Karakterisering van genexpressieprofielen voor verschillende typen mestcellen samengebracht uit maag muis deelgebieden door een RNA-amplificatie method

karakterisatie van genexpressieprofielen voor verschillende typen mestcellen samengebracht uit maag muis deelgebieden met een RNA amplificatiewerkwijze
De abstracte Achtergrond
Mast cellen (MCs) spelen een centrale rol in allergie en aangeboren immuniteit en bestaan ​​uit heterogene subklassen. Echter, de moleculaire basis bepalen van de verschillende kenmerken van deze meervoudige MC subklassen blijft onduidelijk.
Resultaten
deze aanpak, ontwikkelden we een methode van RNA-extractie /versterking voor in vivo intact
MCs samengevoegd uit bevroren weefselcoupes , waardoor we de globale genexpressie patroon van gepoolde MCs van dezelfde subklasse verkrijgen. MCs werden geïsoleerd uit de submucosa (SMC) en slijmvliezen (MMC) maag muis groepen daarvan werden 15 cellen samengevoegd, en de RNA werd geëxtraheerd, geamplificeerd en onderworpen aan microarray analyse. Bekende merkergenen specifiek voor MMC en SMC's vertoonden verwachte tendensen expressie, wat aangeeft nauwkeurigheid van de analyse.
We identificeerden 1272 genen geeft significant verschillende expressie niveaus tussen SMC en MMC en geclassificeerd ze in clusters op basis van vergelijkbaarheid van hun expressieprofielen in vergelijking met beenmerg afgeleide MCs, waarbij de gekweekte MCs met zogenaamde 'onvolwassen' eigenschappen zijn. Onder hen, vonden we dat een aantal belangrijke genen zoals Notch4
had SMC-vooringenomen expressie en Ptgr1
had MMC-biased expressie. Verder is er een verschil in de expressie van verscheidene genen waaronder extracellulaire matrix eiwitcomponenten, adhesiemoleculen en cytoskeletproteïnen tussen de twee MC subklassen die functionele aanpassing van elk MC om de mucosale en submucosale milieu in de maag kunnen weerspiegelen.
Conclusie
via de werkwijze volgens RNA amplificatie uit samengevoegde intacte cassettes, karakteriseerden we de verschillende genexpressieprofielen van SMC en MMC in de maag van de muis. Onze bevindingen bieden inzicht in de mogelijke niet-geïdentificeerde eigenschappen specifiek voor elk MC subklasse. Achtergrond
Mast cellen (MCS) zijn afgeleid van hematopoietische stamcellen en spelen een belangrijke rol bij allergische reacties, aangeboren immuniteit en verdediging tegen parasitaire infectie. In tegenstelling tot andere bloedcellen, MCs migreren naar perifere weefsels als onvolwassen voorlopers en differentiëren tot rijpe mestcellen. Eén van de unieke kenmerken van MCS dat ze tonen verschillende fenotypen afhankelijk van de verschillende weefsels micro hun rijping [1]. In MCs worden verschillende MC-specifieke serineproteasen opgeslagen in de secretoire granules en hun genen en eiwitexpressies drastisch gewijzigd wanneer hun mobiele omgeving is veranderd. Bijvoorbeeld Reynolds et al.
Hebben aangetoond dat ten minste zes verschillende leden van muizen MC-specifieke serineproteasen zijn uitgedrukt in verschillende combinaties in verschillende celpopulaties mast [2]. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat volwassen MC variëren in termen van wat oppervlak receptoren en lipide mediatoren ze uiten [3, 4]. Omdat elke mast celpopulatie in vivo moet
een specifieke rol in het lichaam spelen, is het belangrijk om de aard van elke populatie van MCs bepalen.
Uitgebreide genexpressieanalyse is een krachtige aanpak voor de karakterisering van verschillende MC begrijpen subpopulaties. Tot op heden hebben diverse studies microarray analyse van MC uitgevoerd [5-7], maar de meeste behandelde MC gekweekt in vitro
. Als alternatief hebben genexpressie profielen van MC's geïsoleerd van de huid en longen geanalyseerd [3, 8-10]. De aantallen MC geanalyseerd als een monster relatief hoog waren en ze werden blootgesteld aan fysieke krachten, enzymen en anti-kit antilichaam voor zuivering, waarbij de oorspronkelijke eigenschappen van de MC kan zijn aangetast.
