Charakterisierung von Genexpressionsprofilen für unterschiedliche Arten von Mastzellen aus gepoolten Maus Magen Subregionen durch eine RNA-Amplifikation method

Charakterisierung von Genexpressionsprofilen für verschiedene Arten von Mastzellen aus der Maus gepoolt Magen Subregionen durch eine RNA-Amplifikationsverfahren
Zusammenfassung
Hintergrund
Mastzellen (MCs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Allergie und der angeborenen Immunität und bestehen aus heterogenen Unterklassen. Allerdings ist die molekulare Basis der unterschiedlichen Eigenschaften dieser mehrere MC-Subklassen Bestimmung unklar bleibt.
Ergebnis einschränken, diesen Ansatz entwickelten wir ein Verfahren zur RNA-Extraktion /Verstärkung für intakt in vivo
MCs aus gefrorenen Gewebeschnitten gepoolt , ermöglichte es uns, die den globalen Genexpressionsmuster von gepoolten MCs Zugehörigkeit zu derselben Unterklasse zu erhalten. MCs wurden aus der Submukosa (SMCs) und Schleimhaut (MMCs) von Maus-Bauchabschnitte getrennt wurden jeweils 15 Zellen gepoolt, und deren RNA wurde extrahiert, verstärkt und auf Microarray-Analyse unterzogen. Bekannte Markergene spezifisch für MMCs und SMCs zeigte die Expression Trends erwartet, was auf die Genauigkeit der Analyse.
Wir identifizierten 1.272 Gene signifikant unterschiedliche Expressionsniveaus zwischen SMCs und MMCs zeigt, und klassifiziert sie in Clustern auf der Grundlage der Ähnlichkeit ihrer Expressionsprofile im Vergleich zu Knochenmark stammenden MCs, die die kultivierten MCs mit so genannten "unreif" Objekte sind. Darunter fanden wir, dass mehrere wichtige Gene wie Notch4
hatte SmC-Expression und vorbelastet Ptgr1
mmc vorgespannten Ausdruck hatte. Außerdem gibt es einen Unterschied in der Expression verschiedener Gene, einschließlich der extrazellulären Matrix Proteinkomponenten, Adhäsionsmoleküle und Zytoskelett-Proteine ​​zwischen den beiden MC-Subklassen, die funktionelle Anpassung jedes MC an die mukosale oder submukosale Umgebung im Magen zurückgelegt werden muss.
Fazit Durch die Verwendung der Methode der RNA-Amplifikation aus gepoolten intakten MCs
, sind wir für die unterschiedlichen Genexpressionsprofile von SMCs und MMCs in der Maus Magen. Unsere Ergebnisse bieten Einblick in mögliche unbekannten Eigenschaften, die spezifisch für jede MC-Unterklasse.
Hintergrund
Mastzellen (MCs) von hämatopoetischen Stammzellen abgeleitet sind und eine wichtige Rolle bei allergischen Reaktionen, die angeborene Immunität und die Abwehr von Parasiten-Infektion spielen. Im Gegensatz zu anderen Blutzellen wandern MCs in den peripheren Geweben wie unreife Vorläuferzellen und differenzieren sich in reifen Mastzellen. Eines der einzigartigen Merkmale von MCs ist, dass sie eine Vielzahl von Phänotypen zeigen auf der unterschiedlichen Gewebemikroumgebung ihrer Reifung abhängig [1]. In MCs, verschiedene sind MC-spezifische Serinproteasen in den sekretorischen Granula gespeichert sind, und deren Gen und Protein-Ausdrücke werden dramatisch verändert, wenn ihre Zellumgebung verändert wird. Zum Beispiel Reynolds et al.
Haben, dass in verschiedenen Mastzellpopulationen [2] in unterschiedlichen Kombinationen exprimiert werden mindestens sechs verschiedene Mitglieder der Maus MC-spezifischen Serin-Proteasen gezeigt. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien gezeigt, dass reife MCs variieren in Bezug auf welche Oberflächenrezeptoren und Lipidmediatoren sie zum Ausdruck bringen [3, 4]. Da jeder Mastzellpopulation in vivo
eine spezifische Rolle im Körper spielen muss, ist es wichtig, den Charakter jeder Population von MCs zu bestimmen. Umfassende Genexpressionsanalyse
ist ein leistungsfähiger Ansatz, um die Charakterisierung verschiedener MC zu verstehen Subpopulationen. Bisher wurden mehrere Studien über Mikroarray-Analyse von MCs durchgeführt worden [5-7], aber die meisten von ihnen behandelt MCs in vitro kultiviert
. Alternativ Genexpressionsprofile von MCs isoliert von Haut und Lunge wurden analysiert [3, 8-10]. Jedoch analysiert die Anzahl der MCs als einer Probe relativ hoch waren, und sie wurden auf physikalischen Kräften ausgesetzt, Enzyme und Anti-Kit-Antikörper zur Reinigung, bei der die ursprünglichen Eigenschaften des MCs beeinflusst worden sein kann.
