Karakterisering af genekspression profiler til forskellige typer af mastceller poolet fra muse maven underregioner af en RNA-amplifikationsmetode

Karakterisering af genekspression profiler til forskellige typer af mastceller poolet fra muse maven underregioner af en RNA-amplifikationsmetode
Abstract
Baggrund
Mastceller (MCS) spiller afgørende roller i allergi og medfødte immunitet og består af heterogene underklasser . Men det molekylære grundlag fastsættelsen af ​​de forskellige karakteristika af disse mange MC underklasser fortsat uklart,.
Resultater
at nærme sig dette, vi udviklet en metode til RNA ekstraktion /forstærkning for intakt in vivo
MC'er samlet fra frosne vævssnit , som gjorde det muligt at opnå den globale genekspression mønster af poolede MCs tilhører samme underklasse. MC'er blev isoleret fra submucosa (SMC'er) og slimhinder (MMC) af muse mave sektioner, fik henholdsvis 15 celler samledes, og deres RNA blev ekstraheret, amplificeret og underkastet microarray analyse. Kendte markørgener specifikke for MMC-kort og SMC'er viste forventet udtryk tendenser, der angiver nøjagtigheden af ​​analysen.
Vi identificerede 1.272 gener, der viser markant forskellige udtryk niveauer mellem SMC'er og MMC-kort, og klassificeret dem i klynger på grundlag af ligheden mellem deres udtryk profiler sammenlignet med knoglemarv-afledte MC'er, som er de dyrkede MC'er med såkaldte "umodne" egenskaber. Blandt dem, fandt vi, at flere centrale gener såsom Notch4
havde SMC-partisk udtryk og Ptgr1
havde MMC-partisk udtryk. Desuden er der en forskel i ekspressionen af ​​adskillige gener, herunder ekstracellulære matrix proteinkomponenter, adhæsionsmolekyler og cytoskeletproteiner mellem de to MC underklasser, hvilket kan afspejle funktionel tilpasning af hver MC til den mucosale eller submukøse miljø i maven.
Konklusion
Ved anvendelse af fremgangsmåden af ​​RNA amplifikation fra poolede intakte MC'er, karakteriserede vi de distinkte genekspressionsprofiler af SMC'er og MMC'er i musen maven. Vores resultater giver indblik i mulige uidentificerede egenskaber specifikke for hver MC underklasse.
Baggrund
Mastceller (MCS) er afledt fra bloddannende stamceller og spille vigtige roller i allergiske reaktioner, medfødte immunitet og forsvar mod parasit-infektion. I modsætning til andre blodceller, MCs migrerer ind perifere væv som umodne stamceller og differentiere til modne mastceller. En af de unikke funktioner i MC'er er, at de viser en bred vifte af fænotyper afhængig af de forskellige væv mikromiljø deres modning [1]. I MC'er er forskellige MC-specifikke serinproteaser gemt i de sekretoriske granula, og deres gen og protein udtryk er dramatisk ændret, når deres celle miljø ændres. For eksempel Reynolds et al.
Har vist, at mindst seks forskellige medlemmer af muse MC-specifikke serinproteaser udtrykkes i forskellige kombinationer i forskellige mast cellepopulationer [2]. Desuden har nylige undersøgelser vist, at modne MC'er varierer i forhold til, hvad overflade receptorer og lipidmediatorer de udtrykker [3, 4]. Fordi hver mast celle population in vivo
skal spille en særlig rolle i kroppen, er det vigtigt at bestemme karakteren af ​​hver population af MC'er.
