Karakterisering av genekspresjonsprofiler for ulike typer av mastceller samlet fra mus mageregioner av en RNA-amplifikasjon metode
Abstract
Bakgrunn
Mastceller (MCS) spiller sentral rolle i allergi og medfødt immunitet og består av heterogene underklasser . Men det molekylære grunnlaget bestemme de forskjellige egenskapene til disse flere MC underklasser er fortsatt uklart
. Resultater
å nærme seg dette, har vi utviklet en metode for RNA ekstraksjon /forsterkning for intakt in vivo
MCs samlet fra frosne vevssnitt som gjorde oss i stand til å oppnå global genekspresjon mønster av sammenslåtte MCs som tilhører samme underklasse. MCS ble isolert fra submucosa (SMC) og slimhinner (MMCer) av mus mage seksjoner, henholdsvis, ble 15 celler slått sammen, og deres RNA ble ekstrahert, amplifisert og utsatt for microarray analyse. Kjente markørgener som er spesifikke for MMCs og SMCS viste forventet uttrykk trender, noe som indikerer nøyaktigheten av analysen.
Vi identifiserte 1,272 gener som viser signifikant forskjellige uttrykk nivåer mellom SMCS og MMCs, og klassifisert dem i klynger på grunnlag av likhet i sine uttrykk profiler sammenlignet med benmargavledede MCs, som er de dyrkede MCs med såkalte "umodne" egenskaper. Blant dem, fant vi at flere viktige gener som Notch4
hadde SMC-partisk uttrykk og Ptgr1
hadde MMC-partisk uttrykk. Videre er det en forskjell i ekspresjonen av flere gener, inkludert ekstracellulære matriks-proteinbestanddeler, adhesjonsmolekyler, og cytoskeletal proteiner mellom de to MC underklasser, som kan gjenspeile funksjonelle tilpasning av hvert MC til den mukosale eller submucosal miljø i magen.
Konklusjon
Ved å anvende fremgangsmåten i RNA-amplifikasjon fra sammenslåtte intakte MCS, karakterisert vi distinkte genekspresjonsprofiler av SMC og MMCs i mus magen. Våre funn gir innblikk i mulige uidentifiserte egenskaper spesifikke for hver MC underklasse.
Bakgrunn
mast celler (MCS) er avledet fra blodkreft stamceller og spiller viktige roller i allergiske reaksjoner, medfødt immunitet og forsvar mot parasitt infeksjon. I motsetning til andre blodceller, MCs migrere inn i perifert vev som umodne stamceller og differensiere til modne mastceller. En av de unike funksjonene til MCs er at de viser en rekke fenotyper avhengig av ulike vev mikromiljøet av deres modning [1]. I MCs, blir ulike MC-spesifikke serin proteaser lagret i sekretoriske granulater, og deres gen- og proteinuttrykk er dramatisk endret når deres cellemiljøet er endret. For eksempel, Reynolds et al.
Har vist at minst seks forskjellige medlemmer av mus MC-spesifikke serin-proteaser er uttrykt i forskjellige kombinasjoner i forskjellige mastcellepopulasjoner [2]. I tillegg har nyere studier vist at modne MCs varierer i form av hva overflate reseptorer og lipid meklere de uttrykker [3, 4]. Fordi hver mastcellepopulasjon in vivo
må spille en spesifikk rolle i kroppen, er det viktig å bestemme karakteren av hver populasjon av MCS.
Omfattende genekspresjonsanalyser er en kraftig metode for å forstå karakterisering av forskjellige MC subpopulasjoner. Til dags dato har flere studier på microarray analyse av MCs utført [5-7], men de fleste av dem behandlet MCs dyrket in vitro
. Alternativt har genuttrykk profiler av MCs isolert fra hud og lunge blitt analysert [3, 8-10]. Imidlertid er tallene MCS analysert som en prøve var forholdsvis høy, og de ble utsatt for fysiske krefter, enzymer og anti-kit antistoff for rensning, hvorunder de opprinnelige egenskaper av MCS kan ha blitt påvirket.