Im gastrointestinalen Darm-Trakt gibt es MCs, die hauptsächlich klassifiziert in zwei Unterklassen sind; Schleimhaut MCs (MMCs) und Submukosa-MCs (SMCs) auf der Grundlage ihrer Lage, Morphologie (Form und Größe) und Granulat Inhalt [11, 12]. MMCs werden hauptsächlich in der Schleimhaut des Magen-Darm-System, mit Chondroitinsulfat enthaltenden Granula gefunden, die mit Toluidin-Blau gefärbt sind, aber nicht Safranin, und ihre Aktivierung tritt während der Parasiten-Infektion [13], während SMCs in der Submukosa des Magen lokalisiert sind Darm-Trakt und ihre Körnchen sind reich an Heparin und gefärbt mit beiden Toluidinblau und Safranin [1, 11]. Allerdings ist die molekulare Grundlage der Unterschiede in den biochemischen Eigenschaften dieser beiden MC-Subklassen bleibt unsicher, teilweise aufgrund der Schwierigkeit ihrer Isolation zu bestimmen.
Um diese Probleme zu überwinden, hier haben wir ein Verfahren zur RNA-Amplifikation von intakten MCs aus gefrorenem isoliert Gewebeschnitte, die es uns ermöglicht, um bequem die globale Genexpressionsmuster von MCs in verschiedenen Geweben erhalten. Um diese Methode zu validieren, stellten wir fest, zuerst die minimale Zellzahl erforderlich, um reproduzierbare RNA-Amplifikation zu erreichen. Wir verglichen die Genexpressionsprofile von einer kleinen Anzahl von MMCs und SMCs in der Maus Magen erhalten und fanden mehrere Schlüsselgene spezifisch in einer Unterklasse von MCs ausgedrückt werden, die einige Aspekte der unterschiedlichen Eigenschaften zwischen den beiden MC Subklassen gelegt werden in den Magen-Darm-Trakt.
Ergebnisse und Diskussion
Entwicklung eines RNA Amplifikationsprotokoll Genexpressionsprofile von einer kleinen Menge an RNA zu erhalten kaufen wir um einen Einblick in die funktionellen Unterschiede zwischen den verschiedenen Unterklassen von MCs gewinnen, verwendet drei Runden der T7 RNA-basierten Amplifikationsverfahren. Basierend auf den Vorversuchen Peritonealdialyse MCs und Knochenmark stammenden MCs (BMMCs) unter Verwendung schätzten wir, dass eine einzelne MC 2 pg RNA ergibt. Bevor wir vergleichende Analyse der MCs aus verschiedenen Geweben durchgeführt wird, untersuchten wir zuerst die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der drei Runden der T7 RNA-basierten Amplifikationsverfahren, mit der Menge der RNA ausgehend, die von einem einzelnen MC erhalten werden kann. Um dies zu bewerten, verglichen wir zuerst die Mikroarray-Ergebnisse aus 5 ug BMMC RNA durch das Standardprotokoll mit den aus der gleichen RNA verdünnt 10 erhalten wurde, erhalten 5- oder 10 6-fach (30 pg, 10 pg und 2 pg) und einer drei Runden der T7-basierte Amplifikation (1a-c). offenbart auch im Fall von 2 pg RNA, Scatter-Plot-Analyse, dass die Eigenschaften der erzielten Ergebnisse zwischen den Proben von 5 &mgr; g ziemlich verschieden waren und 2, obwohl drei Amplifikationsrunden ausreichende Menge an RNA für die Mikroarray-Analyse (20 &mgr; g >) ergab pg RNA. Die Gene als "Presence" in den beiden 30 pg beurteilt und 5 ug RNA wurden 8149 Gene, die zu 72% der Gene entsprach beurteilt als "Präsenz" in der 5 ug RNA (11.344 Gene; Abbildung 1a), während nur 4.116 Gene wurden als "Präsenz" in beiden 2 pg und 5 ug RNA beurteilt, die als "Präsenz" in der 5 ug RNA (Abbildung 1c) beurteilt nur 36% der Gene entsprach. Die Abnahme der Zahl der Gene als "Presence" in den verdünnten Proben (30 pg, 10 pg und 2 pg) beurteilt, kann während der Verstärkung auf den Verlust von niedriger Kopienzahl RNA-Spezies zurückzuführen sein. Abbildung 1 Vergleiche von drei Rund amplifizierten Produkte mit sehr geringen Mengen an RNA zu starten. (A-c) Amplification Vorspannungen in den Produkten aus einer geringen Menge an RNA zu starten. Streudiagramme der Signalintensität von 5 ug BMMC RNA durch das Standardprotokoll und von 30 pg (a
), 10 pg (b
) und 2 pg (c
) von BMMC RNA, hergestellt, erhalten durch drei Amplifikationsrunden gezeigt. (D, e) Reproduzierbarkeit der drei Runden Amplifizierung einer geringen Menge an RNA. Streudiagramme der Signalintensität zwischen zwei unabhängigen Produkte von 30 pg von BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 und BMMC 30 pg-2) (d
) oder von 2 pg von BMMC RNA (BMMC 2 pg-1 und BMMC 2 pg-2) (e
), gezeigt. Rote Punkte zeigen Sondensätze wie "Presence" beurteilt, und gelbe Punkte stellen Sondensätze beurteilt als "Abwesenheit" in beiden Feldern. Blaue Punkte zeigen Sondensätze wie "Presence" beurteilt nur in jedem Array. Die Korrelationskoeffizienten (r) dargestellt. Die gleichen, vierfache Induktion und Unterdrückungsschwellenwerte werden als diagonale Linien angedeutet. Gene als "Presence" beurteilt platziert sind in Gruppen paarweise entsprechende Überlappungen in den beigefügten Venn-Diagramme dargestellt.
