Apibūdinimas genų ekspresijos profilius skirtingų tipų putliųjų ląstelių jungtinius nuo pelių skrandžio subregionų kurį RNR amplifikacijos metodą

Apibūdinimas genų ekspresijos profilius skirtingų tipų putliųjų ląstelių jungtinius nuo pelių skrandžio subregionų kurį RNR amplifikacijos metodą
tezės
Background pervežimas putliųjų ląstelių (MG) vaidina pagrindinį vaidmenį alergijos ir įgimto imuniteto ir susideda iš Innogatunkowy poklasius , Tačiau molekulinės pagrindas nustatyti skirtingas charakteristikas šių kelių MC poklasius lieka neaiškus.
Rezultatai
požiūris, mes sukūrėme RNR gavybos /amplifikacija už sveika in vivo pervežimas MC Suminė iš šaldytų audinių skyriuose metodą , kuris leido mums gauti pasaulinę genų ekspresijos šabloną sukauptų MC priklausančių tai pačiai poklasio. MG buvo izoliuota nuo submucosa (sMCs) ir gleivinės (MMC) pelių skrandžio skyriai, atitinkamai, 15 ląstelės buvo kartu, ir jų RNR buvo išskirta, išplėstos ir taikomos mikrogardelių analizės. specifiniai MMC ir sMCs Žinomos paženklintų genų parodė tikimasi raiškos tendencijas, nurodant tikslumo analizė.
Mes nustatė 1,272 genus, rodančius gerokai skiriasi raiškos lygį tarp sMCs ir MMC, ir klasifikuojami juos į grupes pagal panašumą jų raiškos profilių pagrindu palyginti su kaulų čiulpų gautas MG kurie yra išauginti MG su vadinamųjų "nesubrendusių" savybių. Tarp jų, mes nustatėme, kad keli pagrindiniai genai tokie kaip Notch4
turėjo SMC-tendencingas išraišką ir Ptgr1
turėjo MMC-šališkas išraiška. Be to, yra skirtumas kelių genų, įskaitant tarpląsteliniame baltymų komponentų, adhezijos molekulių ir Citoskeletas baltymų tarp dviejų MC poklasiai, kurie gali atspindėti funkcinį pritaikymą kiekvienam MC į gleivinės ar gleivine aplinkos skrandyje išraiška.
Išvada
naudodamiesi RNR amplifikacijos metodą nuo susikaupusių nepaliestas MC, mes apibūdino skirtingų genų ekspresijos profilius sMCs ir MMC to, kad pelės skrandį. Mūsų išvados siūlome pažvelgti į konkrečias kiekvienos MC poklasio galimų nenustatytų savybių.
Faktai
putliųjų ląstelių (MG) yra kilęs iš kraujodaros kamieninių ląstelių ir vaidina svarbų vaidmenį alerginių reakcijų, įgimtą imunitetą ir apsisaugoti nuo parazitinių infekcijų. Skirtingai nuo kitų kraujo kūnelių, MG migruoti į periferinius audinius kaip nesubrendusios protėvių ir diferencijuoti į brandų putliųjų ląstelių. Vienas iš unikalių savybių MC yra tai, kad jie rodo, kad iš fenotipų Priklausomai nuo skirtingo audinių mikroaplinkos jų brendimo [1] įvairovė. Į MC, įvairių MC-specifiniai serino proteazės yra saugomi į sekrecijos granulių, ir jų genų ir baltymų išraiškos žymiai nepakinta, kai jų ląstelių aplinka yra pakeista. Pavyzdžiui, Reynolds et al.
Parodė, kad ne mažiau kaip šešis tam tikrus narius, pelių MC-konkrečių serino proteazių, yra išreiškiami skirtingu derinių skirtingose ​​putliųjų ląstelių populiacijų [2]. Be to, naujausi tyrimai parodė, kad brandžios MG skirtis pagal tai, ką paviršiaus receptoriais ir lipidų tarpininkų jie išreiškia [3, 4]. Kadangi kiekvienas putliųjų ląstelių populiacijos in vivo
turi atlikti ypatingą vaidmenį organizme, svarbu nustatyti kiekvieno MC gyventojų charakterį.
Išsami genų ekspresijos analizė yra galingas metodas suprasti įvairių MC apibūdinimą pogrupius. Iki šiol buvo atlikta keletas tyrimų apie mikrogardeliq analizės MC [5-7], tačiau dauguma iš jų sprendžiami MC auginamos in vitro
. Arba, genų ekspresijos profilius MC izoliuotos nuo odos ir plaučių buvo analizuojami [3, 8-10]. Tačiau MC numeriai analizuojami kaip vienas mėginys buvo santykinai didelė, ir jie buvo veikiami fizinių jėgų, fermentų ir anti-Kit antikūnais gryninimui, per kurį galėjo būti paveikti originalios savybės MC.