Omfattende genekspression analyse er en kraftfuld metode til at forstå karakteriseringen af ​​forskellige MC subpopulationer. Til dato har flere undersøgelser af microarray analyse af MC'er er foretaget [5-7], men de fleste af dem behandlet MC'er dyrket in vitro
. Alternativt har genekspression profiler af MC'er isolerede fra huden og lunge analyseret [3, 8-10]. Imidlertid er antallet af MC'er analyseret, som én prøve var relativt høj og de blev udsat for fysiske kræfter, enzymer og anti-Kit antistof til oprensning, hvorunder de oprindelige egenskaber af MCs måtte være blevet berørt. Salg In mave tarmkanalen, der er MCs, som hovedsageligt er klassificeret i to underklasser; slimhinde MC'er (MMC-kort) og submukøse MC'er (SMCs) på grundlag af deres placering, morfologi (størrelse og form) og granula indhold [11, 12]. MMC-kort findes hovedsageligt i slimhinden i mave-tarmsystemet, der chondroitinsulfat-holdige granuler, som er farvet med toluidinblåt men ikke safranin, og deres aktivering forekommer under parasit-infektion [13], mens SMC'er er lokaliseret i submucosa af mave tarmkanalen og deres granula er rige på heparin og farvet med både toluidinblåt og safranin [1, 11]. Men den molekylære basis bestemmelse af forskellene i biokemiske egenskaber af disse to MC underklasser er fortsat usikker, delvist på grund af vanskeligheden ved deres isolation.
At overvinde disse problemer, her etablerede vi en fremgangsmåde til RNA-amplifikation fra intakte MC'er isoleret fra frosset vævssnit, som gør det muligt for os at bekvemt opnå den globale genekspression mønster af MC'er i forskellige væv. For at validere denne metode, vi først bestemt den mindste celle nummer kræves for at opnå reproducerbar RNA forstærkning. Vi derefter sammenlignet genekspressionsprofilerne opnået fra lille antal MMC-kort og SMC'er i musen maven, og fundet flere vigtige gener til at være specielt til udtryk i en underklasse af MC'er, hvilket kan afspejle nogle aspekter af de forskellige egenskaber mellem de to MC underklasser i mave-tarmkanalen.
Resultater og diskussion
Udvikling af en RNA forstærkning protokol for at opnå genekspressionsprofiler fra en lille mængde RNA
at få indsigt i de funktionelle forskelle mellem de forskellige underklasser af MC'er, vi ansat tre runder af T7-baserede RNA-amplifikation metode. Baseret på de foreløbige eksperimenter ved hjælp peritoneale MC'er og knoglemarv-afledte MC'er (BMMC'er), vi skønnede, at en enkelt MC giver 2 pg af RNA. Før vi udførte sammenlignende analyse af MC'er fra forskellige væv, vi først evalueret nøjagtigheden og reproducerbarheden af ​​tre runder af T7-baserede RNA forstærkning metode, startende med mængden af ​​RNA, der kan opnås fra en enkelt MC. For at vurdere dette, vi først sammenlignede microarray resultater opnået fra 5 pg BMMC RNA udarbejdet af standardprotokol med dem, der opnås fra det samme RNA fortyndet 10 5- eller 10 6 gange (30 pg, 10 pg og 2 pg) og underkastet tre runder af T7-baserede amplifikation (figur 1a-c). Selvom tre runder af amplifikation gav nok mængde RNA til microarray analyse (> 20 ug) selv i tilfælde af 2 pg RNA, scatter plot-analyse viste, at de kvaliteter af de opnåede resultater var helt anderledes mellem prøverne fra 5 ug og 2 pg RNA. Generne bedømmes som Nærvær i både 30 pg og 5 pg af RNA var 8149 gener, som svarede til 72% af gener anses som Nærvær i 5 ug RNA (11,344 gener; figur 1A), mens kun 4.116 gener blev bedømt som nærvær i både 2 pg og 5 pg RNA, som svarede til kun 36% af gener anses som nærvær i 5 ug RNA (fig 1c). Faldet i antallet af gener vurderes som Nærvær i de fortyndede prøver (30 pg, 10 pg og 2 pg) kan skyldes tabet af et lavt kopiantal RNA-arter under amplifikation. Figur 1 Sammenligninger af tre runde-amplificerede produkter starter med meget små mængder af RNA. (A-c) Amplification skævheder i produkterne startende fra en lille mængde RNA. Scatter plot af signal intensitet opnået fra 5 pg BMMC RNA udarbejdet af standardprotokol og fra 30 pg (en
), 10 pg (B
) og 2 pg (c
) af BMMC RNA udarbejdet af tre runder af amplifikation er vist. (D, e) Reproducerbarhed af de tre-runde amplifikation af en lille mængde RNA. Scatter plot af signal intensitet mellem to uafhængige produkter fra 30 pg af BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 og BMMC 30 pg-2) (d
) eller fra 2 pg af BMMC RNA (BMMC 2 pg-1 og BMMC 2 pg-2) (e
), er vist. Røde prikker viser probe sæt bedømmes som "Presence", og gule prikker repræsenterer probe sæt bedømmes som "Fravær" i begge arrays. Blå prikker viser probesæt anses som "Presence" kun i begge array. De korrelationskoefficienter (r) præsenteres. De samme, fire-fold induktion og undertrykkelse tærskelværdier er angivet som diagonale linjer. Gener bedømmes som "tilstedeværelse" er placeret i grupper svarende til parvis overlapper vist i de ledsagende Venn-diagram.
