Charakterizácia profilov génovej expresie pre rôzne typy mastocytov združených z myší žalúdočné podoblastí metódou amplifikácie RNA

Charakterizácia profilov génovej expresie pre rôzne typy mastocytov združených z myší žalúdočné podoblastí metódou amplifikácie RNA
abstraktné
pozadia
mastocytov (MCS) zohrávajú kľúčovú úlohu v alergiu a prirodzenej imunity a skladá sa z heterogénnych podtried , Avšak molekulárnej základ stanovenie rozdielne charakteristiky týchto niekoľkých podtried MC zostáva nejasný.
Výsledky
tomuto prístupu sme vyvinuli metódu extrakcie RNA /zosilnenie pre intaktné in vivo
MCs zhromaždených zo zmrazených tkanivových rezoch , čo nám umožnilo získať globálny génovej expresie vzor súhrnných MCs patriace do rovnakej podtriedy. MCs boli izolované z submukóze (SMC) a slizníc (MMC) myšiach žalúdočných sekcií, respektíve 15 bunky boli zhromaždené, a ich RNA bola extrahovaná, zosilnený a podrobené analýze microarray. Známe markerovej gény špecifické pre MMC a SMC ukázali trendy predpokladá expresia, čo naznačuje, presnosť analýzy.
Identifikovali sme 1,272 génov, ktoré ukazujú, že sa úroveň expresie medzi SMC a MMC, a je zaradený ich do zhlukov na základe podobnosti ich profily expresie v porovnaní s MC drene odvodené z kostí, ktoré sú kultivované MCs sa takzvaných "nezrelé" vlastnosti. Medzi nimi sme zistili, že niekoľko kľúčových génov, ako Notch4
mal SMC-neobjektívny výraz a Ptgr1
mal MMC-neobjektívny výraz. Okrem toho, je tu rozdiel v expresii niekoľkých génov, vrátane proteínových zložiek extracelulárnej matrix, adhéznych molekúl, a cytoskeletálnych proteínov medzi oboma MC podtriedy, ktoré môžu odrážať funkčné prispôsobenie každej MC na sliznice alebo submukóznu prostredie v žalúdku.
Záver
použitím metódy amplifikácie RNA z čerpanej intaktných MCs, vyznačujúci sa tým sme rozdielnych profilov génovej expresie z SMC a MMC v myšiam žalúdku. Naše zistenia ponúkajú možnosť nahliadnuť do možných nezistených vlastností špecifických pre každý MC podtriedy.
Pozadie
mastocytov (MCS) sú odvodené z krvotvorných buniek a hrajú dôležitú úlohu pri alergických reakciách, vrodené imunity a obrane proti parazitárne infekcii. Na rozdiel od iných krvných buniek, MCs migrovať do periférnych tkanív, ako nezrelých progenitorových buniek a diferenciáciu na zrelé mastocytov. Jednou z unikátnych vlastností MC je, že vykazujú rôzne fenotypy v závislosti na rôznych tkanív mikroprostredie ich dozrievania [1]. V MC, rôzne MC-špecifické serínovej proteázy sú uložené v sekrečných granulách, a ich génové a proteínové výrazy sú výrazne zmenené, keď je ich bunkové prostredie zmení. Napríklad, Reynolds et al.
Ukázali, že najmenej šesť odlišných členov myš MC-špecifických serínových proteáz sú vyjadrené v rôznych kombináciách v rôznych populáciách mastocytov [2]. Navyše nedávne štúdie ukázali, že zrelé MCs líšia, pokiaľ ide o to, čo povrchové receptory a lipidových mediátorov vyjadrujú [3, 4]. Vzhľadom k tomu, každá populácia mastocytov in vivo
musia hrať určitú úlohu v tele, to je dôležité určiť povahu každej populácie MCs.
Komplexnú analýzu génovej expresie je účinný prístup k pochopeniu charakterizácii rôznych MC subpopulácie. K dnešnému dňu, niekoľko štúdií microarray analýzy MCs boli vykonané [5-7], ale väčšina z nich sa zaoberal MCs kultivované in vitro
. Alternatívne, profily génovej expresie MCS izolované z kože a pľúc boli analyzované [3, 8-10]. Avšak, množstvo MCS analyzovať jednej vzorky boli pomerne vysoké a boli vystavené fyzikálnych síl, enzýmy a protilátky anti-Kit pre čistenie, pri ktorom mohla byť ovplyvnená pôvodné vlastnosti MCS.