Virškinimo takų, yra MG, kad yra daugiausia klasifikuojami į dvi poklasius; gleivinės MG (MMC), ir gleivine MG (sMCs) dėl jų buvimo vietą, morfologija (dydžio ir formos) ir granulių Turinys [11, 12] pagrindu. MMC yra daugiausia rasti virškinimo trakto sutrikimas, gleivinės, turintys granulių chondroitino sulfatas, kurių sudėtyje yra, kurie yra dažytų su toluidine mėlyna, bet ne Safraninas, ir jų aktyvavimas įvyksta parazitinių infekcijų [13] metu, o sMCs yra lokalizuotas virškinamojo submucosa takų ir jų granulės yra daug heparino ir tamsintas su tiek toluidinas mėlyna ir Safraninas [1, 11]. Tačiau molekulinės pagrindas nustatyti biocheminių savybių šių dviejų MC poklasių skirtumai lieka neaišku, iš dalies dėl to, kad jų izoliacijos sunkumų.
Įveikti šias problemas, mes čia įsteigė RNR amplifikacijos nuo nepaliestas MC metodą izoliuota nuo sušaldyti audinio sekcijos, kuri leidžia mums patogiai gauti pasaulinę genų ekspresijos modelis MC įvairiuose audiniuose. Norėdami patvirtinti šį metodą, pirmiausia nustatoma, reikalingą pasiekti atkuriamas RNR stiprinimas minimalus ląstelių skaičių. tada mes nei genų ekspresijos profilius, gautų iš mažų skaičių MMC ir sMCs pelių skrandžio ir rasti keli pagrindiniai genai turi būti specialiai išreikštas vienu poklasis MC, kuris gali atspindėti kai kuriuos skirtingų savybių tarp dviejų MC poklasiai į aspektus virškinimo trakte.
rezultatai ir jų aptarimas
plėtros RNR amplifikacijos protokolo gauti genų ekspresijos profilius nuo nedideliu kiekiu RNR
įgyti pažvelgti į funkcinių skirtumų tarp skirtingų poklasių MC, mes dirbo trys raundai T7 pagrindu RNR amplifikacijos metodą. Remiantis preliminariais eksperimentus su pilvaplėvės MCS ir kaulų čiulpų gautas MG (BMMCs), mes Apskaičiuota, kad vienas MC duoda 2 psl RNR. Prieš mes atlikti lyginamąją analizę MC iš skirtingų audinių, mes pirmą kartą įvertino tikslumą ir atkuriamumas tris etapus T7-pagrįstas RNR amplifikacijos metodu, pradedant nuo RNR suma, kuri gali būti gauta iš vieno MC. Įvertinti tai, pirmiausia, lyginant gautas mikrogardeliq rezultatai nuo 5 mikrogramų BMMC RNR parengtą standartinis protokolas su gauta iš to paties RNR praskiesto 10 5 arba 10 6 kartus (30 pg, 10 psl ir 2 pg) ir veikiamas trijų etapų T7 remiantis amplifikacijos (pav 1a-c). Nors trys raundai amplifikacijos davė pakankamai kiekį RNR už mikrogardeliq analizė (> 20 mikrogramų) net 2 psl RNR atveju sklaida sklypas analizė atskleidė, kad gautų rezultatų savybės buvo gana skiriasi mėginių iš 5 mikrogramų ir 2 pg RNR. Į įvertinamas kaip "buvimas" tiek 30 psl ir genai 5 mikrogramų RNR buvo 8,149 genai, kurie atitiko 72% genų įvertinta kaip "buvimas" per 5 mikrogramų RNR (11,344 genai; 1a paveikslas), o tik 4116 genų buvo vertinami kaip "buvimas" tiek 2 psl ir 5 mikrogramų RNR, kuri atitiko tik 36% genų įvertinta kaip "buvimas" per 5 mikrogramų RNR (1c pav.) Į genų įvertinta kaip "buvimas" praskiestose mėginių (30 psl, 10 psl, ir 2 PG) skaičiaus sumažėjimas gali būti dėl to, kad mažai kopijų skaičius RNR rūšių praradimo amplifikacijos metu. 1 pav palyginti trijų apvalių papildyta produktus, pradedant labai mažais kiekiais RNR. (A-c) amplifikacijos ša produktų, pradedant nuo nedidelį kiekį RNR. Taškinė sklypai signalo intensyvumo gauta iš 5 mikrogramų BMMC RNR parengtą standartinis protokolas, o nuo 30 psl (A pervežimas), 10 psl (B pervežimas) ir 2 pg (C pervežimas) iš BMMC RNR parengtą rodomi trys raundai stiprinimas. (D, E) reproduktyvumu trijų-apvalios amplifikacijos pridedant nedidelį kiekį RNR. Taškinė sklypai signalo intensyvumas tarp dviejų nepriklausomų produktų iš 30 pg iš BMMC RNR (BMMC 30 pg-1 ir BMMC 30 pg-2) (d
) arba nuo 2 pg iš BMMC RNR (BMMC 2 pg-1 ir BMMC 2 pg-2) (e
), yra parodyta. Raudonais taškais rodo, probe rinkiniai vertinami kaip "buvimas", ir geltonais taškais atstovauti probe rinkiniai vertinami kaip "nebuvimas" abiejų masyvų. Blue taškai rodo probe rinkiniai vertinami kaip "buvimas" tik abiejų masyvo. Koreliacijos koeficientai (r) yra pateikiami. Tie patys, keturgubas indukcijos ir slopinimo slenksčiai yra nurodyti kaip įstrižomis linijomis. Genai vertinti kaip "buvimas" yra dedamas į grupes, atitinkančias poromis užlaidos parodyta lydimųjų Veno diagrama.