Nächstes untersuchten wir die Reproduzierbarkeit der Mikroarray-Ergebnisse aus zwei Sätzen von 30 pg BMMC RNA Proben erhalten (30 pg-1 und 30 pg-2) oder zwei Gruppen von 2 pg Proben (2 pg-1 und 2 pg-2) (Figur 1d und 1e). In den 30 pg RNA-Proben, 7537 (30 pg-1) und 8777 (30 pg-2) Gene wurden als "Presence" beurteilt. Jedoch nur 4.324 (2 pg-1) und 4460 (2 pg-2) -Gene wurden als "Presence" beurteilt in jedem 2 pg RNA Probe, wiederum darauf hindeutet, den Verlust von niedriger Kopienzahl RNAs während der Amplifikation von einer kleinen Menge an RNA. Im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit, 86% der "Präsenz" Gene in der 30 pg-1 und 74% der "Präsenz" Gene in der 30 pg-2 Probe wurden als "Presence" in den beiden 30 pg RNA-Proben beurteilt, während nur 57 % der 'Presence' Gene in der 2 pg-1 und 55% der "Präsenz" Gene in der 2 pg-2 Probe wurden als "Presence" in den beiden 2 pg RNA-Proben beurteilt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die verstärkten Produkte aus der RNA, die aus einem einzigen MC (ca. 2 pg) von der aktuellen Methode kann eine beträchtliche Verstärkung Artefakte gehören Probleme bei der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu verursachen. Auf der anderen Seite, aufgrund der höheren Reproduzierbarkeit (> 74%), schlossen wir, daß die Amplifikation von 30 pg RNA aus 15 MCs gesammelt für die praktische Analyse von Gewebe MCs geeignet wäre. Basierend auf diesen Ergebnissen setzen wir unser Ziel in dieser Studie Genexpressionsprofile von MCs aus verschiedenen Regionen gebündelt zu erwerben. Um den Einfluss der von Zelle zu Zelle Schwankungen innerhalb der gleichen Klasse und potentielle Verstärkungs Artefakte zu minimieren, hergestellt drei Sätze von 15 MCs für jede Region und verglichen Gene mit signifikant unterschiedlichen Ausdruck zwischen MCs von den unterschiedlichen Bereichen (Abbildung 2b). Wir entschieden uns für Magen als Quelle Orgel, da wir zwei Arten von MCs aus der Schleimhaut isolieren (MMC) und die Submukosa (smc) Regionen der gleichen Abschnitte und MMCs und SMCs vermutet wurden in mehreren MC Eigenschaften unterschiedlich zu sein wie Protease-Expressionsprofil und Empfindlichkeit gegenüber Safranin-Färbung [1, 11]. Abbildung 2 Genexpressionsprofile von SMCs und MMCs von Magengewebe. (A) Isolierung von Toluidinblau-gefärbten MCs in der Submukosa (smc; oberen Platten
) und die Schleimhaut (mmc; unteren Platten
) von Magenschnitten. Ein smc (Pfeil
) und MMC- (Pfeilspitze
), die metachromatisch mit Toluidinblau vor Mikrodissektion (linke Felder
) gefärbt war verschwunden, nachdem Mikrodissektion mit einer Patch-Pipette (rechte Felder
). Bars
, 10 &mgr; m. (B) Überblick über die experimentelle Strategie. (C) Beschriftete und fragmentierten Antisense-RNAs aus drei einzelnen smc Proben, drei Einzel mmc Proben und die "keine Zelle" Proben wurden einem Murine Array hybridisiert. Streudiagramme für "keine Zelle" (x-Achse) und SMC1 (y-Achse) (oben links
), "keine Zelle" (x-Achse) und MMC1 (y-Achse) (unten links
), SMC1 (x Achse) und SMC2 (y-Achse) (obere Mitte
), MMC1 (x-Achse) und mmc2 (y-Achse) (unten Mitte
), SMC1 (x-Achse) und MMC1 (y-Achse) (oben rechts
) gezeigt. Die Korrelationskoeffizienten (r) zum Vergleich innerhalb sMC1-3 innerhalb mMC1-3 und zwischen SMCs und MMCs werden dargestellt als Mittelwert ± S.D. Rote Punkte zeigen Sondensätze wie "Presence" beurteilt, und gelbe Punkte stellen Sondensätze beurteilt als "Abwesenheit" in beiden Feldern. Blaue Punkte zeigen Sondensätze wie "Presence" beurteilt nur in jedem Array. Die gleichen, zweifache Induktion und Unterdrückung Schwellen als diagonale Linien angedeutet sind.