V gastrointestinálnom traktu, existujú MCs, ktoré sú klasifikované predovšetkým do dvoch podtried; slizničnej MCs (MMC) a LIEKU Submukózna MCs (SMC) na základe ich umiestnenia, morfológia (veľkosť a tvar) a obsah zrniečka [11, 12]. MMC sa nachádzajú hlavne v sliznici gastrointestinálneho traktu, s chondroitín granule sulfát s obsahom, ktoré sa zafarbia toluidínovou modrou, ale nie safraninovým, a ich aktivácia dochádza počas parazitárne infekcie [13], zatiaľ čo SMC sú lokalizované v submukóze gastrointestinálneho traktu a ich granule sú bohaté na heparínu a farbené ako toluidínová modrá a safranín [1, 11]. Avšak molekulárnej základ, rozdiely v biochemických vlastností týchto dvoch podtried MC zostáva nejasný, čiastočne v dôsledku obtiažnosti ich izolácie.
Pre prekonanie týchto problémov, tu sme vytvorili metódu amplifikácie RNA z intaktných MCs izolované zo zmrazeného rezy, ktoré nám umožňuje pohodlne získať globálny génovej expresie vzor MCs v rôznych tkanivách. Pre validáciu tohto spôsobu sme najprv určí minimálny počet buniek je potrebný na dosiahnutie reprodukovateľné RNA zosilnenie. Potom sme porovnávali profily génovej expresie získané z malého počtu MMC a SMC v myši žalúdku, a zistilo sa niekoľko kľúčových génov, ktoré majú byť špecificky exprimovaný v jednej podtriede MC, ktoré by mohlo byť niektoré aspekty výrazných vlastností medzi dvoma MC podtriedy v výsledky tráviaceho traktu. stroje a diskusia
rozvoj protokolom RNA amplifikácie na získanie profilov génovej expresie z malého množstva RNA
získať vhľad do funkčných rozdielov medzi rôznymi podtriedach MCs, sme použili tri kolesá spôsobu RNA amplifikácie T7 báze. Na základe predbežných pokusov s použitím peritoneálnej MCs a MCs kostnej drene odvodené od (BMMCs) súdime, odhaduje sa, že jediný MC získa 2 pg RNA. Predtým, než sme vykonali porovnávaciu analýzu MCs z rôznych tkanív, najprv hodnotené presnosť a reprodukovateľnosť troch kolách metódy amplifikácie RNA T7 báze, počínajúc množstvo RNA, ktoré môžu byť získané z jedného MC. Na posúdenie toho, je najprv v porovnaní výsledky microarray získané z 5 ug RNA BMMCE pripraveného podľa štandardného postupu s výsledkami získanými z rovnakého RNA zriedeného 10 5- alebo 10 6-násobné (30 pg, 10 pg a 2 pg) a podrobí sa v troch kolách amplifikácie T7 na báze (Obrázok 1a-c). Aj keď tri kolá amplifikácie sa získa dostatočné množstvo RNA pre analýzu microarray (viac než 20 ug), dokonca aj v prípade, že 2 pg RNA, analýza bodový diagram bolo zistené, že vlastnosti získaných výsledkov boli úplne odlišné medzi vzorkami z 5 ug a 2 pg RNA. Gény posudzovaný ako "prítomnosť" ako 30 pg a 5 ug RNA bolo 8,149 gény, čo zodpovedá 72% génov posudzovaný ako "prítomnosť" v 5 ug RNA (11,344 gény; Obrázok 1a), zatiaľ čo iba 4116 génov boli hodnotené ako "prítomnosť" ako 2 pg a 5 ug RNA, čo zodpovedá len 36% z génov, ktoré považujú za "prítomnosť" v 5 ug RNA (Obrázok 1C). Pokles počtu génov posudzovaný ako "prítomnosť" v zriedených vzoriek (30 pg, 10 pg a 2 pg), môže byť v dôsledku straty nízku kopírovacích druhov množstvo RNA počas amplifikácie. Obrázok 1 porovnanie troch kruhových amplifikovanej produkty počnúc od veľmi malých množstiev RNA. (A-c) amplifikácia chýb vo produktov počnúc malého množstva RNA. Rozptylové grafy intenzity signálu získa z 5 ug RNA BMMCE pripraveného štandardného protokolu az 30 pg (a
), 10 pg (b
) a 2 pg (c
) z BMMCE RNA pripravenej sú zobrazené tri kolá amplifikácie. (D, e) reprodukovateľnosť troch kole amplifikácie malého množstva RNA na. Rozptylové grafy intenzity signálu medzi dvoma nezávislými produktov od 30 pg BMMCE RNA (BMMCE 30 pg-1 a BMMCE 30 pg-2) (d
) alebo 2 pg BMMCE RNA (BMMCE 2 pg-1 a 2 BMMCE pg-2), (e
), sú uvedené. Červené bodky ukazujú sady sondy, ktoré sú považované za "prítomnosť", a žlté bodky reprezentujú sady sondy, ktoré sú považované za "Neprítomnosť" v oboch poliach. Modré bodky ukazujú sady sondy, ktoré sú považované za "prítomnosť" iba v jednom poli. Korelačné koeficienty (r) sú prezentované. Rovnaké, štvornásobný indukčné a potlačenie prahové hodnoty sú označené ako diagonálne línie. Gény posudzovaný ako "prítomnosť" sú umiestnené v skupinách, ktoré zodpovedajú párových presahov je znázornené na priložených Venn diagramy.
