, macrófagos y fibroblastos. (B) El análisis de componentes principales (PCA) revela distintos perfiles de expresión génica de sMC1-3, mMC1-3, y dos preparaciones de BMMCs. El recuadro de puntos azul indica MMC, la plaza roja punteada indica las SMC, y el cuadrado negro punteada indica BMMCs.
A continuación, se compararon los MCs estomacales derivados (CML y MMC) con MCs derivadas de la piel, MCs peritoneales, y no BMMCs -MCS (macrófagos y fibroblastos) por análisis de agrupamiento. Los MCs derivadas de tejido del estómago (MCs y la piel MC) se agruparon por separado de los MC peritoneales y BMMCs. Estos resultados pueden reflejar diferentes propiedades entre MCs derivadas de tejido con la adhesión firme a las células vecinas y MCs flotante sin un contacto estrecho. En cuanto a la similitud de MCs con fibroblastos y macrófagos, es razonable que los fibroblastos son más distante de MCs y macrófagos están más cerca de MCs como una familia de leucocitos.
Validación de los resultados de microarrays de análisis en tiempo real de RT-PCR
a continuación se investigó si las señales de hibridación de los genes marcadores conocidos específicos para las SMC y MMC mostraron las tendencias esperadas de expresión [12, 14]. Los genes-MMC específica, proteasa mastocitos 1 (Mcpt1
) y 2 (Mcpt2
) mostraron valores más altos en MMCs, mientras que los genes marcadores SMC-específicos, proteasa mastocitos 4 (Mcpt4
) y quimasa 2 (CMA2
), mostraron valores de señal más altos en las SMC (Tabla 1 y la Figura 4a) [15-29]. Por otra parte, los marcadores MC-comunes tales como oncogén kit (Kit
) y del receptor Fcε (Fcer1a
) mostraron valores de señal significativos sin sesgo entre MMCs y las SMC. A fin de evaluar los resultados, que mide los niveles de expresión de estos genes marcadores de tiempo real RT-PCR utilizando ARN de las MCs independientemente aislados (Figura 4b). Por otra parte, se seleccionaron al azar tres genes que muestran 'MMC-sesgado' expresión y otros tres genes que muestran 'SMC-sesgada' expresión; expresión de estos genes en MCs no se ha informado anteriormente (Figura 4a). No hubo diferencias significativas en los niveles de expresión de Kit Opiniones y Fcer1a
entre MMC y CML. Por el contrario, los marcadores-MMC específica Mcpt1
y Mcpt2
y los genes de MMC-sesgado ', Anxa10, CTSE
, y Fos
mostró una mayor expresión en los MMC, y el SMC-específica marcadores Mcpt4 Opiniones y CMA2
y los genes "SMC-polarizados", cnn1, Ces3
, y CPE
mostró una mayor expresión en las CML. Estos resultados indican que los resultados de microarrays son fiables y reflejan los perfiles de expresión génica de las SMC intactas y MMC en el estómago. Figura 4 Validación de los genes expresados ​​diferencialmente entre las CML y MMC. (A) SMC-específicos (CMA2
, Mcpt4
), MMC-específica (Mcpt1
, Mcpt2
) y MC-comunes marcadores (Fcer1a
y Kit
) (izquierda Panel
) y seis genes seleccionados al azar (Ces3
, cnn1
, CPE
, Anxa10
, CTSE
y Fos
) (panel derecho
) se indican en la correlación entre las gráficas de dispersión representativo SMC1 y MMC1. Los mismos, umbrales de inducción y de supresión de dos veces se indican como una línea de color amarillo, azul y rojo, respectivamente. (B) Los niveles de expresión de los genes en (a) fueron verificados por tiempo real de RT-PCR. Los valores representan la relación entre los niveles de expresión relativos de MMC a las CML, y se muestran como media ± S. D. (N = 3). La especificidad del producto de PCR se confirmó mediante electroforesis y el análisis de la temperatura de fusión del gel. El nivel de expresión de cada gen se normalizó a 28S ARN ribosomal.
Tabla 1 Resumen de los genes examinados por análisis de PCR en tiempo real.
Gene Símbolo

gene Nombre
RefSeq transcripción ID
referencia
kit
kit oncogén
NM_021099
15
Fcer1a

fragmento Fc de la IgE, alta afinidad I, receptor para el polipéptido α
NM_010184
16
Mcpt1
mástil proteasa celular 1

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