Genexpressionsprofile von submuköse und Schleimhaut MCs aus dem Magen
Zum ohne dass RNA-Abbau im Magen zwei Arten von MCs sichtbar zu machen, wurden die Schnitte mit Carnoy-Fixiermittel fixiert und metachromatisch mit Toluidinblau für einige Sekunden gefärbt. SMCs und MMCs wurden mikrodissezierten eine Patchpipette (2a und 2b) verwendet wird. Wir bereiteten drei Sätze von 15 MCs für jede Region, extrahiert ihre RNA und individuell verstärkt sie (smc 1, smc 2, smc 3 und mmc 1, MMC- 2, mmc 3). Um die Rückgewinnung der Extraktion von so wenig wie 30 pg der RNA zu verbessern, verwendeten wir 'poly G' als Träger, die nicht mit der folgenden RNA-Amplifikation oder Hybridisierung des amplifizierten Produkts an das Array (Daten nicht gezeigt) nicht stört. Um die Auswirkungen von unspezifisch verstärkt Artefakt Produkte untersuchen, führten wir die RNA-Extraktion /Verstärkungsverfahren ohne Zugabe von microdissected Zellen ( "keine Zelle") als Negativkontrolle (beschrieben in "Materialien und Methoden
"). Die verstärkten RNAs von SMCs, MMCs und die "keine Zelle" Kontrolle wurden separat zu einem murinen Microarray hybridisiert. Die Signalwerte in der "keine Zelle" Probe waren im Allgemeinen und ähnlich wie die Hintergrundwerte (Abbildung 2c) gering. Die Streudiagramme der Proben unabhängig innerhalb der gleichen Gruppe vorbereitet (z smc 1 vs smc 2) zeigte ein ähnliches Expressionsmuster; der durchschnittliche Korrelationskoeffizient für alle Sondensätze war 0,945 ± 0,004 und 0,893 ± 0,019 in SMCs und MMCs, bzw. (n
= 3). Im Gegensatz dazu war der durchschnittliche Korrelationskoeffizient zwischen SMCs und MMCs 0,752 ± 0,034 (n
= 3), die als die viel niedriger war innerhalb der gleichen Gruppe, was darauf hindeutet, dass ihre Genexpressionsmuster unterschiedlich sind. Kaufen Wir weiter ausgewertet die Genauigkeit und die Reproduzierbarkeit der Methode durch andere umfassende Analysen (hierarchische Clustering-Analyse und Hauptkomponentenanalyse [PCA]) unter Verwendung aller Sondensätze. Microarray-Daten von SMCs erhalten, MMCs, haut abgeleitet MCs, Peritonealdialyse MCs, BMMCs und nicht-MCs (Makrophagen und Fibroblasten) wurden auf diese Analysen angewandt. Wir prüften zunächst, ob der Verstärkungsprozess in unserem Verfahren die globale Expressionsprofil wirkt sich aufgrund der nichtlinearen Verstärkung. Die Ergebnisse der Proben BMMC RNA durch das Standardprotokoll (BMMC-std) oder das Amplifikationsverfahren unter Verwendung von (BMMC-amp) wurden zu dieser Analysen unterzogen. Sowohl hierarchischen Clustering-Analyse und PCA zeigte, dass Mikroarray-Daten von BMMC-std und BMMC-amp wurden in der gleichen Gruppe gruppierten (3a und 3b), was darauf hindeutet, dass die globale Ähnlichkeit in Genexpressionsprofile während des Verstärkungsprozesses aufrechterhalten wird. Nächstes untersuchten wir die Ähnlichkeit von Expressionsmuster in drei unabhängigen smc oder MMC- Proben. Bei der Clustering-Analyse und PCA, smc 1-3 und mmc 1-3 wurden in der gleichen Gruppe zusammengefaßt sind. PCA zeigte auch, dass die Expressionsprofile von SMCs, MMCs und BMMCs zueinander unterschiedlich sind (Abbildung 3b). Abbildung 3 Globale Genexpressionsanalyse von smc 1-3 und 1-3 mmc. (A) Hierarchical Clustering der globalen Genexpression verschiedener Präparate von MCs und nicht-MCs. Drei-Runden-amplifizierte Produkte von sMC1-3, mMC1-3, Haut MCs und BMMCs und die Standardprodukte von BMMCs, Peritonealdialyse MCs wurden Makrophagen und Fibroblasten analysiert. (B) Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigt verschiedene Genexpressionsprofile von sMC1-3, mMC1-3 und zwei Präparate von BMMCs. Der blaue gestrichelte Quadrat zeigt MMCs, die rote gepunktete Quadrat zeigt SMCs und das schwarze gepunktete Quadrat zeigt BMMCs.