Ďalej sme skúmali reprodukovateľnosť výsledkov microarray získaných z dvoch sád 30 pg BMMCE RNA vzorky (30 pg-1 a 30 pg-2), alebo dve sady vzoriek 2 pg (2 pg 1 a 2 pg-2) (obrázok 1D a 1E). V 30 vzoriek RNA na pg, 7537 (30 pg-1) a 8777 (30 pg-2) gény boli hodnotené ako "prítomnosť". Avšak iba 4.324 (2 pg-1) a 4.460 (2 pg-2) gény boli hodnotené ako "prítomnosť" v každom 2 pg RNA vzorky, opäť naznačuje stratu nízkym počtu kópií RNA počas amplifikácie z malého množstva RNA. Pokiaľ ide o reprodukovateľnosti, 86% "prítomnosť" génov v 30 pg-1 a 74% "prítomnosť" génov v pg-2 vzorky 30 boli hodnotené ako "prítomnosť" v oboch vzorkách 30 pg RNA, zatiaľ čo iba 57 % z "prítomnosť" génov v 2 pg-1 a 55% "prítomnosť" génov v pg-2 vzorky 2 boli hodnotené ako "prítomnosť" v oboch vzorkách 2 pg RNA. Tieto výsledky naznačujú, že amplifikovanej produkty z RNA z jedného MC (asi 2 pg) o súčasnej metódy môžu zahŕňať značné amplifikačních artefaktov, ktoré spôsobujú problémy v presnosti a reprodukovateľnosti. Na druhej strane, vzhľadom k vyššej reprodukovateľnosti (viac ako 74%), sme dospeli k záveru, že zosilnenie od 30 pg RNA získaných z 15 MCs by bol vhodný pre praktické analýzy tkanív MCs. Na základe týchto výsledkov sme stanovili náš cieľ v tejto štúdii pre získanie profilov génovej expresie MCS zmesné z rôznych regiónov. Ak chcete minimalizovať vplyv kolísania z bunky do bunky do tej istej triedy a potenciálny amplifikačních artefaktov, máme pripravené tri sady 15 MCs pre každý región a porovnanie génov s výrazne odlišnou expresiou medzi MCs z rôznych oblastí (obrázok 2b). Vybrali sme žalúdka ako zdrojový orgánu, pretože možno izolovať dva druhy MCs zo sliznice (MMC) a submukóze (SMC) oblastí rovnakých sekcií, a MMC a SMC bolo podozrenie, že rôzne v rôznych vlastností MC, ako sú proteáza profil expresie a citlivosť na safraninovým farbenie [1, 11]. Obrázok 2 génovej expresie profily SMC a MMCS zo žalúdka tkaniva. (A) Izolácia toluidínu blue postriekané MCs v submukóze (SMC; horné panely
) a sliznice (MMC, nižšie panely
) žalúdočného sekcií. SMC (šípka
) a MMC (hrot šípu
), ktorá bola metachromatically zafarbené toluidínovou modrou pred mikrodisekcii (ľavé panely
) zmizol po mikrodisekcii s pipetou terčíka (pravé panely
). Bary
, 10 um. (B) Náčrt experimentálnej stratégie. (C) označené a fragmentované nezmyselné RNA z troch samostatných vzoriek SMC tri jednotlivé vzorky MMC a "nie" bunkových vzoriek boli hybridizovány na myšiach Array. Rozptylové pozemky pre "nie cell" (x os) a sMC1 (os y) (vľavo hore)
"Nie cell" (os X) a MMC1 (os Y) (vľavo dole),
sMC1 (x os) a sMC2 (os y) (horná centrum
), MMC1 (os x) a mMC2 (os y) (nižšia centrum
), sMC1 (os x) a MMC1 (os y) (vpravo hore
) sú zobrazené. Korelačné koeficienty (r) pre porovnanie v rámci sMC1-3, vnútri mMC1-3 a medzi SMC a MMC sú prezentované ako priemer ± smerodajná odchýlka Červené bodky ukazujú sady sondy, ktoré sú považované za "prítomnosť", a žlté bodky reprezentujú sady sondy, ktoré sú považované za "Neprítomnosť" v oboch poliach. Modré bodky ukazujú sady sondy, ktoré sú považované za "prítomnosť" iba v jednom poli. Rovnaké dvojnásobné indukcie a potlačenie prahové hodnoty sú označené ako diagonálne línie.