Vi undersøgte dernæst reproducerbarheden af ​​microarray resultater fra to sæt af 30 pg BMMC RNA-prøver (30 pg-1 og 30 pg-2) eller to sæt af 2 pg prøver (2 pg-1 og 2 pg-2) (figur 1d og 1e). I de 30 pg RNA-prøver, 7.537 (30 pg-1) og 8777 (30 pg-2) generne blev bedømt som Nærvær. Det er dog kun 4324 (2 pg-1) og 4.460 (2 pg-2) generne blev bedømt som Nærvær i hver 2 pg RNA-prøve, hvilket igen antyder tab af et lavt kopiantal RNA'er under amplifikation fra en lille mængde RNA. Med hensyn til reproducerbarhed, blev 86% af den "Presence" gener i 30 pg-1 og 74% af 'Presence' gener i 30 pg-2 prøve bedømmes som "Presence" i både 30 pg RNA-prøver, mens kun 57 % af 'Presence' gener i 2 pg-1 og 55% af 'Presence' gener i 2 pg-2 prøve blev bedømt som "Presence" i både 2 pg RNA-prøver. Disse resultater antydede, at de amplificerede produkter fra RNA fra en enkelt MC (ca. 2 pg) ved den nuværende metode kan indbefatte betydelige amplifikationsprodukter artefakter forårsager problemer med nøjagtighed og reproducerbarhed. På den anden side, på grund af den højere reproducerbarhed (> 74%), konkluderede vi, at amplifikation fra 30 pg RNA indsamlet fra 15 MC'er ville være egnet til den praktiske undersøgelse af væv MCs. Baseret på disse resultater, vi sat vores mål i denne undersøgelse at erhverve genekspression profiler af MC'er samlet fra forskellige regioner. For at minimere indflydelsen af ​​celle-til-celle variation inden for samme klasse og potentiel forstærkning artefakter, vi udarbejdet tre sæt af 15 MCs for hver region og sammenlignet gener med signifikant forskellig udtryk mellem MC'er fra de forskellige regioner (figur 2b). Vi valgte mave som kilde orgel, da vi kan isolere to slags MC'er fra slimhinden (MMC) og submucosa (SMC) regioner af de samme sektioner, og MMC-kort og SMC'er er mistænkt for at være anderledes i flere MC egenskaber såsom proteaseekspression profil og følsomhed over for safranin farvning [1, 11]. Figur 2 genekspression profiler af SMC'er og MMC'er fra mave væv. (A) Isolering af toluidinblåt-farvede MC'er i submucosa (SMC, øvre paneler
) og slimhinden (MMC; lavere paneler
) i mave sektioner. En SMC (pil
) og MMC (pilespidsen
), som blev metachromatically farvet med toluidinblåt før mikrodissektion (venstre paneler
) forsvandt efter mikrodissektion med en patch pipette (højre paneler
). Barer
, 10 um. (B) Beskrivelse af den eksperimentelle strategi. (C) Mærket og fragmenterede antisense RNA af tre individuelle SMC prøver, tre individuelle MMC prøver og de »ingen celle 'prøver blev hybridiseret til en Murine Array. Scatter plots for 'ingen celle' (x-aksen) og SMC1 (y-akse) (øverst til venstre
), »ingen celle '(x-aksen) og mMC1 (y-aksen) (nederste venstre
), SMC1 (x akse) og sMC2 (y-akse) (øvre center
), mMC1 (x-akse) og mMC2 (y-akse) (lavere center
), SMC1 (x-akse) og mMC1 (y-akse) (øverst til højre
) vises. De korrelationskoefficienter (R) for sammenligning inden sMC1-3, inden mMC1-3 og mellem SMC'er og MMC-kort præsenteres som betyder ± S.D. Røde prikker viser probe sæt bedømmes som "Presence", og gule prikker repræsenterer probe sæt bedømmes som "Fravær" i begge arrays. Blå prikker viser probesæt anses som "Presence" kun i begge array. De samme, to-fold induktion og undertrykkelse tærskelværdier er angivet som diagonale linjer.