In het maag darmkanaal, er MCs die hoofdzakelijk geclassificeerd in twee subklassen; mucosale MCs (MMC) en submucosale MCs (SMC) op basis van de locatie, morfologie (grootte en vorm) en granule inhoud [11, 12]. MMCS komen vooral in het slijmvlies van het maagdarmstelsel, met chondroitin sulfaat bevattende granules, die worden gekleurd met toluidine blauw, maar niet safranineoplossing en hun activering optreedt tijdens parasitaire infectie [13], terwijl SMC gelokaliseerd in de submucosa van de maag luchtwegen en hun granules zijn rijk aan heparine en gekleurd met zowel toluïdineblauw en safranine [1, 11]. De moleculaire basis waarin de verschillen in biochemische eigenschappen van deze beide subklassen MC onzeker, mede door de moeilijkheid van de isolatie. Belgique Om deze problemen te overwinnen, hier hebben we een werkwijze voor RNA-amplificatie uit intacte MCs geïsoleerd uit bevroren weefselcoupes, die ons in staat stelt om gemakkelijk te verkrijgen van de wereldwijde genexpressie patroon van de MC's in verschillende weefsels. Om deze methode te valideren, we eerst bepaald het minimum aantal cellen nodig om reproduceerbare RNA-amplificatie te bereiken. We vergeleken de genexpressieprofielen verkregen van een klein aantal MMC en SMCs in de maag van de muis, en vond een aantal belangrijke genen specifiek tot expressie worden gebracht in een subklasse van cassettes, die enkele aspecten van de verschillende eigenschappen tussen de twee MC subklassen kunnen weerspiegelen het maagdarmkanaal.
Resultaten en discussie
Ontwikkeling van een RNA-amplificatie protocol om genexpressieprofielen te verkrijgen van een kleine hoeveelheid RNA Belgique om inzicht te krijgen in de functionele verschillen tussen de verschillende subklassen van MC's, hebben we gebruik gemaakt van drie rondes van de T7-gebaseerde RNA amplificatiewerkwijze. Op basis van de voorlopige experimenten met peritoneale MCs en beenmerg afgeleide MCs (BMMCs) schatten we dat één MC levert 2 ug RNA. Voordat we vergelijkende analyse van MCS uit verschillende weefsels, we eerst geëvalueerd de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van drie rondes van de T7-gebaseerde RNA-amplificatie, die begint met de hoeveelheid RNA die kunnen worden verkregen uit één MC. Om dit te kunnen beoordelen, moeten we eerst vergeleken de microarray resultaten van 5 ug BMMC RNA bereid door de standaard protocol met die verkregen uit dezelfde RNA verdund 10 5- of 10 6-voudig (30 pg, 10 pg en 2 pg) en onderworpen aan drie ronden van T7-gebaseerde amplificatie (figuur 1a-c). Hoewel drie ronden van amplificatie leverde voldoende hoeveelheid RNA voor microarray analyse (> 20 ug), zelfs bij 2 pg RNA, scatterplot analyse bleek dat de eigenschappen van de verkregen resultaten sterk verschilt tussen de monsters van 5 ug en 2 pg RNA. De genen beoordeeld als "Presence zowel 30 pg en 5 ug RNA werden 8149 genen, die overeenkwam met 72% van genen beoordeeld als 'aanwezigheid' in de 5 ug RNA (11.344 genen Figuur 1a), terwijl slechts 4116 genen werden als "Presence zowel 2 pg en 5 ug RNA, hetgeen overeenkomt met slechts 36% van genen beoordeeld als 'aanwezigheid' in de 5 ug RNA (figuur 1c). De afname van het aantal genen beoordeeld als 'aanwezigheid' in de verdunde monsters (30 pg, 10 pg en 2 pg) kan worden veroorzaakt door het verlies van een klein aantal kopieën RNA species gedurende amplificatie. Figuur 1 Vergelijking van drie ronde-geamplificeerde producten ab zeer kleine hoeveelheden RNA. (A-c) Amplificatie systematische fouten in de produkten uitgaande van een kleine hoeveelheid RNA. Scatter plots van de intensiteit van het signaal verkregen uit 5 ug BMMC RNA opgesteld door de standaard protocol en van 30 pg (a
), 10 pg (b
) en 2 pg (c
) van BMMC RNA bereid door drie ronden van amplificatie worden weergegeven. (D, e) Reproduceerbaarheid van de drie-round amplificatie van een kleine hoeveelheid RNA. Scatter plots van de intensiteit van het signaal tussen twee onafhankelijke producten van 30 pg van BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 en BMMC 30 pg-2) (d
) of 2 pg van BMMC RNA (BMMC 2 pg-1 en BMMC 2 pg-2) (e
) getoond. Rode stippen probesets beoordeeld als "Aanwezigheid" en gele stippen stellen probesets beoordeeld als "Afwezigheid" in beide arrays. Blauwe stippen probesets beoordeeld als "Aanwezigheid" alleen in beide array. De correlatiecoëfficiënten (r) worden gepresenteerd. Dezelfde vier-voudige inductie en onderdrukking drempels aangeduid als diagonale lijnen. Genen beoordeeld als "Aanwezigheid" zijn in die overeenkomen met paarsgewijze overlapt getoond in de bijgevoegde diagrammen Venn geplaatst.