Profilov génovej expresie v submukóznu a slizničných MCs zo žalúdka
Pre vizualizáciu dva druhy MCs v žalúdku bez toho aby dochádzalo k degradácii RNA, boli rezy fixované fixačným Carnoy a metachromatically zafarbené toluidínovou modrou po dobu niekoľkých sekúnd. SMC a MMC boli microdissected pomocou patch pipety (Obrázok 2a a 2b). Pripravili sme tri sady 15 MCs pre každý región, extrahuje svoje RNA a individuálne zosilnený ich (SMC 1, SMC 2, SMC 3, a MMC 1, MMC 2, MMC 3). Pre zlepšenie obnovenie extrakciu za púhych 30 pg RNA, bol použitý "poly G 'ako nosič, ktorý neinterferuje s nasledujúcej amplifikácii RNA alebo hybridizácii amplifikovaného produktu do poľa (dáta nie sú uvedené). Ak chcete skúmať účinky nešpecificky zosilnených artefaktov produktov, sme vykonali postup extrakcie RNA /zosilnenie bez pridania microdissected bunky ( "žiadna bunka") ako negatívna kontrola (popísané v časti "Materiál a metódy
"). Zosilnené RNA z SMC, MMC a kontroly "nie" buniek boli oddelene hybridizovány s myšou mikročipu. Hodnoty signálu v "nie" bunky vzorky boli nízke všeobecne a podobné úrovne pozadia (obrázok 2c). Rozptyl pozemky vzoriek nezávisle pripravený v rámci rovnakej skupiny (napr. SMC 1 vs SMC 2) vykázala podobný expresný vzor; Priemerný korelačný koeficient pre všetky sondy sád bol 0,945 ± 0,004 a 0,893 ± 0,019 v SMC a MMC, resp (n
= 3). Na rozdiel od toho priemerný koeficient korelácie medzi SMC a MMC bol 0,752 ± 0,034 (n
= 3), ktorá bola oveľa nižšia, než sú v rovnakej skupine, čo naznačuje, že ich génovej expresie vzory sú odlišné.
Sme ďalej hodnotená presnosť a reprodukovateľnosť našej metódy inými súhrnnej analýzy (hierarchickej clustering analýza a analýza hlavných komponentov [PCA]) s využitím všetkých sád sond. Microarray dáta získané z SMC, MMC, kožné odvodené MC, peritoneálnej MC, BMMCs a non-MC (makrofágy a fibroblasty) boli aplikované na týchto analýz. Najprv sme skontrolovať, či je amplifikačný postup v našej metódy vplyv na globálne profil expresie v dôsledku nelineárne zosilnenie. Výsledky zo vzoriek BMMCE za použitia RNA pripravenej podľa štandardného protokolu (BMMCE-STD) alebo metódu amplifikácie (BMMCE-amp) sa podrobí týchto analýz. Oba hierarchickej analýza zhlukovaniu, a zistilo sa, že PCA microarray dáta z BMMCE-STD a BMMCE-amp boli zoskupené do rovnakej skupiny (obrázok 3a a 3b), čo naznačuje, že globálne podobnosť profilov génovej expresie je udržiavaná počas amplifikačného procesu. Ďalej sme skúmali podobnosti expresných vzorov v troch nezávislých SMC alebo MMC vzoriek. Na základe analýzy clustering a PCO, SMC 1-3 a MMC 1-3 boli zoskupené do rovnakej skupiny, resp. PCA tiež ukázal, že expresné profily SMC, MMC a BMMCs sa vzájomne líšia (3b). Obrázok 3 Globálna analýza génovej expresie SMC 1-3 a 1-3 MMC. (A) hierarchického zhlukovania globálnej génovej expresie rôznych prípravkov MCs a non-MCs. Tri-round amplifikovanej produkty sMC1-3, mMC1-3, kožné MCs a BMMCs a štandardných produktov BMMCs, boli analyzované peritoneálnej MCs, makrofágy a fibroblasty. (B) Analýza základná zložka (PCA) odhaľuje rôzne profily génovej expresie z sMC1-3, mMC1-3 a dva prípravky BMMCs. Modrý bodkovaný štvorec označuje MMCS, červená bodkovaná štvorec indikuje SMC a čierny bodkovaný štvorec označuje BMMCs.