Gene udtryk profiler af submukøse og slimhinder MC'er fra maven
Til visualisere to slags MC'er i maven uden at forårsage RNA-nedbrydning, sektionerne var fikseret med Carnoys fiksativ og metachromatically farvet med toluidinblåt i nogle sekunder. SMC'er og MMC'er blev mikrodissekeres anvendelse af et plaster pipette (figur 2a og 2b). Vi forberedt tre sæt af 15 MCs for hver region, udvundet deres RNA og individuelt forstærket dem (SMC 1, SMC 2, SMC, og MMC 3 1, MMC 2, MMC 3). For at forbedre inddrivelsen af ​​udvinding af så lidt som 30 pg af RNA, vi brugte 'poly G' som en bærer, som ikke interfererer med følgende RNA forstærkning eller hybridisering af amplificeret produkt til array (data ikke vist). For at undersøge effekten af ​​uspecifikt forstærkede artefakt produkter, vi udførte RNA ekstraktion /forstærkning proceduren uden at tilføje Mikrodissekterede celler ( "ingen celle") som en negativ kontrol (beskrevet i "Materialer og metoder
"). De amplificerede RNA'er af SMC'er, MMC og "ingen celle" kontrol blev separat hybridiseret til en murin microarray. Signalværdierne i "ingen celle" prøve var lave i almindelighed og ligner de baggrundsniveauer (figur 2C). De scatter plots af prøverne selvstændigt udarbejdet inden for samme koncern (eksempelvis SMC 1 vs smc 2) viste et lignende udtryk mønster; den gennemsnitlige korrelationskoefficient for alle probe-sæt var 0,945 ± 0,004 og 0,893 ± 0,019 i SMC'er og MMC, henholdsvis (n
= 3). I modsætning hertil den gennemsnitlige korrelationskoefficient mellem SMC'er og MMC-kort var 0,752 ± 0,034 (n
= 3), som var meget lavere end inden for samme koncern, hvilket tyder på, at deres genekspression mønstre er forskellige.
Vi evalueres yderligere nøjagtighed og reproducerbarhed af vores metode af andre omfattende analyser (hierarkiske clustering analyse og principal komponent analyse [PCA]) ved hjælp af alle probe sæt. Microarray data fra SMC'er, MMC-kort, hud-afledte MC'er, peritoneale MCs, BMMC'er og ikke-MC'er (makrofager og fibroblaster) blev anvendt til disse analyser. Vi først kontrolleres, om amplifikationsprocessen i vores metode påvirker den globale ekspressionsprofil grund af ikke-lineær forstærkning. Resultaterne fra de BMMC prøver under anvendelse RNA fremstillet ved standardprotokol (BMMC-std) eller amplifikationsmetoden (BMMC-amp) blev underkastet disse analyser. Både hierarkiske clustering analyse og PCA afslørede, at microarray data fra BMMC-std og BMMC-amp var samlet i samme gruppe (figur 3a og 3b), hvilket antyder, at den globale lighed i genekspressionsprofiler opretholdes under amplifikationsprocessen. Vi næste undersøgte ligheden af ​​ekspressionsmønstre i tre uafhængige SMC eller MMC prøver. Ved clustering analyse og PCA, SMC 1-3 og MMC 1-3 blev grupperet i samme gruppe, hhv. PCA viste også, at udtrykket profiler af SMC'er, MMC og BMMC'er er indbyrdes forskellige (figur 3b). Figur 3 Global genekspression analyse af smc 1-3 og MMC 1-3. (A) Hierarkisk klyngedannelse af global genekspression af forskellige præparater af MC'er og ikke-MC'er. Tre-runde forstærkede produkter sMC1-3, mMC1-3, hud MC'er og BMMC'er og standard produkter BMMC'er, blev analyseret peritoneale MCS makrofager og fibroblaster. (B) Den vigtigste komponent analyse (PCA) afslører forskellige genekspression profiler af sMC1-3, mMC1-3 og to præparater af BMMC'er. Den blå stiplede firkant angiver MMC-kort, den røde stiplede firkant angiver SMC'er, og den sorte stiplede firkant angiver BMMC'er.