Wij vervolgens onderzocht de reproduceerbaarheid van de microarray resultaten van twee sets van 30 pg BMMC RNA-monsters (30 pg-1 en 30 pg-2) of twee van 2 pg monsters (2 pg-1 en 2 pg-2) (figuur 1d en 1e). In de 30 pg RNA-monsters, 7537 (30 pg-1) en 8777 (30 pg-2) genen werden als "Presence. Slechts 4324 (2 pg-1) en 4460 (2 pg-2) genen werden als "Presence Iedere 2 pg RNA monster opnieuw suggereert het verlies van een klein aantal kopieën RNA gedurende amplificatie van een kleine hoeveelheid RNA. Wat de reproduceerbaarheid, 86% van de 'aanwezigheid' genen in de 30 pg-1 en 74% van de 'aanwezigheid' genen in de 30 pg-2 monster werden beoordeeld als "Presence zowel 30 pg RNA-monsters, terwijl slechts 57 % van 'Presence genen in de 2 pg-1 en 55% van de' aanwezigheid 'genen in de 2 pg-2 monster werden beoordeeld als "Presence zowel 2 pg RNA monsters. Deze resultaten suggereerden dat de geamplificeerde producten van het RNA uit één MC (ongeveer 2 pg) van de huidige werkwijze kan aanzienlijke versterking artefacten veroorzaakt problemen in nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Anderzijds vanwege de hogere reproduceerbaarheid (> 74%), concludeerden wij dat de amplificatie van 30 pg RNA vanuit 15 MCs geschikt voor de praktische analyse van weefsel MC zou zijn. Gebaseerd op deze resultaten, zetten we ons doel in deze studie om genexpressie profielen van MCs samengevoegd uit verschillende regio's te verwerven. Om de invloed van cel-cel variaties binnen dezelfde klasse en mogelijke versterking artefacten te minimaliseren, bereidden wij drie reeksen 15 MC voor elk gebied vergeleken genen met significant verschillende expressie tussen MC van de verschillende regio's (Figuur 2b). We kozen maag als bron orgaan, omdat we twee soorten MC kan isoleren van de mucosa (MMC) en de submucosa (SMC) gebieden van dezelfde secties en MMC en SMC's werden verdacht verschillend in verschillende MC eigenschappen zodanig zijn protease expressieprofiel en overgevoeligheid voor safranine kleuring [1, 11]. Figuur 2 Genexpressie profielen van SMCS en MMC van de maag weefsel. (A) Isolatie van toluidine blauw-lood MCs in de submucosa (SMC; bovenste panelen in) en de slijmvliezen (MMC; onderste panelen in) van de maag secties. Een SMC (pijl
) en MMC (pijlpunt
) dat metachromatically werd gekleurd met toluidine blauw voor microdissectie (links panelen in) verdween na microdissectie met een patch pipet (rechts panelen in). Bars
, 10 urn. (B) een overzicht van de experimentele strategie. (C) gemerkt en gefragmenteerde antisense-RNA's van de drie individuele SMC monsters, drie individuele mmc monsters en de 'no cell' monsters werden gehybridiseerd met een Murine Array. Scatter plots voor 'geen mobiele' (x-as) en SMC1 (y-as) (linksboven
), 'geen mobiele' (x-as) en MMC1 (y-as) (linksonder
), SMC1 (x as) en sMC2 (y-as) (midden boven
), MMC1 (x-as) en MMC2 (y-as) (midden onder
), SMC1 (x-as) en MMC1 (y-as) (rechtsboven
) getoond. De correlatiecoëfficiënten (r) ter vergelijking in sMC1-3 binnen mMC1-3 en tussen SMCs en MMC's worden weergegeven als het gemiddelde ± S.D. Rode stippen probesets beoordeeld als "Aanwezigheid" en gele stippen stellen probesets beoordeeld als "Afwezigheid" in beide arrays. Blauwe stippen probesets beoordeeld als "Aanwezigheid" alleen in beide array. Dezelfde twee-voudige inductie en onderdrukking drempels aangeduid als diagonale lijnen.