Mes šalia išnagrinėjo mikrogardeliq gautų rezultatų iš dviejų rinkinių 30 pg BMMC RNR mėginių atkuriamumas (30 psl-1 ir 30 pg-2) arba dvi 2 pg mėginių (2 pg-1 ir 2 pg-2) (1d pav ir 1e). Per 30 pg RNR mėginių, 7537 (30 pg-1) ir 8777 (30 pg-2) genai buvo vertinami kaip "buvimas". Tačiau, tik 4324 (2 pg-1) ir 4460 (2 pg-2) genų, buvo vertinami kaip "buvimas" kiekvienoje 2 pg RNR mėginio, kas dar kartą mažai kopijos numerį, RNR nuostolių amplifikacijos metu nuo nedideliu kiekiu RNR. Kaip pasikartojimu, 86% "esamos" genus iš 30 pg-1 ir 74% "buvimas" genus iš 30 pg-2 pavyzdžio buvo vertinami kaip "buvimas" abiejose 30 pg RNR mėginių, o tik 57 % nuo "buvimas" genus į 2 pg-1 ir 55% "buvimas" genų 2 pg-2 pavyzdžio buvo vertinami kaip "buvimas" abiejose 2 psl RNR pavyzdžius. Šie rezultatai rodo, kad amlifikuoti produktai iš RNR iš vieno MC (apie 2 PG) pagal dabartinį metodą gali būti daug amplifikacijos artefaktus sukelia problemų tikslumą ir atkuriamumas. Kita vertus, dėl didesnio pasikartojimu (> 74%), mes išvada, kad amplifikacija iš 30 pg RNR, surinktų iš 15 MC būtų tinkami praktinio analizės audinių MC. Remiantis šiais rezultatais, mes nustatome mūsų tikslas šiame tyrime įsigyti genų ekspresijos profilius MC bendrus iš įvairių regionų. Siekiant sumažinti ląstelių-to-ląstelių pokyčiams įtaką tos pačios klasės ir galimas amplifikacijos dalykų, mes parengė tris rinkinius 15 MC kiekvienam regionui ir, palyginti genų su gerokai skirtingos išraiškos tarp MC iš įvairių regionų (2b pav). Mes pasirinkome skrandį, kaip šaltinio organo, nes mes galime išskirti dviejų rūšių MC iš gleivinės (MMC) ir submucosa (SMC) regionuose tos pačios skyriuose ir MMC ir sMCs buvo įtariama, kad skiriasi keliais MC savybes, tokias kaip proteazės išraiška aprašymą ir jautrumas Safraninas dažymą [1, 11]. 2 pav genų ekspresijos profilius sMCs ir MMC iš skrandžio audinio. (A) išskyrimas toluidinas mėlynai nudažytus MC į submucosa (SMC; viršutinės plokštės
) ir gleivinė (MMC; mažesnės plokštės
) skrandžio skyriuose. SMC (rodyklė
) ir MMC (Arrowhead
), kuris buvo metachromatically tamsintas su toluidino mėlyna prieš microdissection (kairėje plokštės
) dingo po microdissection su patch pipete (dešinysis plokštės
). Barai
, 10 mkm. (B) apibrėžiami eksperimentinės strategijos. (C) ženklinami ir fragmentiški antiprasmq RNR iš trijų atskirų SMC mėginių, trijuose atskiruose MMC mėginių ir "ne ląstelių" mėginiuose buvo kryžminosi į pelių masyvo. Taškinė sklypai "ne langelyje" (X ašis) ir sMC1 (y ašis) (viršutinis kairysis pervežimas): "Ne ląstelės" (x ašis) ir mMC1 (Y ašis) (apatiniame kairiajame pervežimas), sMC1 (X ašis) ir sMC2 (Y ašis) (viršutinis centras
), mMC1 (x ašis) ir mMC2 (Y ašis) (mažesnės centras
), sMC1 (x ašis) ir mMC1 (Y ašis) (viršutiniame dešiniajame
) yra parodyta. Koreliacijos koeficientai (r), lyginant per sMC1-3 per mMC1-3 ir tarp sMCs ir MMC pateikiami kaip reiškia ± Š.D. Raudonais taškais rodo, probe rinkiniai vertinami kaip "buvimas", ir geltonais taškais atstovauti probe rinkiniai vertinami kaip "nebuvimas" abiejų masyvų. Blue taškai rodo probe rinkiniai vertinami kaip "buvimas" tik abiejų masyvo. Tie patys, dvejopas indukcijos ir slopinimo slenksčiai yra nurodyti kaip įstrižomis linijomis.