Vi derefter sammenlignet maven-afledte MCs (SMC'er og MMC-kort) med hud-afledte MC'er, peritoneale MC'er, BMMC'er og ikke -MCs (makrofager og fibroblaster) ved clustering analyse. De vævsafledte MC'er (mave MC'er og hud MC'er) blev grupperet separat fra peritoneale MC'er og BMMC'er. Disse resultater kan afspejle forskellige egenskaber mellem væv-afledte MC'er med fast vedhæftning til de omkringliggende celler og flydende MCs uden en tæt kontakt. Med hensyn til ligheden mellem MC'er med fibroblaster og makrofager, er det rimeligt, at fibroblaster er længst væk fra MC'er og makrofager er tættere på MC'er som en leukocyt familie.
Validering af microarray resultater efter real time RT-PCR-analyse
vi Derefter undersøgte, om hybridiseringssignaler ved kendte markørgener specifikke for SMC'er og MMC'er viste det forventede udtryk tendenser [12, 14]. MMC-specifikke gener, mastcelle-protease 1 (Mcpt1 Salg) og 2 (Mcpt2 Salg) viste højere værdier i MMC-kort, mens SMC-specifikke markørgener, mastcelle protease 4 (Mcpt4
) og chymase 2 (Cma2
), viste højere signalværdier i SMC'er (tabel 1 og figur 4a) [15-29]. På den anden side, MC-fælles markører, såsom kit onkogen (Kit
) og Fce receptor (Fcer1a
) viste signifikante signalværdier med ingen bias mellem MMCS og SMC'er. For yderligere at evaluere resultaterne, vi målte ekspressionsniveauerne af disse markørgener ved real-time RT-PCR under anvendelse af RNA fra de uafhængigt isolerede MC'er (figur 4b). Desuden valgte vi tilfældigt tre gener, der viser 'MMC-partisk' udtryk og en anden tre gener, der viser "SMC-partisk 'udtryk; ekspression af disse gener i MC'er er ikke blevet rapporteret tidligere (figur 4a). Der var ingen signifikante forskelle i ekspressionsniveauerne af Kit
og Fcer1a
mellem MMCS og SMC'er. I modsætning hertil MMC-specifikke markører Mcpt1
og Mcpt2
og »MMC-partisk 'gener, Anxa10, CTSE
, og Fos
viste højere ekspression i MMC-kort, og SMC-specifikke markører Mcpt4
og Cma2
og »SMC-biased 'gener, Cnn1, Ces3
, og Cpe
viste højere udtryk i SMC'er. Disse resultater indikerer, at microarray resultater er pålidelige og afspejler genekspressionsprofilerne af intakte SMC'er og MMC'er i maven. Figur 4 Validering af differentielt udtrykte gener mellem SMC'er og MMC-kort. (A) SMC-specifikke (Cma2
, Mcpt4
), MMC-specifikke (Mcpt1
, Mcpt2
) og MC-fælles markører (Fcer1a
og Kit
) (venstre panel
) og seks tilfældigt udvalgte gener (Ces3
, Cnn1
CPE
, Anxa10
, CTSE
og Fos
) (højre panel
) er angivet i den repræsentative scatter korrelationen grafer mellem SMC1 og mMC1. De samme, to-fold induktion og undertrykkelse tærskelværdier er angivet som en gul, blå og rød linje hhv. (B) Ekspressionsniveauerne for generne i (a) blev kontrolleret af real-time RT-PCR. Værdierne repræsenterer forholdet mellem de relative ekspressionsniveauer af MMC-kort til SMC'er, og er vist som gennemsnit ± S.D. (N = 3). Specificiteten af ​​PCR-produktet blev bekræftet ved gelelektroforese og analyse af smeltepunktet. Udtrykket for hver genet blev normaliseret til 28S ribosomale RNA.