Genexpressieprofielen van submucosale en mucosale MCs van de maag Belgique Om twee soorten MC in de maag te visualiseren zonder dat RNA degradatie, de objectglaasjes werden gefixeerd met fixatief Carnoy en metachromatically gekleurd met toluidine blauw voor een paar seconden. SMC en MMC werden gemicrodissecteerde met een patch pipet (figuur 2a en 2b). We bereidden drie sets van 15 MC's voor elke regio, geëxtraheerd hun RNA en individueel versterkt hen (SMC 1, SMC 2, SMC 3, en MMC 1, MMC 2, MMC 3). Het herstellen van de winning van slechts 30 ug RNA te verbeteren, gebruikten we "poly G 'als een drager, die niet interfereert met de volgende RNA amplificatie of hybridisatie van het geamplificeerde product aan de array (gegevens niet getoond). Om de effecten van niet-specifiek artefact geamplificeerde producten onderzoeken, voerden we de RNA-extractie /amplificatie werkwijze zonder toevoeging gemicrodisseceerde cellen ( "geen cel") als een negatieve controle (in "Materialen en werkwijzen
" beschreven). De versterkte RNA's van SMC's, MMC en het "geen cel" controle werden afzonderlijk gehybridiseerd aan een muizen microarray. Het signaal waarden in de "geen cel" sample laag waren in het algemeen en vergelijkbaar met de achtergrond niveaus (figuur 2c). De scatter plots van de monsters onafhankelijk opgesteld binnen dezelfde groep (bijvoorbeeld SMC 1 vs SMC 2) vertoonde een soortgelijke uitdrukking patroon; de gemiddelde correlatiecoëfficiënt voor alle probe-sets was 0,945 ± 0,004 en 0,893 ± 0,019 in SMCS en MMC's, respectievelijk (n
= 3). In tegenstelling, de gemiddelde correlatiecoëfficiënt tussen SMC en MMC was 0,752 ± 0,034 (n = 3
), die veel lager zijn dan die van dezelfde groep, suggereert dat de genexpressiepatronen verschillen.
We verder geëvalueerd de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van onze methode door andere uitgebreide analyses (hiërarchische clustering analyse en principal component analysis [PCA]) met behulp van alle probe sets. Microarray data verkregen uit SMC's, MMC, huid-afgeleide MCs, peritoneale MCs, BMMCs en non-MCs (macrofagen en fibroblasten) werden toegepast op deze analyses. We hebben eerst onderzocht of het amplificatieproces in onze werkwijze op het globale expressieprofiel als gevolg van niet-lineaire versterking. De resultaten van de monsters met behulp BMMC RNA bereid volgens het standaardprotocol (BMMC-std) of de methode amplificatie (BMMC-amp) onderworpen aan deze analyses. Beide hiërarchische clustering analyse en PCA bleek dat microarray data van BMMC-std en BMMC-amp werden gegroepeerd in dezelfde groep (figuur 3a en 3b), wat suggereert dat de globale overeenkomst in genexpressieprofielen tijdens het amplificatieproces wordt gehandhaafd. We vervolgens onderzocht de gelijkenis van meningsuiting patronen in drie onafhankelijke SMC of MMC-samples. Bij clustering analyse en PCA, SMC 1-3 en MMC 1-3 werden gegroepeerd in dezelfde groep, respectievelijk. PCA toonde ook aan dat de expressie profielen van SMC's, MMC en BMMCs zijn onderling verschillend (figuur 3b). Figuur 3 Global genexpressie analyse van SMC 1-3 en MMC 1-3. (A) Hiërarchische clustering van de wereldwijde genexpressie van verschillende bereidingen van MC's en non-MCs. Drie-round geamplificeerde producten van sMC1-3, mMC1-3, huid MCs en BMMCs, en de standaard producten van BMMCs, peritoneale MCs, macrofagen en fibroblasten werden geanalyseerd. (B) De belangrijkste componenten analyse (PCA) onthult verschillende genexpressie profielen van sMC1-3, mMC1-3, en twee bereidingen van BMMCs. De blauwe gestippelde vierkant MMCS, de rode gestippelde vierkantje geeft SMCS, en de zwarte gestippelde vierkantje geeft BMMCs.