Potom sme porovnali žalúdočné odvodené od MCs (SMC a MMCS) s kožou odvodené od MCs, peritoneálnej MCs, BMMCs a non -MCs (makrofágy a fibroblasty) podľa clustering analýzy. MCS tkaniva odvodené od žalúdka (MCs a koža MCs) boli zoskupené oddelene od peritoneálnej MCs a BMMCs. Tieto výsledky môžu odrážať rôzne vlastnosti, medzi tkaniva odvodené od MCs s pevnou priľnavosť k susedných buniek a plávajúcich MCs bez tesnom kontakte. Čo sa týka podobnosti MC s fibroblasty a makrofágy, je logické, že fibroblasty sú najvzdialenejšie od MCs a makrofágy sú bližšie k MC ako rodina leukocytov.
Validácia výsledkov microarray pomocou real time RT-PCR analýzou
sme ďalšie skúmali, či hybridizačnej signály známych markerových génov špecifických pre SMC a MMCS dokázali očakávanú expresné trendy [12, 14]. MMC špecifické gény, mastocytov proteázy 1 (Mcpt1
) a 2 (Mcpt2
) vykazovali vyššie hodnoty v MMC, zatiaľ čo SMC-špecifické markerové gény, mastocytov proteáza 4 (Mcpt4
) a chymázu 2 (CMA2
), vykazujú vyššie hodnoty signálu v SMC (tabuľka 1 a obrázok 4a) [15-29]. Na druhej strane, MC-bežné markery ako je súprava onkogénu (Kit
) a Fcε receptora (Fcer1a
) bolo preukázané významné hodnoty signálu bez predpätia medzi MMC a SMC. Pre ďalšie vyhodnotenie výsledkov sme merali hladiny expresie týchto markerových génov v reálnom čase RT-PCR za použitia RNA z nezávisle izolovaných MC (obrázok 4b). Navyše sme náhodne vybrané tri gény, ktoré ukazujú "MMC-skreslená" výraz a ďalšie tri gény, ktoré ukazujú "SMC-skreslená" pojmu; expresie týchto génov v MC nebola zistená skôr (obrázok 4a). Neboli zistené žiadne významné rozdiely v expresných hladín Kit stroje a Fcer1a
medzi MMC a SMC. Na rozdiel od toho MMC špecifické markery Mcpt1 stroje a Mcpt2 stroje a "MMC predpätie" gény, ANXA10, CTSE stroje a Fos
vykazovali vyššiu expresiu v MMC, a SMC špecifické markery Mcpt4 stroje a CMA2 stroje a "SMC-neobjektívny" gény, Cnn1, Ces3 stroje a CPE
vykazovali vyššiu expresiu v SMC. Tieto výsledky ukazujú, že výsledky microarray sú spoľahlivé a odrážajú profily génovej expresie intaktných SMC a MMC v žalúdku. Obrázok 4 Overenie odlišne exprimovaných génov medzi SMC a MMC. (A) SMC-špecifické (CMA2
, Mcpt4
), MMC špecifické (Mcpt1
, Mcpt2
) a MC-časté markery (Fcer1a stroje a Kit
) (ľavá panel
) a šesť náhodne vybraných génov (Ces3
, Cnn1
, CPE
, ANXA10
, CTSE stroje a Fos
) (pravý panel
) sú označené v reprezentatívnom bodový korelácia medzi grafmi sMC1 a MMC1. Rovnaké dvojnásobné indukčné a potlačenie prahy sú označené ako žltej, modrej a červenej čiary, resp. (B) expresné hladiny génov v (a) bola overená pomocou real-time RT-PCR. Hodnoty predstavujú pomer relatívnej úrovne expresie MMC až SMC, a sú uvedené ako priemer ± S.D. (N = 3). Špecifickosť PCR produktu bola potvrdená gélovou elektroforézou a analýzou teplotou topenia. Úroveň expresie každého génu bola normalizovaná k 28S ribozomálnej RNA.