I den gastrointestinale skrift er det MCS som hovedsakelig klassifiseres i to underklasser; mucosal MCS (MMCer) og submukosale MCS (SMC) på grunnlag av deres plassering, morfologi (størrelse og form) og granule innhold [11, 12]. MMCer er hovedsakelig funnet i slimhinner i fordøyelsessystemet, som har chondroitin sulfat-inneholdende granuler, som er farget med toluidinblått men ikke safranin, og deres aktivering skjer i løpet parasitt infeksjon [13], mens SMCS er lokalisert i submucosa i fordøyelses skrift og deres granuler er rike på heparin og farget med både toluidinblått og safranin [1, 11]. Imidlertid gjenstår det molekylære grunnlag å bestemme forskjellene i biokjemiske egenskaper av disse to underklasser MC usikker, delvis på grunn av vanskeligheten med deres isolasjon.
For å overvinne disse problemene, her etablert vi en fremgangsmåte for RNA-amplifikasjon fra intakte MC isolert fra frosset vevssnitt, som gjør oss i stand til å enkelt få tak i den globale genuttrykk mønster av MCs i ulike vev. For å validere denne metoden, må vi først bestemt minimums celle nummer som kreves for å oppnå reproduserbare RNA forsterkning. Vi sammenlignet genekspresjonsprofiler erholdt fra et lite antall MMCs og SMC i mus magen, og fant flere nøkkelgener for å være spesifikt uttrykkes i en undergruppe av MCS, noe som kan gjenspeile noen aspekter av de spesielle egenskaper mellom de to MC underklasser i mage-tarmkanalen.
diskusjon Resultater og
Utvikling av et RNA amplifikasjonsprotokoll å få genuttrykk profiler fra en liten mengde RNA
å få innsikt i de funksjonelle forskjeller mellom de ulike underklasser av MCs, ansatt vi tre runder av T7-basert RNA amplifiseringsmetode. Basert på foreløpige eksperimenter med peritoneal MCs og benmargavledede MCs (BMMCs), beregnet vi at en enkelt MC gir 2 pg av RNA. Før vi utførte sammenlignende analyse av MC fra forskjellige vev, først evaluert vi nøyaktigheten og reproduserbarheten av tre runder med T7-RNA-basert amplifikasjon Fremgangsmåte, som starter med mengden av RNA som kan oppnås fra en enkelt MC. For å vurdere dette, vi først sammenmicroarray resultatene oppnådd fra 5 ug av BMMC RNA fremstilt ved standard protokoll med de som ble oppnådd fra den samme RNA fortynnes 10
5- eller 10 6-fold (30 pg, 10 pg og 2 pg) og underkastet tre runder med T7-baserte forsterkning (figur 1a-c). Selv om tre runder av amplifikasjon ga nok mengde av RNA for microarray analyse (ved 20 ug) selv i tilfellet av 2 pg RNA, spredningsplott analyse viste at egenskapene til de oppnådde resultatene var ganske forskjellig mellom prøvene fra 5 ug og 2 pg RNA. Genene dømt som "Presence" i både 30 pg og 5 mikrogram av RNA var 8.149 gener, som tilsvarte 72% av genene dømt som "Presence" i 5 mikrogram av RNA (11,344 gener; Figur 1a), mens bare 4116 gener ble bedømt som "Presence" i både 2 pg og 5 mikrogram av RNA, som tilsvarte bare 36% av genene dømt som "Presence" i 5 mikrogram RNA (Figur 1c). Reduksjonen i antall gener som måtte anses som "Presence" i de fortynnede prøver (30 pg, 10 pg og 2 pg) kan være forårsaket av tap av lav kopiantall-RNA-arter i løpet av amplifisering. Figur 1 Sammenligninger av tre runde-forsterket produkter som starter med svært små mengder av RNA. (A-c) Amplification skjevheter i produktene som starter fra en liten mengde av RNA. Scatter plott av signalintensitet hentet fra 5 mikrogram BMMC RNA utarbeidet av standard protokoll og fra 30 pg (en
), 10 pg (b
) og 2 pg (c
) av BMMC RNA utarbeidet av tre runder med forsterkning vises. (D, e) Reproduserbarhet av de tre runde amplifikasjon av en liten mengde av RNA. Scatter plott av signalintensitet mellom to uavhengige produkter fra 30 pg av BMMC RNA (BMMC 30 pg-en og BMMC 30 pg-2) (d
) eller fra 2 pg av BMMC RNA (BMMC 2 pg-en og BMMC 2 pg-2) (e
), vises. Røde prikker viser probe sett bedømt som "Presence", og gule prikkene representerer probe sett bedømt som "Absence" i begge rekker. Blå prikker viser probe sett bedømt som "Presence" bare i enten array. Korrelasjonskoeffisientene (r) er presentert. De samme, fire-fold induksjon og undertrykkelse tersklene er angitt som diagonale linjer. Gener bedømt som "Presence", plasseres i grupper tilsvarende parvis overlapper vist i de medfølgende Venn-diagrammer.