Tabel 1 Oversigt over gener undersøgt af real-time PCR-analyse.
Gene Symbol

Gene Name
RefSeq Transcript ID
reference
kit
kit onkogen
NM_021099
15
Fcer1a

Fc fragment af IgE, høj affinitet jeg, receptor for α-polypeptid
NM_010184
16
Mcpt1
mast celle protease 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mast celle protease 2
NM_008571
19
Mcpt4
mast celle protease 4
NM_010779
2, 20
Cma2

chymase 2, mast celle (mast celle protease 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
annexin A10
NM_011922
21
CTSE

katepsin E
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarkom onkogen
NM_010234
23
Ptgr1
Prostaglandin reduktase 1 (leukotrien B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (svin)
Cnn1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
carboxylesterase 3
NM_053200
26
Cpe
carboxypeptidase E
NM_013494
27 (kvæg)
Notch4
Notch gen homolog 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S ribosomale RNA
NR_003279
29
*, den kodende sekvens i dette papir er den N-terminale afkortet-form af Cma2
, mens RefSeq " NM_001024714 "er den komplette sekvens af Cma2
.
Clustering analyse af genekspression profiler og funktionelle kategorisering mellem SMC'er og MMC-kort
af de ~ 12.000 gener, der er repræsenteret på oligonukleotidet array, valgte vi 1.272 gener, hvis udtryk niveauer mellem smc 1-3 og MMC 1-3 var signifikant forskellige (p
< 0,05, Limma t
test). Udtrykket for hver genet blev normaliseret ved niveauet i BMMC'er, som er dyrkede MC'er med såkaldte "umodne" egenskaber, og de udvalgte gener blev klassificeret i syv klynger ved hjælp af k
-means clustering algoritme (CL1-7; figur 5a og Ekstra fil 1). Vi klassificerede også generne i funktionelle kategorier, og de repræsentative gener er angivet (figur 5b). Blandt dem, 666 gener (52,4%) viste SMC-forspændt ekspression (CL1-3
); i 78% (519 gener) af SMC-rige gener, ekspressionsniveauerne var relativt lavt i BMMC'er og udvidet i SMC (CL1 og 2.
). For eksempel ekspressionsniveauet af Mcpt4
var relativt lav i BMMC'er, og hvis udtrykket profil BMMC'er afspejler de umodne egenskaber MC-progenitorer, kan det konkluderes Mcpt4
at blive induceret under den endelige modning til SMC'er. Interessant SMC markørgener Mcpt5
og Mcpt6
blev klassificeret i CL2 /3 fotos, antyder, at disse gener blev udtrykt i nogen grad i "umodne" BMMC'er, men deres ekspression blev undertrykt under modning i MMCS. På den anden side, 606 gener (47,6%) viste MMC-forspændt ekspression (CL4-7
); i 51% (334 gener) af MMC-rige gener, deres ekspressionsniveauerne i BMMC'er var lave, men blev forstærket i MMC-kort (CL4 & 5 fotos). For eksempel udtryk for Mcpt1
var lav i "umodne" BMMC'er men blev drastisk induceret under modning i MMC-kort. Figur 5 Clustering analyse af genekspressionsprofilerne mellem SMC'er og MMCS. (A) repræsentation af mRNA ekspressionsniveauer af sMC1-3 og mMC1-3 sammenlignet med BMMC'er. Farven af ​​søjlerne repræsenterer forholdet mellem signal intensitet mellem uafhængige prøver og BMMC'er, i henhold til skalaen vises øverst til højre
. Gener med signifikant forskellig udtryk mellem SMC'er og MMC-kort (p
< 0,05, Limma t
test) blev udvalgt (1.272 gener) og klassificeret i 7 klynger ved hjælp af k
-means algoritme (CL1-7
). (B) Funktionel kategorisering af repræsentative gener fra (a).