Genų ekspresijos profilius gleivine ir gleivinės MC iš skrandžio
vizualizuoti dviejų rūšių MC į skrandį nesukeliant RNR degradacija, sekcijos buvo nustatyta su Carnoy fiksatoriumi ir metachromatically tamsintas su toluidino mėlyna kelias sekundes. sMCs ir MMC buvo microdissected naudojant pleistrą pipete (2a pav ir 2b). Mes parengė tris rinkinius 15 MC kiekvienam regionui, išgautas savo RNR ir individualiai sustiprina juos (SMC 1, SMC 2, SMC 3 ir MMC 1, MMC 2, MMC 3). Norėdami pagerinti ir taip mažai, kaip 30 psl RNR gavybos atkūrimo, mes naudojome "poli G", kaip vežėjo, kuris nesikiša su šiais RNR sustiprinimu arba hibridizacijos dauginamą prekę į masyvą (duomenys neparodyti). Išnagrinėti nonspecifically stiprintuvu artefaktas produktų poveikį, mes atliko RNR gavyba /amplifikacijos procedūrą nepridedant microdissected ląstelių ( "ne ląstelę") kaip neigiamos kontrolės (aprašyta "Medžiagos ir metodai UAB"). Amlifikuoti RNR iš sMCs, MMC ir "ne ląstelių" kontrolės buvo atskirai kryžminosi į pelių microarray. Signaliniai vertybės "nėra ląstelių" mėginyje buvo mažas apskritai ir panašūs į foninius lygius (2c pav.) Sklaida sklypai mėginių nepriklausomai parengta tos pačios grupės (pvz smc 1 vs SMC 2) parodė panašią išraišką modelį; vidutinis koreliacijos koeficientas visiems zondas rinkinių buvo 0,945 ± 0,004 ir 0,893 ± 0,019 iš sMCs ir MMC, atitinkamai (N
= 3). Priešingai, vidutinis koreliacijos koeficientas tarp sMCs ir MMC buvo 0,752 ± 0,034 (n
= 3), kuris buvo gerokai mažesnis nei tos pačios grupės, o tai rodo, kad jų genų ekspresijos modeliai yra skirtingi.
Mes taip pat įvertintas tikslumas ir atkuriamumas mūsų metodo kitų išsamių analizių (hierarchinė grupavimas analizė ir pagrindinis komponentas analizė [PBS]), naudojant visas probe rinkinius. Mikrogardeliq duomenys, gauti iš sMCs, MMC, odos gautas MG pilvaplėvės MG BMMCs ir ne MC (makrofagų ir fibroblastų) buvo taikomi šių analizių. Mes pirmą kartą patikrinti, ar amplifikacijos procesas mūsų metodas įtakoja pasaulio ekspresijos profilio, nes netiesinės amplifikacijos. Rezultatai iš BMMC mėginių, naudojant RNR parengtą standartinis protokolas (BMMC-STD) arba amplifikacijos metodą (BMMC-amp) buvo atliktas šių analizių. Tiek hierarchinė grupavimas analizė ir PBS atskleidė, kad mikrogardeliq duomenys BMMC-STD ir BMMC buvo susitelkę tos pačios grupės (3a pav ir 3b), o tai rodo, kad pasaulio panašumas genų ekspresijos profilius palaikoma amplifikacijos metu. Mes šalia išnagrinėjo išraiškos būdus panašumą trijų nepriklausomų SMC arba MMC pavyzdžius. Po grupavimo analizės ir PBS, SMC 1-3 ir MMC 1-3 buvo susitelkę į tą pačią grupę, atitinkamai. PBS taip pat parodė, kad sąvoka profiliai sMCs, MMC ir BMMCs yra tarpusavyje skiriasi (3b pav.) 3 pav Pasaulinis genų ekspresijos analizė SMC 1-3 ir MMC 1-3. (A) Hierarchinis grupuojama pasaulio genų ekspresijos įvairių preparatų MC ir ne MC. Trys ištisus amlifikuoti produktai sMC1-3, mMC1-3, odos MC ir BMMCs ir standartinių produktų BMMCs, buvo analizuojami pilvaplėvės MG makrofagų ir fibroblastai. (B) pagrindinė sudedamoji analizė (PBS) atskleidžia skirtingus genų ekspresijos profilius sMC1-3, mMC1-3 ir du preparatai BMMCs. Mėlyna punktyrinė kvadratinių rodo MMC, raudonas punktyras kvadratinių rodo sMCs, o juoda punktyrinė kvadratinių rodo BMMCs.