Tabuľka 1 Prehľad génov skúmaných real-time PCR analýzy.
Gene Symbol

Gene meno
spoločností RefSeq prepis ID Logo Microton: Referencie
Kit
kit onkogén
NM_021099
15
Fcer1a

Fc fragment IgE, vysokou afinitou I, receptor pre alfa polypeptid
NM_010184
16
Mcpt1
mastocytov proteáza 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mastocytov proteáza 2
NM_008571
19
Mcpt4
mastocytov proteáza 4
NM_010779
2, 20
CMA2

chymázu 2, žírnych buniek (mastocytov proteáza 10)
NM_001024714
14 *
ANXA10
annexin A10
NM_011922
21
CTSE

katepsin E
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarkomální onkogén
NM_010234
23
Ptgr1
prostaglandínu reduktáza 1 (leukotriénov B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (prasacej)
Cnn1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
karboxylesterázou 3
NM_053200
26
CPE
karboxypeptidáza E
NM_013494
27 (hovädzie)
Notch4
Notch gén homológne 4
NM_010929
28
28s rRNA
28S ribozomálnej RNA
NR_003279
29
* kódujúce sekvencie uvedené v tomto dokumente sú založené na N-konci skrátený-forma CMA2
zatiaľ čo RefSeq " NM_001024714 "je kompletný sekvencia CMA2
.
analýza Clustering z profilov génovej expresie a funkčné kategorizácie medzi SMC a MMC
z ~ 12000 génov reprezentovaných na oligonukleotidové poli sme vybrali 1,272 génov, ktorých expresné hladiny medzi SMC 1-3 a MMC 1-3 boli významne odlišné (p Hotel < 0,05, Limmat je t
test). Hladina expresie každého génu sa normalizovala jeho hladiny v BMMCs, ktoré sú kultivované MCs s takzvanými "nezrelé" vlastnosti a vybrané gény boli rozdelené do siedmich klastrov pomocou K
-means algoritmus clustering (CL1-7 na obr 5a a ďalší súbor 1). Máme tiež klasifikované gény do funkčných kategórií a reprezentatívne gény sú uvedené (obrázok 5b). Medzi nimi, 666 génov (52,4%) ukázala, SMC-neobjektívny výrazu (CL1-3
); do 78% (519) gény SMC bohatých na gény, hladiny expresie boli relatívne nízke v BMMCs a rozšírená v SMC (CL1 a 2,
). Napríklad, úroveň expresie Mcpt4
bola v BMMCs relatívne nízke, a v prípade, že výraz profil BMMCs odráža nezrelé vlastnosti MC progenitory, Mcpt4
možno dospieť k záveru, že je indukovaná počas konečného dozrievania do SMC. Je zaujímavé, že SMC markerovej gény Mcpt5 stroje a Mcpt6
boli rozdelené do CL2 /3
, čo naznačuje, že tieto gény boli vyjadrené do istej miery "nezrelé" BMMCs, ale ich výraz bol potlačený počas zrenia do MMC. Na druhej strane, 606 génov (47,6%) bolo dosiahnuté MMC-ovplyvnil expresiu (CL4-7
); 51% (334 génov) MMC bohatých na gény, ich hladiny expresie v BMMCs boli nízke, ale boli rozšírené v MMCS (CL4 & 5
). Napríklad výraz Mcpt1
bola nízka v "nezrelé" BMMCs ale bol drasticky vyvolaná v priebehu zrenia do MMC. Obrázok 5 Clustering analýzu profilov génovej expresie medzi SMC a MMC. (A) Znázornenie hladiny expresie mRNA v sMC1-3 a mMC1-3 v porovnaní s BMMCs. Farba tyčí predstavuje pomer intenzity signálu medzi nezávislými vzorkami a BMMCs, podľa stupnice umiestnené na pravej hornej
. Gény s výrazne odlišnou expresiou medzi SMC a MMC (s Hotel &0,05, Limmat je t
test) boli vybrané (1,272 gény) a rozdelené do 7 klastrov s využitím K
-means algoritmus (CL1-7
). (B) funkčná kategorizácia reprezentatívnych génov z (a).