Protein udtryk for Notch4 i SMC'er og Ptgr1 i MMC-kort i maven væv
Blandt de gener, der viser forskellen udtryk (figur 5b), vi yderligere fokuseret på ekspression af Notch4
i SMC'er og Ptgr1
i MMC-kort, som begge har aldrig været tidligere kendetegnet ved MC'er. Den Notch4
genprodukt er et medlem af familien Notch, bestående af transmembrane receptorer, som aktiveres af celleoverfladeligander på tilstødende celler. Nylige undersøgelser har antydet, at Notch signalering er involveret i lymfocyt og mastcelledifferentiering [30, 31]. Vi først bekræftet, at Notch4
udtryk er væsentligt højere i de særskilt poolede SMC'er end MMC-kort med real-time RT-PCR (data ikke vist). Derefter undersøgte vi, om Notch4 proteinet er udelukkende til stede i SMC'er ved immunofarvning af mavevæv (figur 6a). Notch4 signaler blev påvist i nucleus-lignende strukturer af SMC'er men ikke i de af MMCS. Desuden blev Notch4 signaler også fundet i huden MC'er, der ved siden af ​​hinanden blev grupperet med SMC'er (figur 3a). Disse resultater viser, at Notch4 er til stede i SMC'er men ikke i MMC-kort, og antyder, at Notch4 deltager i SMC-specifik transkription af Notch-målgener, som kan være påkrævet til nogle SMC funktioner. I hæmatopoietiske celler er det blevet rapporteret, at konstitutivt aktiv Notch4 fremmer ekspansion af stamceller og hæmmer myeloid differentiering [32]. Da Notch-ligander har vist sig at eksistere i bindevæv såsom hud dermis [33], vil det være interessant at undersøge, om Notch4 spiller en rolle ved differentiering af SMC'er og vedligeholdelse af SMC-funktioner. Figur 6 Immunhistokemisk analyse af Notch4 og Ptgr1 i SMC'er og MMC'er i maven væv. (A) Mavesubmucosa (SMCs, venstre paneler
), maveslimhinden (MMC-kort, midterste paneler
) og hud (hud MC'er, højre paneler
) sektioner blev farvet med et anti-Notch4 antistof (lavere paneler
) og med toluidinblåt (øverste paneler
). SMC'er farvet med anti-Notch4 antistof i de gastriske submucosa og hud dermis er angivet med pile. Ingen farvning blev observeret i MMCS (pilespidser
) lokaliseret i maveslimhinden. SMC'er og MMC'er blev metachromatically farvet med toluidinblåt. (B) Mavesubmucosa (SMC'er; venstre paneler
) og maveslimhinden (MMC-kort; højre paneler
) snit blev farvet med et anti-Ptgr1 antistof (nedre paneler
) og med toluidinblåt (øvre paneler
). Ingen farvning med anti-Ptgr1 antistof blev fundet i SMC'er (pil
). Små signaler blev observeret i MMC'er (pilespidser
). SMC'er og MMC'er blev metachromatically farvet med toluidinblåt. Barer
, 25 um (a, b).
Ptgr1
produkt, 15-oxo-prostaglandin 13-reduktase /leukotrien (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase er et essentielt enzym for inaktivering af eicosanoider såsom prostaglandin E 2 (PGE 2) og LTB 4 [34]. Selv om det er blevet rapporteret, at de veje for eicosanoid syntese afviger blandt de forskellige MC underklasser [1, 4], tyder vore resultater, at inaktiveringen system eicosanoider varierer også blandt MC underklasser. Ptgr1
ekspression blev fundet at være signifikant højere i de særskilt poolede MMC'er af real-time RT-PCR (data ikke vist). Vi undersøgte også Ptgr1 udtryk i maven sektioner ved immunfarvning. Signaler for den Ptgr1 proteinet blev fundet i granulneuroner-lignende strukturer af MMC-kort i maveslimhinden, men ikke i SMC'er (figur 6b), hvilket antyder, at Ptgr1 enzym kan frigives fra MMCS ved degranulering. Da PGE 2 skuespil kritiske roller i opretholdelsen af ​​tarmen homeostase gennem slimhinde beskyttelse og hæmning af syresekretion, er det muligt, når de aktiveres, MMC-kort negativt regulerer cytobeskyttende handlinger PGE 2 til hurtig inaktivering af Ptgr1.