Mes tada palyginti skrandžio gautas MG (sMCs ir MMC) su odos gautas MG pilvaplėvės MG BMMCs ir ne -MCs (makrofagai ir fibroblastai) pagal grupavimo analizę. Audinių gautas MG (skrandžio MCS ir odos MG) buvo sugrupuotos atskirai nuo pilvaplėvės MC ir BMMCs. Šie rezultatai gali atspindėti skirtingas savybes tarp audinių gautas MC su tvirtu sukibimu į kaimynines ląsteles ir plūdriųjų MC be griežtų kontakto. Kalbant apie MC panašumo su fibroblastų ir makrofagų, tai
yra pagrįsta, kad fibroblastai yra labiausiai nutolusi nuo MC ir makrofagai yra arčiau MC kaip leukocitų šeima. Įteisinimas microarray rezultatų realaus laiko AT-PGR analizės
Už Mes kitas ištirti, ar hibridizacijos signalai specifinį sMCs ir MMC žinomų žymeklis genų rodė sulėtėjusią raiškos tendencijas [12, 14]. MMC konkrečiai genai, putliųjų ląstelių proteazės 1 (Mcpt1
) ir (Mcpt2
) 2 parodė didesnes vertes ir MMC, o SMC-specifiniai paženklintų genų, putliųjų ląstelių proteazės 4 (Mcpt4
) ir chimazės 2 (CMA2
), parodė aukštesnius signalo reikšmes sMCs (1 lentelė ir paveikslas 4a) [15-29]. Kita vertus, MC-common žymekliai, pvz rinkinys onkogeno (Kit pervežimas) ir Fcε receptorių (Fcer1a pervežimas) parodė reikšmingą signalo vertės be šališkumo tarp MMC ir sMCs. Išsamiau įvertinti rezultatus, mes išmatavo raiškos lygį šių žymeklių genų realaus laiko AT-PGR, naudojant RNR iš izoliuotų nepriklausomai MC (4b pav.) Be to, mes atsitiktinai atrinko tris genus, rodančius "MMC šališkas" išraiška ir dar tris genus, rodančius "SMC-šališkas" raišką; išraiška šių genų MC nebuvo pranešta anksčiau (4a pav.) Nebuvo jokių reikšmingų skirtumų tarp ekspresijos lygio Kit
ir Fcer1a
tarp MMC ir sMCs. Priešingai, MMC konkrečių žymekliai Mcpt1 parsisiųsti ir Mcpt2
ir "MMC šališkas" genai, Anxa10, Ctse
ir FOS
parodė didesnę raišką MMC ir SMC-specifinius žymenis Mcpt4 parsisiųsti ir CMA2
ir "SMC šališkas" genai, cnn1, Ces3
ir CPE
parodė didesnę raišką sMCs. Šie rezultatai rodo, kad mikrogardeliq rezultatai yra patikimi ir atspindi genų ekspresijos profilius nepaliestas sMCs ir MMC skrandžio. 4 pav Patvirtinus skirtingai išreikštas genų tarp sMCs ir MMC. (A) SMC-specifiniai (CMA2
, Mcpt4
), MMC konkretaus (Mcpt1
, Mcpt2
) ir MC-common žymekliai (Fcer1a
ir Kit
) (kairė panelė
) ir šešių atsitiktinai atrinkti genai (Ces3
, cnn1
, CPE
, Anxa10
, nurodyti Ctse parsisiųsti ir Fos
) (dešinėje skydelio
) atitinkamu sklaida koreliacijos grafikai tarp sMC1 ir mMC1. Tie patys, dvejopas indukcijos ir slopinimo slenksčiai yra nurodyti kaip geltona, mėlyna ir raudona linijos, atitinkamai. (B) ekspresijos lygis IN (a) buvo patikrinti realaus laiko RT-PGR genų. Reikšmės atstovauti santykinių ekspresijos lygio MMC iki sMCs santykį, ir yra parodyta kaip vidurkis ± Š.D. (N = 3). PGR produkto specifiškumas buvo patvirtinta gelio elektroforezės ir analizės lydymosi temperatūra. Sąvoka lygis kiekvieno geno buvo standartizuoti 28S ribosomų RNR.