Vi neste undersøkte reproduserbarheten av microarray resultatene oppnådd fra to sett av 30 pg BMMC RNA-prøver (30 pg-1 og 30 pg-2) eller to sett med 2 pg prøver (2 pg-1 og 2 pg-2) (figur 1d og 1e). I de 30 pg RNA prøver, 7537 (30 pg-1) og 8777 (30 pg-2) gener ble dømt som "Presence". Det er imidlertid bare 4324 (to s-1) og 4460 (2 pg-2) gener ble bedømt som "Presence" i hver 2 pg RNA prøven, igjen antyder tap av lave kopitall RNA i løpet av amplifisering fra en liten mengde av RNA. Som til reproduserbarhet, ble 86% av "Presence" gener i 30 pg-en og 74% av "Presence" gener i 30 pg-2 prøve bedømt som "Presence" i både 30 pg RNA prøver, mens bare 57 % av "Presence" gener i 2 pg-en og 55% av "Presence" gener i 2 pg-2 utvalget ble dømt som "Presence" i både 2 pg RNA prøver. Disse resultatene antydet at de amplifiserte produkter fra RNA fra en enkelt MC (ca. 2 s) ved den nåværende fremgangsmåte kan omfatte betydelige forsterknings gjenstander som forårsaker problemer med nøyaktighet og reproduserbarhet. På den annen side, på grunn av den høyere reproduserbarhet (mer enn 74%), konkluderte vi med at forsterkningen fra 30 pg RNA samlet fra 15 MCS ville være egnet for den praktiske analyse av vev MCS. Basert på disse resultatene, setter vi vårt mål i denne studien å tilegne genuttrykk profiler av MCs sammenslåtte fra ulike regioner. For å minimalisere påvirkning av celle-til-celle variasjoner innenfor samme klasse og potensiell forsterknings gjenstander ble det fremstilt tre sett med 15 MCS for hver region, og sammenlignet gener med vesentlig forskjellig uttrykk mellom MC fra forskjellige regioner (figur 2b). Vi valgte magen som kilde organ, siden vi kan isolere to typer MCs fra slimhinnene (MMC) og submucosa (SMC) regioner av de samme delene, og MMCs og SMCS har vært mistenkt for å være annerledes i flere MC egenskaper som protease uttrykk profil og sensitivitet for safranin farging [1, 11]. Figur 2 genuttrykk profiler av SMCS og MMCs fra magen vev. (A) Isolering av toluidinblått-farget MCs i submucosa (SMC; øvre panelene
) og slimhinnene (MMC, nedre paneler
) av mage seksjoner. En SMC (pil
) og MMC (pilspiss
) som ble metachromatically farget med toluidinblått før mikrodisseksjon (venstre panel
) forsvant etter mikrodisseksjon med en lapp pipette (høyre panel
). Barer
, 10 mikrometer. (B) omriss av den eksperimentelle strategi. (C) Merket og fragmenterte antisense RNA av tre individuelle SMC prøver, tre individuelle MMC prøver og 'ingen celle' prøver ble hybridisert til en Murine Array. Scatter tomter for 'ingen celle' (x-aksen) og sMC1 (y-aksen) (øverst til venstre
), 'ingen celle' (x-aksen) og mMC1 (y-aksen) (nederst til venstre
), sMC1 (x aksen) og sMC2 (y-aksen) (øvre sentrum
), mMC1 (x-aksen) og mMC2 (y-aksen) (nedre sentrum
), sMC1 (x-aksen) og mMC1 (y-aksen) (øverst til høyre
) vises. Korrelasjonskoeffisientene (r) for sammenligning innenfor sMC1-3, innen mMC1-3 og mellom SMCS og MMCs er presentert som gjennomsnitt ± S.D. Røde prikker viser probe sett bedømt som "Presence", og gule prikkene representerer probe sett bedømt som "Absence" i begge rekker. Blå prikker viser probe sett bedømt som "Presence" bare i enten array. De samme, to-fold induksjon og undertrykkelse tersklene er angitt som diagonale linjer.