Proteín expresiu Notch4 v SMC a Ptgr1 v MMC v žalúdočnej tkanive
Medzi gény ukazuje diferenciálnej expresie (obrázok 5b), sme sa ďalej zameriava na expresiu Notch4
v SMC a Ptgr1
v MMC, obaja ktorý ešte nikdy predtým vyznačujúci sa tým, MC. V Notch4
génový produkt je členom rodiny Notch, skladajúci sa z transmembránových receptorov, ktoré sú aktivované na povrchu buniek ligandy na susedných buniek. Nedávne štúdie naznačujú, že Notch signalizácia sa podieľa na diferenciáciu lymfocytov a žírnych buniek [30, 31]. Najprv sme potvrdili, že Notch4
expresie je významne vyššia v osobitne združených SMC než MMC v reálnom čase RT-PCR (dáta nie sú uvedené). Ďalej sme skúmali, či je len prítomný v SMC imunobarvením žalúdočné tkaniva (obrázok 6a) Notch4 proteín. Notch4 signály boli detekované v nucleus podobnej štruktúry SMC, ale nie v tých MMC. Okrem toho, Notch4 signály boli tiež nájdené v koži MC, ktoré boli vedľa seba klastra s SMC (obrázok 3a). Tieto výsledky ukazujú, že Notch4 je prítomný v SMC, ale nie v MMC, a naznačujú, že sa podieľa na Notch4 SMC-špecifické transkripcie Notch-cieľových génov, ktoré môžu byť vyžadované pre niektoré funkcie SMC. V krvotvorných buniek, bolo popísané, že konštitutívne aktívny Notch4 podporuje expanziu progenitorových buniek a inhibuje myeloidnej diferenciáciu [32]. Vzhľadom k tomu, Notch ligandy bolo preukázané, že existujú v spojivových tkanív, ako je koža dermis [33], bude zaujímavé skúmať, či Notch4 hrá úlohu v diferenciácii SMC a udržiavanie SMC funkcií. Obrázok 6 Imunohistochemické analýza Notch4 a Ptgr1 v SMC a MMCS v žalúdku tkanive. (A) žalúdka Submucosa (SMC;
ľavej panely), žalúdočnej sliznice (MMCS, stredná panely
) a kože (kožné MCs; pravý panel
) rezy boli zafarbené s anti-Notch4 protilátky (dolná panely
) a toluidínovou modrou (horné panely
). SMC zafarbené anti-Notch4 protilátok v žalúdočných submukóze a kožné dermis sú označené šípkami. Žiadne farbenie bol pozorovaný v MMC (šípok
) lokalizované v žalúdočnej sliznici. SMC a MMCS boli zafarbené metachromatically toluidínovou modrou. (B) žalúdka Submucosa (SMC; ľavý panel
) a žalúdočnej sliznice (MMCS; pravý panel
) rezy boli zafarbené protilátkou anti-Ptgr1 (dolná panely
) a toluidínovou modrou (horná panely
). Žiadne farbenie s protilátkou anti-Ptgr1 bol nájdený v SMC (šípka
). Malé signály boli pozorované v MMC (šípky
). SMC a MMCS boli zafarbené metachromatically toluidínovou modrou. Tyče
, 25 um (a, b).
Ptgr1
produkt, 15-oxo-prostaglandín 13-reduktázy /leukotriénu (LT), B 4 12-hydroxydehydrogenase je základným enzýmom pre inaktiváciu eikosanoidov, ako je prostaglandín E 2 (PGE 2) a LTB 4 [34]. Aj keď sa uvádza, že cesty syntézy eikosanoidov sa líšia medzi rôznymi MC podtried [1, 4] Naše výsledky ukazujú, že inaktivácia systém eikosanoidov sa tiež líšia medzi podtriedami MC. Bolo zistené, Ptgr1
expresia je významne vyššia v osobitne zhromaždených MMC v reálnom čase RT-PCR (dáta nie sú uvedené). Tiež sme skúmal Ptgr1 výraz v žalúdku sekcií immunostaining. Signály pre proteín Ptgr1 boli nájdené v granule podobnej štruktúry MMC v žalúdočnej sliznici, ale nie v SMC (obrázok 6b), čo naznačuje, že Ptgr1 enzým sa môže uvoľniť z MMC na degranuláciu. Vzhľadom k tomu, PGE 2 neprehráva kľúčovú úlohu v udržiavaní črevnej homeostázy cez ochranu sliznice a inhibíciu sekrécie kyseliny, je možné, že pri aktivácii, MMC negatívne regulovať cytoprotektívny akcie PGE 2 prostredníctvom rýchleho inaktiváciu Ptgr1.