1 lentelė genų nagrinėtų realaus laiko PGR analizei.
Genų Akcija

Gene Pavadinimas
RefSeq stenograma ID
pagalbos
komplektas
komplektas onkogeno
NM_021099
15
Fcer1a

Fc fragmentas IgE, didelio afiniteto I, receptorius alfa polipeptido
NM_010184
16
Mcpt1
putliųjų ląstelių proteazės 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
putliųjų ląstelių proteazės 2
NM_008571
19
Mcpt4
putliųjų ląstelių proteazės 4
NM_010779
2, 20
CMA2

chimazės 2, putliųjų ląstelių (putliųjų ląstelių proteazės 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
aneksinas A10
NM_011922
21
Ctse

katepsino El
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarkoma onkogeno
NM_010234
23
Ptgr1
Prostaglandinas reduktazės 1 (leukotrienų B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (kiaulių)
cnn1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
karboksilesterazei 3
NM_053200
26
CPE
Karboksipeptidazė El
NM_013494
27 (galvijų)
Notch4
Notch genas homologas 4
NM_010929
28
28S rRNR
28S ribosomų RNR
NR_003279
29
* kodavimo seka pateikti šiame dokumente yra N-galas sutrumpintas-forma CMA2
, o RefSeq " NM_001024714 "yra pilnas seka CMA2
.
Klasteriai analizė genų ekspresijos profilius ir funkcionalus kategorijas tarp sMCs ir MMC
iš ~ 12.000 genų atstovaujamų oligonukleidų masyvas, mes išrinkome 1,272 genus, kurių išraiška lygius tarp SMC 1-3 ir MMC 1-3 buvo gerokai skiriasi (p
< 0,05, Limma anketa T
testas). Sąvoka lygis kiekvieno geno normalizavosi jo lygio BMMCs, kurie yra išauginti MG su vadinamųjų "nesubrendusių" savybių, o atrinkti genai buvo suskirstyti į septynias grupes naudojant K
-means grupavimo algoritmą (CL1-7; 5a pav ir papildomų failų 1). Mes taip pat klasifikuojami genus į funkcines kategorijas, o atstovas genai yra išvardyti (5b pav.) Tarp jų 666 genai (52,4%) parodė, SMC-tendencingas išraišką (CL1-3
); 78% (519 genų) ir SMC-turtingas genų, ekspresijos lygis buvo gana žemas BMMCs ir gausinami SMC (CL1 & 2
). Pavyzdžiui, pasakymas lygis Mcpt4
buvo santykinai mažas BMMCs, o jei išraiška profilis BMMCs atspindi nesubrendusios savybes MC protėvių, Mcpt4
galima daryti išvadą, kad būti sukeltas galutinio subrendimo į sMCs metu. Įdomu tai, kad SMC paženklintų genų Mcpt5 parsisiųsti ir Mcpt6
buvo suskirstyti į Cl2 /3
, rodo, kad šie genai buvo išreikšta tam tikru "nesubrendusios" BMMCs kiek, tačiau jų išraiška buvo nuslopintas brendimo į MMC metu. Kita vertus, 606 genai (47,6%) parodė, MMC-šališkas išraišką (CL4-7
); 51% (334 genų) MMC turtingas genų, jų išraiškos lygiai BMMCs buvo nedidelis, bet buvo gausinami MMC (CL4 & 5
). Pavyzdžiui, išraiška Mcpt1
buvo mažai "nesubrendusios" BMMCs bet buvo drastiškai sukeltas brendimo į MMC metu. 5 pav Klasteriai analizė genų ekspresijos profilius tarp sMCs ir MMC. (A) atstovavimas iRNR ekspresijos lygio sMC1-3 ir mMC1-3 palyginti su BMMCs. Iš barų spalva reiškia signalo intensyvumas tarp nepriklausomų pavyzdžių ir BMMCs santykį, atsižvelgiant į masto rodomas viršutiniame dešiniajame
. Genai labai skiriasi, išraiškos tarp sMCs ir MMC (p
< 0,05, Limma anketa T
testas) buvo atrinkti (1,272 genai) ir suskirstytos į 7 grupes, naudojant k
-means algoritmą (CL1-7
). (B) Funkcinė klasifikacija reprezentacinių genų (A).