Wir verglichen die Magen-abgeleiteten MCs (SMCs und MMCs) mit der Haut stamm MCs, Peritonealdialyse MCs, BMMCs und nicht -MCS (Makrophagen und Fibroblasten) durch Analyse Clustering. Die Gewebe stamm MCs (Magen MCs und die Haut MCs) wurden getrennt von Peritonealdialyse MCs und BMMCs gruppierten. Diese Ergebnisse spiegeln möglicherweise unterschiedliche Eigenschaften zwischen Gewebe stamm MCs mit fester Haftung zu den benachbarten Zellen und schwebenden MCs ohne engen Kontakt. Was die Ähnlichkeit von MCs mit Fibroblasten und Makrophagen, ist es sinnvoll, dass Fibroblasten von MCs am weitesten entfernten und Makrophagen sind näher an MCs als Leukozyten-Familie.
Validierung von Microarray-Ergebnisse durch Echtzeit-RT-PCR-Analyse kaufen Wir nächstes untersucht, ob die Hybridisierungssignale bekannter Markergene spezifisch für SMCs und MMCs die erwarteten Ausdruck Trends zeigten [12, 14]. Die MMC-spezifische Gene, Mastzell-Protease 1 (Mcpt1
) und 2 (Mcpt2
) zeigten höhere Werte in MMCs, während der smc-spezifischen Markergene, Mastzell-Protease-4 (Mcpt4
) und Chymase 2 (CMA2
), zeigten eine höhere Signalwerte in SMCs (Tabelle 1 und Abbildung 4a) [15-29]. Auf der anderen Seite, MC-common Marker wie Kit Onkogen (Kit
) und Fc ε Rezeptor (FCER1A
) zeigte eine signifikante Signalwerte ohne Vorspannung zwischen MMCs und SMCs. Um die Ergebnisse zu bewerten, messen wir die Expressionsniveaus dieser Markergene durch Echtzeit-RT-PCR unter Verwendung von RNA aus den unabhängig isolierten MCs (Abbildung 4b). Außerdem haben wir drei Gene zeigt 'mmc-voreingenommen "Expression und drei weitere Gene zeigt' smc-voreingenommen 'Ausdruck zufällig ausgewählt; Expression dieser Gene in MCs nicht zuvor (Abbildung 4a) berichtet. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den Expressionsniveaus von Kit
und FCER1A
zwischen MMCs und SMCs. Im Gegensatz dazu ist die MMC-spezifische Marker Mcpt1
und Mcpt2
und die "mmc-voreingenommen" Gene, Anxa10, CTSE
und Fos
zeigten höhere Expression in MMCs und der smc-spezifische Marker Mcpt4
und CMA2
und die "smc-voreingenommen" Gene, CNN1, Ces3
und Cpe
SMCs höhere Expression zeigte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Microarray-Ergebnisse sind zuverlässig und spiegeln die Genexpressionsprofile von intakten SMCs und MMCs im Magen. 4 Validierung der differentiell exprimierten Gene zwischen SMCs und MMCs. (A) smc spezifische (CMA2
, Mcpt4
), MMC- spezifische (Mcpt1
, Mcpt2
) und MC-common-Marker (FCER1A
und Kit
) (links Panel
) und sechs zufällig ausgewählten Gene (Ces3
, CNN1
, Cpe
, Anxa10
, CTSE
und Fos
) (rechtes Bild
) angegeben in der repräsentativen Streukorrelationsdiagramme zwischen SMC1 und MMC1. Die gleichen, zweifache Induktion und Unterdrückungsschwellenwerte werden als gelben, blauen und roten Linie angezeigt, respectively. (B) Die Expressionsniveaus der Gene, die in (a) wurden überprüft durch Echtzeit-RT-PCR. Die Werte stellen das Verhältnis von relativen Expressionsniveaus von MMCs zu SMCs und sind als Mittelwert ± S.D. gezeigt (N = 3). Die Spezifität des PCR-Produkts wurde durch Gelelektrophorese und Analyse der Schmelztemperatur bestätigt. Das Expressionsniveau von jedem Gen wurde auf 28S ribosomale RNA normalisiert.