Génová expresia vzor zložiek extracelulárnej matrix, adhéznych molekúl, a cytoskeletálnych proteínov v SMC a MMC
MC fenotypy bolo preukázané, že sú závislé na ich interakcie s okolitými extracelulárnej matrice (ECM) a susedné bunky [1]. Jedným z najpozoruhodnejších záverov tejto štúdie je rozdiel v génovej expresie komponentov ECM bielkovín, adhéznych molekúl a cytoskeletálnych proteínov, čo môže odrážať funkčné prispôsobenie každého typu MC na slizničnej alebo submukóznu prostredie v žalúdku (obrázok 5b) , MMC pre expresiu génov pre sliznice špecifických proteínov ECM, ako je MUC1
(mucínu) a Tff1
(Trefoil faktor), zatiaľ čo SMC expresiu génov pre konvenčné ECM proteíny, ako je Col4a
(prokolagénu) a Lama2
(laminínu). Okrem toho, SMC exprimujú gény pre adhéznych molekúl, ako sú Alcam stroje a Vcam1 stroje a gény pre bežné cytoskeletálnych proteínov, ako Acta2
(aktínu), zatiaľ čo MMC expresné desmozom-komponentné génov, ako sú Dsc2
( desmocollin) a Dsg2
(desmogleinu), a gény pre keratínových medziľahlých vlákien, ako Krt8 stroje a Krt19
. Desmosomes boli hlásené byť prítomné v epitelu žalúdka [35], a zistilo sa, že desmozom podobné štruktúry sú detekované v určitom type MC [36]. Je teda možné, že MMC pre interakciu s priľahlým epitelu cez desmosomální adhéziu v žalúdku. Na rozdiel od toho sa zdá, SMC komunikovať so susednými bunkami prostredníctvom adhezívnych molekúl, ako je VCAM-1, ALCAM a VE-cadherinu (Vcam1
Alcam1 stroje a Cdh5
). Vzhľadom k tomu, adhézny molekuly bolo preukázané, že sa podieľajú na dynamickom regulácie aktinového cytoskeletu [37, 38], tieto molekuly sprostredkované interakcie s submukóznymi buniek môže byť kritický pre udržanie funkčné a morfologické vlastnosti SMC. V skutočnosti, je potrebné poznamenať, že väčšina SMC sú premenné vo forme, a sú často pretiahla a vinutie v porovnaní s MMC [1].
Záver
sme vytvorili metódu amplifikácie RNA z čerpanej intaktných MCs izolovaných zo mrazené tkaniva profily, čo nám umožňuje pohodlne získať globálny génovej expresie vzor MCs z rôznych tkanív, orgánov a druhov, vrátane ľudí. Pri použití tejto metódy, sme ukázali prvýkrát rozdielnych profilov génovej expresie z LIEKU Submukózna a slizničnej MCs u myší žalúdka. . Naše zistenia ponúkajú možnosť nahliadnuť do možných nezistených vlastností špecifických pre každý MC podtriedy
metódy
materiály
boli tieto materiály získané z uvádzaných zdrojov: HPLC čistí T7- (dT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] od GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Anglicko), RNase-voľná voda, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E . coli
DNA Polymerase aj E. coli
DNA LIGÁZA T4 DNA polymerázy a náhodných hexamérov od Invitrogen (San Diego, CA), inhibítora RNázy, glykogénu, a MEGAscript T7 kit od firmy Ambion (Austin, TX). Balb /c myši boli získané od JapanClea (Hamamatsu, Japonsko). Táto štúdia bola schválená výborom pre výskum zvierat Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences. Zosilňovacia
RNA a oligonukleotidové microarray
myš interleukín-3-závislé BMMCs boli pripravené ako bolo opísané skôr [39]. Celková RNA z BMMCs bola extrahovaná RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).

• Pacient s rakovinou žalúdka s peritoneálnej karcinosou liečených intraperitoneálne chemoterapiu, ktorá prežila viac ako 5 rokov dostáva opakované laparoskopickej vyšetrenia: prípad report
• Imunizácia s imunodominantní Helicobacter ureázy suis podjednotky B indukuje čiastočnú ochranu proti H. suis infekcii u myší model