Genuttrykk profiler av submucosal og slimhinne MCs fra magen
å visualisere to typer MCs i magen uten å forårsake RNA degradering, seksjonene var festes med Carnoy er fiksativ og metachromatically farget med toluidin blå i noen sekunder. SMCS og MMCs ble microdissected bruker plaster pipette (figur 2a og 2b). Vi forberedte tre sett med 15 MCs for hver region, hentet sin RNA og individuelt forsterket dem (SMC 1, SMC 2, SMC 3, og MMC 1, MMC 2, MMC 3). For å forbedre utvinningen av utvinning av så lite som 30 pg RNA, vi brukt 'poly G' som en bærer som ikke interfererer med følgende RNA-amplifikasjon eller hybridisering av det amplifiserte produkt til matrisen (data ikke vist). For å undersøke effekten av uspesifikt forsterkede artefakt produkter, vi utførte RNA ekstraksjon /forsterkning prosedyren uten å legge microdissected celler ( "nei celle") som en negativ kontroll (beskrevet i "Materialer og metoder
"). De forsterkede RNA av SMCS, MMCs og "ingen celle" kontroll ble separat hybridisert til en muse microarray. Signalverdiene i de "ingen celle" sample var lav generelt og lignende til bakgrunnsnivåer (figur 2c). De spredningsplott av prøvene uavhengig utarbeidet innenfor samme gruppe (f.eks SMC 1 vs SMC 2) viste en lignende uttrykk mønster; gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient for alle probe-sett var henholdsvis 0,945 ± 0,004 og 0,893 ± 0,019 i SMCS og MMCs, (n
= 3). I motsetning til dette var den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisienten mellom SMCS og MMCer var 0,752 ± 0,034 (n =
3), som var mye lavere enn de i den samme gruppen, noe som tyder på at deres genuttrykksmønster er forskjellige.
Vi evaluerte ytterligere nøyaktighet og reproduserbarhet av vår metode av andre omfattende analyser (hierarkisk clustering analyse og prinsipal komponent analyse [PCA]) ved hjelp av alle probe sett. Microarray data fra SMCS, MMCs, hud-avledet MCs, peritoneal MCs, BMMCs og ikke-MCs (makrofager og fibroblaster) ble brukt på disse analysene. Vi først sjekket hvorvidt amplifikasjonsprosessen i vår metode påvirker den globale ekspresjonsprofilen på grunn av ikke-lineær forsterkning. Resultatene fra BMMC eksempler ved å bruke RNA fremstilt ved standard protokoll (BMMC-std) eller amplifikasjonsmetoden (BMMC-amp) ble underkastet disse analysene. Både hierarkisk clustering analyse og PCA avslørte at microarray data fra BMMC-std og BMMC-amp ble gruppert i samme gruppe (Figur 3a og 3b), noe som tyder på at den globale likhet i genuttrykk profiler opprettholdes under forsterkning prosessen. Vi neste undersøkte likheten av uttrykk mønstre i tre uavhengige SMC eller MMC-prøver. Ved gruppering analyse og PCA, SMC 1-3 og MMC 1-3 ble gruppert i samme gruppe, henholdsvis. PCA viste også at uttrykket profiler av SMC, MMCs og BMMCs er innbyrdes forskjellige (figur 3b). Figur 3 Global genuttrykk analyse av SMC 1-3 og MMC 1-3. (A) Hierarkisk gruppering av global genekspresjon av ulike preparater av MCs og ikke-MCs. Tre-runde forsterkede produkter av sMC1-3, mMC1-3, hud MCS og BMMCs, og de vanlige produktene av BMMCs, ble peritoneal MCS, makrofager og fibroblaster analysert. (B) Den viktigste komponentanalyse (PCA) avslører ulike genuttrykk profiler av sMC1-3, mMC1-3, og to preparater av BMMCs. Den blå stiplede firkanten indikerer MMCs, indikerer den røde stiplede firkanten SMCS, og den svarte stiplede firkanten indikerer BMMCs.
Vi deretter sammenlignet mage-avledet MCs (SMCS og MMCS) med hud-avledet MCs, peritoneal MCs, BMMCs og ikke -MCs (makrofager og fibroblaster) ved clustering analyse. Vev-avledet MCs (mage MCS og huden MCS) ble gruppert separat fra peritoneal MC og BMMCs. Disse resultatene kan gjenspeile ulike egenskaper mellom vev-avledet MCs med firmaet vedheft til nabocellene og flytende MCs uten et tett kontakt. Når det gjelder likheten av MCs med fibroblaster og makrofager, er det rimelig at fibroblaster er mest fjernt fra MCs og makrofager er nærmere MCs som en leukocytt familie.