Tabelle 1 Zusammenfassung der Gene, die durch real-time PCR-Analyse untersucht.
Gene Symbol

Gene Namen
RefSeq Transcript ID
Referenz
Kit Bei
Kit Onkogen
NM_021099
15
FCER1A

Fc-Fragment von IgE, hohe Affinität I, Rezeptor für α-Polypeptid
NM_010184
16
Mcpt1
Mastzell-Protease 1 | NM_008570
17, 18
Mcpt2
Mastzell-Protease 2
NM_008571
19
Mcpt4
Mastzell-Protease 4
NM_010779
2, 20
CMA2

Chymase 2, Mastzellen (Mastzellen-Protease 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
Annexin A10
NM_011922
21
CTSE

Cathepsin E
NM_007799
22
Fos
FBJ Osteosarkom Onkogen
NM_010234
23
Ptgr1
Prostaglandin-Reduktase 1 (Leukotrien B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (Schweine)
CNN1
Calponin 1 | NM_009922
25
Ces3
carboxylesterase 3
NM_053200
26
Cpe
Carboxypeptidase E
NM_013494
27 (Rind)
Notch4
Notch-Gen-Homolog 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S ribosomale RNA
NR_003279
29
* die Sequenz-Codierung in diesem Papier ist die N-Terminus verkürzt-Form CMA2
, während die RefSeq " NM_001024714 "ist die vollständige Sequenz von CMA2
.
Clustering Analyse der Genexpressionsprofile und funktionelle Zuordnung zwischen SMCs und MMCs
der ~ 12.000 Gene auf dem Oligonukleotid-Array dargestellt, wählten wir 1272 Gene, deren Expressionsniveaus zwischen smc 1-3 und mmc 1-3 waren signifikant unterschiedlich (p
< 0,05, Limma t
Test). Das Expressionsniveau von jedem Gen wurde durch sein Niveau in BMMCs normalisiert, die kultiviert MCs mit so genannten "unreif" Eigenschaften und die ausgewählten Gene wurden in sieben Cluster klassifiziert mit der k
-Mittel Clustering-Algorithmus (CL1-7; 5a und zusätzliche Datei 1). Wir stuften auch die Gene in funktionale Kategorien, und die repräsentativen Gene sind (Abbildung 5b) aufgeführt. Unter ihnen sind 666 Gene (52,4%) zeigten smc-voreingenommen Ausdruck (CL1-3
); in 78% (519-Gene) von SmC reichen Gene, die Expressionsniveaus waren relativ niedrig in BMMCs und in SmC Augmented (CL1 & 2
). Zum Beispiel war das Expressionsniveau von Mcpt4
relativ niedrig in BMMCs, und wenn das Expressionsprofil von BMMCs die unreifen Eigenschaften des MC-Vorläufern reflektiert, Mcpt4
kann geschlossen werden, während der endgültigen Reifung in SMCs induziert werden. Interessanterweise ist die smc Markergene Mcpt5
und Mcpt6
in CL2 /3
eingestuft wurden, was darauf hindeutet, dass diese Gene in gewissem Maße exprimiert wurden in 'unreif' BMMCs, aber ihre Expression wurde während der Reifung in MMCs unterdrückt. Auf der anderen Seite, 606 Gene (47,6%) zeigten mmc-voreingenommen Ausdruck (CL4-7
); in 51% (334 Gene) von mmc reiche Gene, deren Expressionsniveaus in BMMCs waren niedrig, aber wurden in MMCs Augmented (CL4 & 5
). Beispielsweise die Expression von Mcpt1
war niedrig in "unreifen" BMMCs aber drastisch während der Reifung in MMCs induziert. Abbildung 5 Clustering Analyse der Genexpressionsprofile zwischen SMCs und MMCs. (A) Darstellung von mRNA Expression von sMC1-3 und mMC1-3 verglichen mit BMMCs. Die Farbe der Balken stellt das Verhältnis der Signalintensität zwischen unabhängigen Proben und BMMCs, nach der Skala auf der rechten oberen
gezeigt. Gene mit signifikant unterschiedlichen Ausdruck zwischen SMCs und MMCs (p
< 0,05, Limma t
Test) wurden ausgewählt (1272 Gene), und klassifiziert in sieben Clustern k
-Mittel Algorithmus (CL1-7 mit
). (B) Funktionale Kategorisierung repräsentativer Gene aus (a).