Vervolgens vergeleken de-maag afgeleide MCs (SMCS en MMC) met de huid afgeleide MCs, peritoneale MCs, BMMCs en niet- -MCs (macrofagen en fibroblasten) door clustering analyse. Het weefsel afgeleide MCs (maag MCs en de huid MCs) werden afzonderlijk geclusterd van peritoneale MCs en BMMCs. Deze resultaten kunnen verschillende eigenschappen tussen weefsel afgeleide MCs met stevige hechting aan de naburige cellen en drijvende MCs weerspiegelen zonder een strakke contact. Met betrekking tot de gelijkenis van de MC's met fibroblasten en macrofagen, is het redelijk dat de fibroblasten zijn het verst van MC's en macrofagen dichter bij MCs als leukocyten familie.
Validatie van de microarray resultaten door de real-time RT-PCR-analyse
we onderzocht of de hybridisatiesignalen van bekende marker genen die specifiek zijn voor SMCS en MMCS toonde de verwachte trends [12, 14] uitdrukking. De MMC-specifieke genen, mestcel protease 1 (Mcpt1
) en 2 (Mcpt2
) toonde hogere waarden in MMC, terwijl de SMC-specifieke marker genen, mestcel protease 4 (Mcpt4
) en chymase 2 (CMA2
), vertoonden hogere signaalwaarden in SMCS (tabel 1 en figuur 4a) [15-29]. Aan de andere kant, MC-common markers zoals kit oncogen (Kit
) en Fcε receptor (Fcer1a
) toonde significante signaalwaarden zonder vooroordelen tussen MMC en SMC. Om de resultaten verder te evalueren, maten we de expressieniveaus van deze merkergenen door real-time RT-PCR met RNA van de onafhankelijk geïsoleerde MCs (figuur 4b). Bovendien hebben we willekeurig geselecteerde drie genen laten zien 'MMC-vooringenomen' expressie en nog eens drie genen tonen 'SMC-vooringenomen' meningsuiting; expressie van deze genen in MC is niet eerder gerapporteerd (figuur 4a). Er waren geen significante verschillen in de expressie van Kit Kopen en Fcer1a
tussen MMC en SMC. In tegenstelling, de MMC-specifieke markers Mcpt1 Kopen en Mcpt2
en de "-MMC bevooroordeeld 'genen, Anxa10, CTSE
en Fos
vertoonden hogere expressie in MMC en de SMC-specifieke merkers Mcpt4 Kopen en CMA2
en de 'SMC-biased' genen, CNN1, Ces3
en Cpe
toonde hogere expressie in SMCS. Deze resultaten geven aan dat de microarray resultaten betrouwbaar en geven de genexpressieprofielen van intacte SMC en MMC in de maag. Figuur 4 Validatie van de differentieel tot expressie van genen tussen SMC en MMCS. (A) SMC-specifiek (CMA2
, Mcpt4
), MMC-specifieke (Mcpt1
, Mcpt2
) en MC-common markers (Fcer1a Kopen en Kit
) (links paneel
) en zes willekeurig geselecteerde genen (Ces3
, CNN1
, Cpe
, Anxa10
, CTSE Kopen en Fos
) (rechter paneel
) zijn aangegeven in de representatieve scatter correlatie grafieken tussen SMC1 en MMC1. Dezelfde twee-voudige inductie en onderdrukking drempels aangeduid als een gele, rode en blauwe lijn, respectievelijk. (B) De expressieniveaus van de genen van (a) werden geverifieerd door real-time RT-PCR. De waarden vertegenwoordigen de verhouding van de relatieve expressieniveaus van MMC om SMC en zijn weergegeven als gemiddelde ± S.D. (N = 3). De specificiteit van het PCR-product werd bevestigd door middel van gelelektroforese en analyse van de smelttemperatuur. De expressie van elk gen werd genormaliseerd tot 28S ribosomaal RNA.