Validering av microarray resultatene etter real time RT-PCR-analyse
Vi neste undersøkt om hybridisering signaler om kjente markørgener som er spesifikke for SMCS og MMCs viste de forventede uttrykk trender [12, 14]. MMC-spesifikke gener, mastcelle protease 1 (Mcpt1
) og 2 (Mcpt2
) viste høyere verdier i MMCs, mens SMC-spesifikke markørgener, mastcelle protease 4 (Mcpt4
) og chymase 2 (Cma2
), viste høyere signalverdiene i SMCS (tabell 1 og figur 4a) [15-29]. På den annen side, MC-felles markører som kit onkogen (Kit
) og Fcε reseptor (Fcer1a
) viste signifikante signalverdier uten noen skjevhet mellom MMC-enheter og SMC. For ytterligere å evaluere resultatene, vi målte uttrykket nivåer av disse markørgener ved real-time RT-PCR ved hjelp av RNA fra uavhengig isolerte MCs (figur 4b). Videre vi tilfeldig valgt tre gener som viser 'MMC-partisk' uttrykk og ytterligere tre gener som viser 'SMC-partisk' uttrykk; uttrykket av disse genene i MCs har ikke blitt rapportert tidligere (figur 4a). Det var ingen signifikante forskjeller i uttrykket nivåer av Kit Hotell og Fcer1a
mellom MMC-enheter og SMCS. I kontrast, MMC-spesifikke markører Mcpt1 Kjøpe og Mcpt2 Kjøpe og de "MMC-partisk 'gener, Anxa10, Ctse
, og Fos
viste høyere uttrykk i MMCs, og SMC-spesifikke markører Mcpt4 Hotell og Cma2
og 'SMC-partisk' gener, Cnn1, Ces3
, og Cpe
viste høyere uttrykk i SMCS. Disse resultatene indikerer at microarray resultatene er pålitelige og reflektere genekspresjonsprofiler fra intakte SMCS og MMCen i magen. Figur 4 Validering av forskjellig uttrykt gener mellom SMCS og MMC-enheter. (A) SMC-spesifikke (Cma2
, Mcpt4
), MMC-spesifikke (Mcpt1
, Mcpt2
) og MC-vanlige markører (Fcer1a Kjøpe og Kit
) (venstre panel
) og seks tilfeldig utvalgte gener (Ces3
, Cnn1
CPE
, Anxa10
, Ctse Hotell og Fos
) (høyre panel
) er angitt i representative scatter sammenheng grafer mellom sMC1 og mMC1. De samme, to-fold induksjon og undertrykkelse tersklene er angitt som en gul, blå og rød linje, henholdsvis. (B) uttrykket nivåer av genene i (a) ble verifisert ved sanntids RT-PCR. Verdiene representerer forholdet mellom relative ekspresjonsnivåer av MMCer til SMC, og er vist som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). Spesifisiteten til PCR-produktet ble bekreftet ved gelelektroforese og analyse av smeltetemperaturen. Uttrykket nivået av hvert gen ble normalisert til 28S ribosomalt RNA.
Tabell 1 Oppsummering av gener undersøkt ved real-time PCR-analyse.
Gene Symbol
Gene Navn
RefSeq transkripsjon ID
Reference
Kit
kit onkogen
NM_021099
15
Fcer1a
Fc fragment av IgE, høy affinitet jeg, reseptor for α polypeptid
NM_010184
16
Mcpt1
mastcelle protease en
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mastcelle protease 2
NM_008571
19
Mcpt4
mastcelle protease 4
NM_010779
2, 20
Cma2
chymase 2, mast celle (mastcelle protease 10)
NM_001024714
14 *
Anxa10
annexin A10
NM_011922
21
Ctse
cathepsin E
NM_007799
22
Fos
FBj osteosarkom onkogen
NM_010234
23
Ptgr1
prostaglandin reduktase 1 (leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (svin)
Cnn1
calponin en
NM_009922
25
Ces3
karboksylesterase 3
NM_053200
26
Cpe
karboksypepti E
NM_013494
27 (storfe)
Notch4
Notch genet homolog 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S ribosomalt RNA
NR_003279
29 product: * The kodende sekvensen presenteres i denne artikkelen er den N-terminale avkortet form av Cma2
, mens RefSeq " NM_001024714 "er den komplette sekvens av Cma2
.