Proteinexpression von Notch4 in SMCs und Ptgr1 in MMCs in Magengewebe
Unter den Genen, zeigt die unterschiedliche Expression (Abbildung 5b), wir weiter konzentriert auf die Expression von Notch4
in SMCs und Ptgr1
in MMCs, von denen beide noch nie in MCs zuvor charakterisiert. Die Notch4
Genprodukt ist ein Mitglied der Notch-Familie, bestehend aus Transmembran-Rezeptoren, die von Zelloberflächenliganden an benachbarten Zellen aktiviert werden. Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass Notch-Signalweg in Lymphozyten und Mastzelldifferenzierung beteiligt ist [30, 31]. Wir haben bestätigt, dass erste Notch4
Expression signifikant höher in den separat gepoolt SMCs als MMCs durch Echtzeit-RT-PCR ist (Daten nicht gezeigt). Wir untersuchten als nächstes, ob das Protein in Notch4 SMCs ausschließlich vorhanden ist, durch Immunfärbung von Magengewebe (Abbildung 6a). Notch4 Signale wurden in den Nucleus artigen Strukturen von SMCs, aber nicht in denen von MMCs detektiert. Weiterhin wurden Notch4 Signale auch in der Haut gefunden MCs, die nebeneinander mit SMCs (Abbildung 3a) geclustert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass in Notch4 SMCs vorhanden ist, aber nicht in MMCs, und legen nahe, dass Notch4 nimmt an SmC spezifische Transkription von Notch-Zielgene, die für einige SmC Funktionen erforderlich sein kann. In hämatopoetischen Zellen, wurde berichtet, dass konstitutiv aktive Notch4 die Expansion von Vorläuferzellen fördert und inhibiert myeloische Differenzierung [32]. Da Notch-Liganden in Bindegeweben wie Haut Dermis bestehen [33] dargestellt sind, wird es interessant zu untersuchen, ob Notch4 eine Rolle bei der Differenzierung von SMCs und der Aufrechterhaltung der SmC Funktionen spielt. Abbildung 6 Immunhistochemische Analyse von Notch4 und Ptgr1 in SMCs und MMCs in Magengewebe. (A) Magen-Submukosa (SMCs; linke Platten
), Magenschleimhaut (MMCs, mittlere Platten
) und die Haut (Haut MCs, rechts Platten
) Abschnitte mit einem Anti-Notch4 Antikörper gefärbt wurden (untere Tafeln
) und mit Toluidinblau (obere Felder
). SMCs mit dem Anti-Notch4 Antikörper in den Magen-Submucosa und Haut Dermis gefärbt sind durch Pfeile angedeutet ist. Keine Färbung wurde in MMCs (Pfeilspitzen
) beobachtet, in der Magenschleimhaut lokalisiert. SMCs und MMCs wurden metachromatisch mit Toluidinblau gefärbt. (B) Magen-Submukosa (SMCs; linke Platten
) und Magenschleimhaut (MMCs, rechts Platten
) Abschnitte mit einem Anti-Ptgr1 Antikörper gefärbt wurden (untere Tafeln
) und mit Toluidinblau (obere Felder
). Keine Färbung mit dem Anti-Ptgr1 Antikörper wurde in der SMCs (Pfeil
) gefunden. Kleine Signale wurden in den MMCs beobachtet (Pfeilspitzen
). SMCs und MMCs wurden metachromatisch mit Toluidinblau gefärbt. Bars
, 25 &mgr; m (a, b).
Die Ptgr1
Produkt, 15-oxo-Prostaglandin-13-Reduktase /Leukotrien (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase ist ein essentielles Enzym für die Inaktivierung der Eicosanoide, wie Prostaglandin E 2 (PGE 2) und LTB 4 [34]. Obwohl es wurde berichtet, dass die Wege der Eicosanoid-Synthese unter den verschiedenen MC Subklassen unterscheiden [1, 4] deuten unsere Ergebnisse, dass die Inaktivierung System von Eicosanoiden auch unter den MC-Subklassen variiert. Ptgr1
Expression gefunden wurde als signifikant höher in den separat gepoolt MMCs durch Echtzeit-RT-PCR (Daten nicht gezeigt). Wir untersuchten auch Ptgr1 Expression in Magen Abschnitte durch Immunfärbung. Signale für die Ptgr1 Protein wurden in granulatartige Strukturen von MMCs in der Magenschleimhaut, aber nicht in SMCs (Abbildung 6b), was darauf hindeutet, dass das Enzym Ptgr1 gefunden von MMCs nach Degranulation freigesetzt werden können. Da PGE 2 spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darm Homöostase durch Schleimhautschutz und Hemmung der Säuresekretion, ist es möglich, dass bei Aktivierung MMCs negativ auf die zytoprotektive Wirkungen von PGE regulieren 2 durch schnelle Inaktivierung durch Ptgr1.