Tabel 1 Samenvatting van genen onderzocht door real-time PCR-analyse.
Gene Symbol

Gene Name
RefSeq Afschrift ID
Reference
kit
kit oncogen
NM_021099
15
Fcer1a

Fc fragment van IgE, hoge affiniteit I, receptor voor α polypeptide
NM_010184
16
Mcpt1
mestcel protease 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mestcel protease 2
NM_008571
19
Mcpt4
mestcel protease 4
NM_010779 verhuur 2, 20
CMA2

chymase 2, mestcel (mestcel protease 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
annexine A10
NM_011922
21
CTSE

cathepsine E
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarcoom oncogen
NM_010234
23
Ptgr1
prostaglandine reductase 1 (leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (varkens)
CNN1
calponine 1
NM_009922
25 | Ces3
carboxylesterases 3
NM_053200
26
Cpe
carboxypeptidase E
NM_013494
27 (bovine)
Notch4
Notch-gen homoloog 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S ribosomaal RNA
NR_003279
29
*, de coderende sequentie die in dit document is de N-terminus afgeknotte-vorm van CMA2
, terwijl de RefSeq " NM_001024714 "is de volledige sequentie van CMA2
.
Clustering analyse van de genexpressie profielen en functionele indeling tussen SMC's en MMCS Website van ~ 12.000 genen vertegenwoordigd in de oligonucleotide array, selecteerden we 1272 genen waarvan de expressie niveaus tussen SMC 1-3 en MMC 1-3 waren significant verschillend (p
< 0,05, Limma t
test). De expressie van elk gen werd genormaliseerd door het niveau in BMMCs, die gekweekt MCs met zogenaamde 'onvolwassen' eigenschappen zijn, en de geselecteerde genen werden ingedeeld in zeven clusters met behulp van de k
-means clustering algoritme (CL1-7 Figuur 5a en Aanvullende bestandsinformatie 1). We ingedeeld ook de genen in functionele categorieën, en de vertegenwoordiger van de genen worden vermeld (Figuur 5b). Onder hen, 666 genen (52,4%) vertoonden SMC-bevooroordeeld expressie (CL1-3
); in 78% (519 genen) van SMC-rijke genen, de expressie niveaus waren relatief laag BMMCs en augmented in SMC (CL1 & 2
). Bijvoorbeeld, de expressie van Mcpt4
was relatief laag in BMMCs, en als de expressie profiel van BMMCs weerspiegelt de onrijpe eigenschappen van MC voorouders, kan Mcpt4
worden gesloten om te worden opgewekt tijdens de laatste rijping tot SMC's. Interessant is dat de SMC merkergenen Mcpt5 Kopen en Mcpt6
werden ingedeeld in CL2 /3
, wat suggereert dat deze genen werden uitgedrukt tot op zekere hoogte in 'onvolwassen' BMMCs, maar hun expressie werd onderdrukt tijdens de rijping in MMCS. Anderzijds, 606 genen (47,6%) vertoonden MMC voorgespannen expressie (CL4-7
); in 51% (334 genen) van MMC-rijke genen hun expressie niveaus in BMMCs waren laag, maar werden uitgebreid in MMC (CL4 & 5
). Bijvoorbeeld, de expressie van Mcpt1
laag was in 'onvolwassen' BMMCs maar werd drastisch geïnduceerd tijdens de rijping in MMCS. Figuur 5 clustering analyse van de genexpressieprofielen tussen SMC en MMCS. (A) vertegenwoordiging van mRNA expressie van sMC1-3 en mMC1-3 vergelijking met BMMCs. De kleur van de staven geeft de verhouding van de intensiteit van het signaal tussen onafhankelijke steekproeven en BMMCs, volgens de op de rechterbovenhoek
schaal. Genen met significant verschillende expressie tussen SMC en MMC (p Restaurant < 0,05, Limma t
test) werden geselecteerd (1272 genen) en ingedeeld in 7 clusters met behulp van de k
-means algoritme (CL1-7
). (B) functionele indeling van representatieve genen van (a).