Baltymų raiškos Notch4 į sMCs ir Ptgr1 į MMC skrandžio audinio
Tarp genų rodomi diferencialinę išraišką (pav 5b), mes dar labiau orientuota į saviraiškos Notch4
sMCs ir Ptgr1
MMC, kurie abu niekada anksčiau, besiskiriantis tuo, MC. Į Notch4
geno produktas yra iš Notch šeimos narys, sudarytas iš transmembraninio receptorių, kurie yra aktyvuojamos ląstelės paviršiaus ligandų gretimų ląstelių. Naujausi tyrimai parodė, kad tarpeklio signalizacijos dalyvauja limfocitų ir putliųjų ląstelių diferenciacijos [30, 31]. Mes pirmą kartą patvirtino, kad Notch4
išraiška yra gerokai didesnė atskirai jungtinius sMCs nei MMC realaus laiko RT-PCR (duomenys neparodyti). Mes šalia ištirti, ar Notch4 baltymas yra tik dalyvauja sMCs iki imunodažymu skrandžio audinyje (6a pav.) Notch4 signalai buvo aptikta branduolio-kaip struktūrų sMCs, bet ne tiems, iš MMC. Be to, Notch4 signalai taip pat buvo rasta odos MG kurios buvo gretimai sugrupuotos su sMCs (3a pav.) Šie rezultatai rodo, kad Notch4 būna sMCs bet ne MMC, ir rodo, kad Notch4 dalyvauja SMC-konkretų transkripcijos Notch netikslinių genų, kurie gali būti reikalingos kai kurioms SMC funkcijas. Be kraujodaros ląstelių, buvo pranešta, kad constitutively aktyvus Notch4 skatina kamieninių ląstelių plėtrą ir slopina mieloidinės diferenciaciją [32]. Nuo Notch ligandų buvo įrodyta, kad egzistuoja jungiamųjų audinių, pavyzdžiui, odos dermos [33], tai bus įdomu ištirti, ar Notch4 vaidina vaidmenį sMCs diferenciacijos ir SMC funkcijoms palaikyti. 6 pav Imunohistocheminis analizė Notch4 ir Ptgr1 į sMCs ir MMC skrandžio audinio. (A) Skrandžio submucosa (sMCs; kairė plokštės
), skrandžio gleivinė (MMC; vidurinės plokštės
) ir odos (odos MG; dešinysis plokštės
) skyriai buvo tamsintas su anti-Notch4 antikūnas (mažesnės plokštės
) ir toluidino mėlyna (viršutinės plokštės
). sMCs tamsintas su anti-Notch4 antikūnų skrandžio submucosa ir odos dermos nurodyti rodyklėmis. Nėra dažymo buvo pastebėtas MMC (strėlių antgalių
) lokalizuota į skrandžio gleivinę. sMCs ir MMC buvo metachromatically tamsintas su toluidino mėlyna. (B) Skrandžio submucosa (sMCs; kairė plokštės
) ir skrandžio gleivinės (MMC; dešinysis plokštės
) skyriai buvo tamsintas su anti-Ptgr1 antikūnų (mažesnės plokštės
) ir toluidino mėlyna (viršutinių plokščių
). Nėra dažymo su anti-Ptgr1 antikūnų buvo rastas sMCs (rodyklė
). Maži signalai buvo stebimi iš MMC (antgaliai strėlės
). sMCs ir MMC buvo metachromatically tamsintas su toluidino mėlyna. Barai
, storis yra 25 mm (a, b).
Geriau Ptgr1
produktas, 15-okso-prostaglandino 13-reduktazės /leukotrienų (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase yra esminis fermentas inaktyvacijos iš eikozanoidai pavyzdžiui, prostaglandino E 2 (PGE 2) ir LTB 4 [34]. Nors buvo pranešta, kad eicosanoid sintezės keliai skiriasi tarp skirtingų MC poklasius [1, 4], mūsų rezultatai rodo, kad nukenksminimo sistema eikozanoidai taip pat skiriasi tarp MC poklasius. Ptgr1
išraiška buvo nustatyta, kad gerokai didesnė atskirai jungtinius MMC realaus laiko RT-PCR (duomenys neparodyti). Mes taip pat išnagrinėjo Ptgr1 išraišką skrandžio sekcijų imunodažymu. Signalai apie Ptgr1 baltymų buvo nustatyta granulių pavidalo struktūrose MMC skrandyje gleivinės bet ne sMCs (6b pav), o tai rodo, kad Ptgr1 fermentas gali būti paleistas iš MMC ant degranuliacijos. Nuo PGE 2 plays kritinių vaidmenis žarnų homeostazės priežiūra per gleivinės apsaugai ir rūgšties sekrecijos slopinimo, tai yra įmanoma, kad kai įjungta, MMC neigiamai reguliuoti apsaugančių veiksmus PGE 2 iki greito slopinamasis Ptgr1.