Genekspression mønster af ekstracellulær matrix-komponenter, adhæsionsmolekyler og cytoskeletproteiner i SMC'er og MMC'er
MC fænotyper er blevet vist at afhænge af deres interaktion med de omgivende ekstracellulære matricer (ECMS) og tilstødende [1] celler. En af de mest bemærkelsesværdige fund i dette studie er forskellen i genekspression af ECM proteinkomponenter, adhæsionsmolekyler og cytoskeletale proteiner, hvilket kan afspejle funktionel tilpasning af hver type MC til den mucosale eller submukøse miljø i maven (figur 5b) . MMC-kort udtrykke gener for mucosa-specifikke ECM proteiner såsom MUC1
(Mucin) og TFF1
(Trefoil faktor), mens SMC'er udtrykke gener for konventionelle ECM proteiner såsom Col4a
(procollagen) og Lama2
(laminin). Desuden SMC'er udtrykke gener for adhæsionsmolekyler, såsom Alcam
og VCAM1
, og gener for almindelige cytoskeletale proteiner, såsom Acta2
(actin), mens MMC-kort ekspres desmosom-komponent gener, såsom Dsc2
( desmocollin) og Dsg2
(desmoglein), og gener for keratin intermediære filamenter såsom Krt8
og Krt19
. Desmosomer blev rapporteret at være til stede i maven epitel [35], og det blev konstateret, at der påvises desmosom-lignende strukturer i en bestemt type MC [36]. Det er således muligt, at MMC-kort interagerer med tilstødende epiteler gennem desmosomer adhæsion i maven. I modsætning hertil SMC'er synes at interagere med tilgrænsende celler via adhæsionsmolekyler såsom VCAM-1, ALCAM og VE-cadherin (VCAM1
, Alcam1
og Cdh5
). Da disse adhæsionsmolekyler har vist sig at være involveret i dynamisk regulering af actincytoskelettet [37, 38], kan sådanne molekyler-medierede interaktioner med submukøse celler være kritisk for at opretholde de funktionelle og morfologiske egenskaber af SMC'er. Faktisk bør det bemærkes, at de fleste SMC'er er variable i form, og er ofte strakt og snoede i forhold til MMC-kort [1].
Konklusion
Vi har etableret en metode til RNA forstærkning fra poolede intakte MC'er isoleret fra frosne væv sektioner, som gør det muligt for os at bekvemt opnå den globale genekspression mønster af MC'er fra forskellige væv, organer, og arter, herunder mennesker. Ved at bruge denne metode, demonstrerede vi for første gang de særskilte genekspressionsprofiler af submukøst og mucosale MC'er i musen maven. . Vores resultater giver indsigt i mulige uidentificerede egenskaber specifikke for hver MC underklasse
Metoder
Materialer
Følgende materialer blev opnået fra kilderne anført: HPLC renset T7 (dT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] fra GE Healthcare UK Ltd (Buckinghamshire, England), RNase-frit vand, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E coli.
DNA-polymerase I, E. coli
DNA-ligase, T4 DNA-polymerase og vilkårlige hexamerer fra Invitrogen (San Diego, CA), RNase-inhibitor, glycogen, og MEGAscript T7 kit fra Ambion (Austin, TX). Balb /c mus blev opnået fra JapanClea (Hamamatsu, Japan). Denne undersøgelse blev godkendt af Udvalget for Animal Research of Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences.
RNA forstærkning og oligonukleotid microarray
Mouse interleukin-3-afhængige BMMC'er blev fremstillet som beskrevet tidligere [39]. Totalt RNA af BMMC'er blev ekstraheret ved anvendelse RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA).

• En patient med mavekræft med peritoneal carcinomatose behandlet med intraperitoneal kemoterapi, der overlevede mere end 5 år modtager gentagne laparoskopisk undersøgelser: en case-rapport
• Immunisering med den immundominante Helicobacter suis urease subunit B inducerer delvis beskyttelse mod H. suis i en mus model