Eiwitexpressie van Notch4 in SMCS en Ptgr1 in MMC in maagweefsel
Onder de genen waaruit differentiële expressie (figuur 5b), we verder gericht op de expressie van Notch4
in SMCS en Ptgr1
in MMC, die beide nog nooit eerder zijn gekenmerkt MCs. De Notch4
genproduct een lid van de familie Notch, bestaande uit transmembraan receptoren die worden geactiveerd door celoppervlak liganden op aangrenzende cellen. Recente studies hebben gesuggereerd dat Notch signalering is betrokken bij mast lymfocyten en celdifferentiatie [30, 31]. We hebben eerst bevestigd dat Notch4
expressie significant hoger in de afzonderlijk samengevoegd SMC dan MMCs door real-time RT-PCR (gegevens niet getoond). Vervolgens onderzochten we of de Notch4 eiwit is alleen aanwezig in SMCS door immunokleuring van de maag weefsel (figuur 6a). Notch4 signalen werden gedetecteerd in de kern structuren van SMC, maar niet bij die van MMCS. Bovendien werden Notch4 signalen ook in de huid MC, die naast elkaar geclusterd met SMC (figuur 3a). Deze resultaten tonen dat Notch4 aanwezig SMCS maar niet in MMC is, en suggereren dat Notch4 deelneemt aan SMC-specifieke transcriptie van Notch-doelgenen, die voor sommige SMC functies vereist. In hematopoëtische cellen is gerapporteerd dat constitutief actieve Notch4 stimuleert de expansie van progenitorcellen en remt myeloïde differentiatie [32]. Aangezien Notch ligands is aangetoond dat er in bindweefsels zoals huid dermis [33], is het interessant om te onderzoeken of Notch4 speelt een rol bij de differentiatie van SMC en de handhaving SMC functies. Figuur 6 Immunohistochemische analyse van Notch4 en Ptgr1 in SMCS en MMC in de maag weefsel. (A) Maag submucosa (SMC; links panelen in), maagslijmvlies (MMC; midden panelen in) en de huid (huid MCs, rechts panelen in) werden gekleurd met een anti-Notch4 antilichaam (onderste panelen
) en met toluidine blauw (bovenste panelen in). SMC gekleurd met het anti-Notch4 antilichaam in de maag submucosa en de huid dermis zijn aangegeven met pijlen. Geen kleuring werd waargenomen in MMC (pijlpunten
) gelokaliseerd in het maagslijmvlies. SMCS en MMC werden metachromatically gekleurd met toluidine blauw. (B) Maag submucosa (SMC; links panelen in) en maagslijmvlies (MMC, rechts panelen in) werden gekleurd met een anti-Ptgr1 antilichaam (onderste panelen in) en met toluidine blauw (bovenste panelen
). Geen kleuring met anti-Ptgr1 antilichaam werd gevonden in de SMC (pijl
). Kleine signalen werden waargenomen in de MMC (pijlpunten
). SMCS en MMC werden metachromatically gekleurd met toluidine blauw. Bars
, 25 urn (a, b). Ondernemingen De Ptgr1
product, 15-oxo-13-prostaglandine reductase /leukotrieen (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase is een enzym te inactiveren van eicosanoïden zoals prostaglandine E 2 (PGE 2) en LTB 4 [34]. Hoewel is beschreven dat de paden van eicosanoid synthese verschillen tussen de verschillende MC subklassen [1, 4] Onze resultaten suggereren dat de inactivatie stelsel van eicosanoïden varieert tussen de MC subklassen. Ptgr1
expressie was significant hoger in de afzonderlijk samengevoegd MMCs worden door real-time RT-PCR (gegevens niet getoond). We onderzochten ook Ptgr1 expressie in de maag secties door immunokleuring. Signalen voor de Ptgr1 eiwit werden gevonden in korrel-achtige structuren van MMC in het maagslijmvlies, maar niet in SMCS (figuur 6b), wat suggereert dat de Ptgr1 enzym kan worden vrijgesteld van MMC op degranulatie. Aangezien PGE 2 speelt cruciale rol in de handhaving van darm homeostase door middel van mucosale bescherming en remming van maagzuursecretie, is het mogelijk dat wanneer geactiveerd, MMCS negatief reguleren van de cytoprotectieve optreden van PGE 2 door snelle inactivering door Ptgr1.