Genų ekspresiją modelis tarpląsteliniame komponentų, adhezijos molekulių ir Citoskeletas baltymų sMCs ir MMC
MC fenotipų buvo įrodyta, kad priklauso nuo jų sąveiką su aplinkiniais ekstraląsteliniuose matricų (ESM) ir kaimyninių ląstelių [1]. Vienas iš ryškiausių išvadas šioje studijoje yra genų ekspresijos ECM baltymų komponentų, adhezijos molekulių ir Citoskeletas baltymų skirtumą, kuris gali atspindėti funkcinį pritaikymą kiekvienam MC tipo prie gleivinės ar gleivine aplinkos skrandyje (pav 5b) , MMC išreikšti genų gleivinėje konkrečių ECM baltymų, pavyzdžiui, MUC1
(mucino) ir Tff1
(trilapis faktorius), o sMCs išreikšti genus paprastajam ECM baltymų, pavyzdžiui, Col4a
(procollagen) ir Lama2
(lamininas). Be to, sMCs išreikšti genų adhezijos molekulių, tokių kaip Alcam
ir Vcam1
ir genus paprastiems Citoskeletas baltymų, pavyzdžiui, Acta2
(aktino), o MMC išreikšti desmosome komponentų genus, pavyzdžiui, Dsc2
( desmocollin) ir Dsg2
(desmoglein) ir genai keratino tarpinių gijų, kaip antai Krt8 parsisiųsti ir Krt19
. Desmosomes buvo pranešta, kad dalyvauja skrandžio epitelyje [35], ir buvo nustatyta, kad desmosome panašūs statiniai yra aptinkamas tam tikros rūšies MC [36]. Todėl įmanoma, kad MMC bendrauti su gretimų epitelyje per desmosomal sukibimo skrandyje. Priešingai, sMCs rodomas bendrauti su kaimyninėmis ląstelėmis per adhezijos molekulių, tokių kaip VCAM-1 Alcam ir VE-cad (Vcam1
, Alcam1 parsisiųsti ir Cdh5
). Nuo Įrodyta šie adhezijos molekulių dalyvauti dinaminėje reguliavimo aktino citoskeleto [37, 38], pavyzdžiui, molekulių tarpininkaujant sąveika su gleivine ląstelių gali būti labai svarbu išsaugoti funkcinius ir morfologinius savybes sMCs. Iš tiesų, reikėtų pažymėti, kad dauguma sMCs yra kintamos formos, ir dažnai ištempti ir likvidavimo, palyginti su MMC [1].
Išvada
įkūrėme RNR amplifikacijos metodą nuo susikaupusių nepaliestas MC, išskirtų iš šaldytų audinio skyriai, kuris suteikia mums galimybę patogiai gauti pasaulinę genų ekspresijos modelis MC iš įvairių audinių, organų, ir rūšių, įskaitant žmones. Naudojant šį metodą, mes parodė pirmą kartą į skirtingas genų ekspresijos profilius gleivine ir gleivinės MG pelių pilvo. . Mūsų išvados siūlome pažvelgti į konkrečias kiekvienos MC poklasio galimų nenustatytų savybių
metodai
medžiagos
Šios medžiagos buvo gauti iš šaltinių, nurodė: HPLC išgrynintas T7- (dt) 24 gruntas [5 " -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC VS (t) 24] GE Healthcare UK Ltd (Buckinghamshire, England), RNazės be vandens, dNTP, SusperScript II Escherichia coli
(E.coli
) RNazės H El . Aš coli
DNR polimerazė, E. coli
DNR ligazės, T4 DNR polimerazė ir heksamerų iš Invitrogen (San Diego, CA), RNaze inhibitorius, glikogeno ir MEGAscript T7 komplektas nuo Ambion (Austin, TX). BALB /c pelių buvo gauti iš JapanClea (Hamamatsu, Japonija). Šis tyrimas patvirtino Gyvūnų tyrimų Kioto universiteto Graduate School of Pharmaceutical Sciences komitetas.
RNR stiprinimas ir oligonukleidų mikrogardeliq
Pelės interleukino-3 priklausomi BMMCs buvo paruoštas kaip aprašyta anksčiau [39]. Iš viso RNR BMMCs buvo išgauti naudojant RNeasy mini rinkinys (Qiagen, Valensija, Kalifornija).

• Pacientas su skrandžio vėžiu, peritoninės karcinomatoze gydomi pilvo ertmę chemoterapijos, kuris išgyveno daugiau nei 5 metus gauti pakartotinius laparoskopinį egzaminus: byla report
• Imunizacijos su imunodominantiniai Helicobacter suis ureazės B subvieneto sukelia dalinį apsaugą nuo H. suis pelių modelis