Genexpressionsmuster von extrazellulären Matrixkomponenten, Adhäsionsmoleküle und Zytoskelettproteine ​​in SMCs und MMCs
MC Phänotypen auf ihre Wechselwirkungen mit den umgebenden extrazellulären Matrices (ECMs) und den benachbarten Zellen gezeigt wurde, abhängen [1]. Eine der bemerkenswertesten Ergebnisse dieser Studie ist es, den Unterschied in der Genexpression von ECM Proteinkomponenten, Adhäsionsmoleküle und Zytoskelett-Proteine, die in den Magen (5b) funktionelle Anpassung der einzelnen Typen von MC an die mukosale oder submukosale Umgebung widerspiegeln kann . MMCs exprimieren Gene für die Schleimhaut spezifische ECM-Proteine ​​wie Muc1
(Mucin) und TFF1
(Trefoil Faktor), während SMCs Gene, die für herkömmliche ECM-Proteine ​​wie Col4a
(Prokollagen) exprimieren und Lama2
(Laminin). Darüber hinaus exprimieren SMCs Gene für Adhäsionsmoleküle wie ALCAM
und VCAM1
, und Gene, die für gewöhnliche Proteine ​​des Zytoskeletts wie ACTA2
(Aktin), während MMCs desmosome-Komponenten-Gene wie Dsc2
auszudrücken ( Desmocollin) und DSG2
(Desmoglein) und Gene für Keratin Intermediärfilamenten wie KRT8
und Krt19
. Desmosomen wurden in den Magen Epithelien sein berichtet [35], und es wurde gefunden, daß desmosome artige Strukturen in einer bestimmten Art von MC detektiert werden [36]. Es ist somit möglich, dass MMCs mit benachbarten Epithelien durch desmosomalen Adhäsion im Magen interagieren. Im Gegensatz dazu erscheinen SMCs mit benachbarten Zellen über Adhäsionsmoleküle wie VCAM-1, ALCAM und VE-Cadherin (VCAM1
, Alcam1
und CDH5
) zu interagieren. Da diese Adhäsionsmoleküle gezeigt wurde, in dynamischen Regelung des Actin-Cytoskeletts [37, 38], wie Molekül vermittelte Wechselwirkungen mit submucosalem Zellen beteiligt sein kann kritisch sein, um die funktionellen und morphologischen Eigenschaften von SMCs zu halten. Tatsächlich ist zu beachten, dass die meisten SMCs in Form variabel sind, und werden oft gedehnt und Wicklung im Vergleich zu MMCs [1].
Schlussfolgerung
Wir etablierten isoliert ein Verfahren zur RNA-Amplifikation aus gepoolten intakten MCs von gefrorenen Gewebe Abschnitte, die uns bequem zu erhalten, um den globalen Genexpressionsmuster von MCs aus verschiedenen Geweben, Organen und Arten, einschließlich des Menschen ermöglicht. Mit dieser Methode konnten wir zeigen, zum ersten Mal die unterschiedlichen Genexpressionsprofile von submuköse und Schleimhaut MCs in der Maus Magen. . Unsere Ergebnisse bieten Einblick in mögliche unbekannten Eigenschaften, die spezifisch für jede MC Unterklasse
Methoden
Material
Die folgenden Materialien aus den Quellen gewonnen wurden angegeben: HPLC T7- (dT) 24 Primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] von GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, England), RNase-freies Wasser, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E . coli
DNA-Polymerase I, E. coli DNA-Ligase
, T4 DNA-Polymerase und zufälligen Hexameren von Invitrogen (San Diego, CA), RNase-Inhibitor, Glykogen, und Megascript T7-Kit von Ambion (Austin, TX). Balb /c-Mäuse wurden von JapanClea (Hamamatsu, Japan) erhalten. Diese Studie wurde von dem Ausschuss für Tierforschung von Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences genehmigt wurde.
RNA-Amplifikation und Oligonukleotid-Mikroarray
Maus Interleukin-3-abhängige BMMCs wurden hergestellt, wie vorher [39].

• Ein Patient mit Magenkrebs mit Peritonealkarzinose mit intraperitoneale Chemotherapie behandelt, die mehr als 5 Jahre überlebt Empfang wiederholt laparoskopische Untersuchungen: ein Fallbericht
• Die Immunisierung mit dem immuno-Helicobacter suis Urease-Untereinheit B induziert einen partiellen Schutz gegen H. suis-Infektion in einem Maus-Modell