Genexpressie patroon van extracellulaire matrixcomponenten, adhesiemoleculen en cytoskeleteiwitten in gladde spiercellen en MMC
MC fenotypen aangetoond is afhankelijk van hun interactie met de omringende extracellulaire matrix (ECM) en naburige cellen [1]. Een van de meest opmerkelijke bevindingen van deze studie is het verschil in genexpressie van ECM-eiwitcomponenten, adhesiemoleculen en cytoskeleteiwitten die functionele aanpassing van elk type MC om de mucosale en submucosale milieu in de maag kunnen weerspiegelen (figuur 5b) . MMCS uiten genen voor slijmvlies-specifieke ECM eiwitten zoals Muc1
(Mucine) en TFF1
(Trefoil factor), terwijl de SMC's te uiten genen voor conventionele ECM eiwitten zoals Col4a
(procollageen) en LAMA2
(laminine). Bovendien SMCS uiten genen voor adhesie moleculen zoals Alcam
en VCAM1
, en genen voor de gewone cytoskelet eiwitten zoals Acta2
(actine), terwijl MMC uiten desmosome-component genen zoals Dsc2
( desmocollin) en Dsg2
(desmogleïne), en genen voor keratine intermediaire filamenten zoals Krt8 Kopen en Krt19
. Desmosomen werden gerapporteerd in de maag epitheel [35] zijn, en het bleek dat desmosome structuren worden gedetecteerd in een bepaald type MC [36]. Het is dus mogelijk dat MMC interageren met aangrenzende epithelia tot desmosomale hechting in de maag. In tegenstelling, SMC's lijken te communiceren met naburige cellen via adhesie moleculen zoals VCAM-1, Alcam en VE-cadherine (VCAM1
, Alcam1 Kopen en Cdh5
). Aangezien deze adhesiemoleculen is aangetoond dat ze betrokken zijn bij dynamische regeling van het actine cytoskelet [37, 38], kunnen dergelijke moleculen gemedieerde interacties met submucosale cellen kritisch voor de functionele en morfologische eigenschappen van SMC handhaven. Inderdaad dient te worden opgemerkt dat de meeste SMC zijn variabel in vorm, en zijn vaak uitgerekt en wikkeling ten opzichte MMC [1].
Conclusie
We hebben een methode RNA amplificatie uit samengevoegde intacte MCs geïsoleerd uit bevroren weefsel secties, die ons in staat stelt om de wereldwijde genexpressie patroon van de MC's gunstig te verkrijgen van verschillende weefsels, organen, en soorten, waaronder de mens. Met deze methode, hebben we aangetoond voor het eerst de afzonderlijke genexpressieprofielen van submucosale en mucosale MCs in de maag van de muis. . Onze bevindingen geven inzicht in mogelijke geïdentificeerde eigenschappen specifiek voor elk MC subklasse
Werkwijzen
materialen
De volgende materialen werden verkregen uit de bronnen aangegeven: HPLC gezuiverd T7- (dT) 24 primer [5' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] van GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Engeland), RNase-free water, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E .
coli DNA polymerase I, E. coli DNA ligase
, T4 DNA polymerase en willekeurige hexameren van Invitrogen (San Diego, CA), RNase remmer, glycogeen en MEGAscript T7 kit van Ambion (Austin, TX). Balb /c muizen werden verkregen van JapanClea (Hamamatsu, Japan). Deze studie werd goedgekeurd door het Comité voor de Animal Research van Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences.
RNA-amplificatie en oligonucleotide microarray
muis interleukine-3-afhankelijke BMMCs werden bereid zoals eerder beschreven [39].

• Een patiënt met maagkanker met peritoneale carcinomatosa behandeld met intraperitoneale chemotherapie die overleefden meer dan 5 jaar ontvangen herhaalde laparoscopische examens: een case report
• Immunisatie met de immunodominante Helicobacter suis urease subunit B induceert gedeeltelijke bescherming tegen H. suis infectie in een muismodel