Clustering analyse av genuttrykk profiler og funksjonell kategorisering mellom SMCS og MMCs
av ~ 12.000 gener er representert i oligonukleotid array, valgte vi 1,272 gener hvis uttrykk nivåer mellom SMC 1-3 og MMC 1-3 var signifikant forskjellig (p
< 0,05, Limma t
test). Uttrykket nivået av hvert gen ble normalisert ved nivået i BMMCs, som er dyrket MCs med såkalte "umodne" egenskaper, og de utvalgte gener ble klassifisert i syv klynger med k
en anordning clustering algoritmen (CL1-7 Figur 5a og tilleggsfiler 1). Vi har også klassifisert genene inn i undermenyer, og de representative genene er oppført (figur 5b). Blant dem, 666 gener (52,4%) viste SMC-partisk uttrykk (CL1-3
); i 78% (519 gener) av SMC-rik gener, uttrykket nivåer var relativt lav i BMMCs og utvidet i SMC (CL1 & 2
). For eksempel, ekspresjonsnivået av Mcpt4
var relativt lav i BMMCs, og hvis ekspresjonsprofilen av BMMCs reflekterer umodne egenskapene til MC stamceller, kan Mcpt4
konkluderes å bli indusert i løpet av den endelige modning i SMC. Interessant, SMC markørgener Mcpt5 Hotell og Mcpt6
ble klassifisert i CL2 /3
, noe som tyder på at disse genene ble uttrykt i noen grad "umoden" BMMCs, men deres uttrykk ble undertrykt under modning i MMC-enheter. På den annen side, 606 gener (47,6%) viste MMC-forspent uttrykket (CL4-7
); i 51% (334 gener) av MMC-rik gener, deres uttrykk nivåer i BMMCs var lav, men ble utvidet i MMCs (CL4 og & 5
). For eksempel uttrykk for Mcpt1
var lav i "umoden" BMMCs men ble drastisk indusert under modning i MMC-enheter. Figur 5 Clustering analyse av genuttrykk profiler mellom SMCS og MMC-enheter. (A) Representasjon av mRNA uttrykk nivåer av sMC1-3 og mMC1-3 sammenlignet med BMMCs. Fargen på stolpene representerer forholdet mellom signalintensitet mellom uavhengige utvalg og BMMCs, i henhold til skalaen som vises øverst til høyre
. Gener med vesentlig forskjellig uttrykk mellom SMCS og MMCs (p
< 0,05, Limma t
test) ble valgt (1,272 gener) og klassifiseres inn i 7 grupper som bruker k
en anordning algoritme (CL1-7
). (B) Funksjonell kategorisering av representative gener fra (a).
Protein uttrykk for Notch4 i SMCS og Ptgr1 i MMCs i magen vev
Blant de genene som viser differensial uttrykk (figur 5b), vi videre fokusert på uttrykk for Notch4
i SMCS og Ptgr1
i MMCs, som begge har aldri tidligere blitt karakterisert MCs. Den Notch4
genproduktet er et medlem av Notch-familien, som består av transmembrane reseptorer som blir aktivert av celleoverflate ligander på tilstøtende celler. Nylige studier har antydet at Notch signalering er involvert i lymfocytt og mastcelledifferensiering [30, 31]. Vi først bekreftet at Notch4
uttrykket er betydelig høyere i separat sammenslåtte SMCS enn MMCs ved real-time RT-PCR (data ikke vist). Vi neste undersøkt om Notch4 protein er utelukkende til stede i SMCS ved farging av magen vev (figur 6a). Notch4 signaler ble påvist i kjernen lignende strukturer av SMCS men ikke i de av MMC-enheter. Videre Notch4 signaler ble også funnet i huden MCs, som ble adjacently gruppert med SMCS (figur 3a). Disse resultater viser at Notch4 er til stede i SMC, men ikke i MMCen, og tyder på at Notch4 deltar i SMC-spesifikk transkripsjon av Notch-målgener, noe som kan være nødvendig for enkelte SMC funksjoner. I hematopoetiske celler er det blitt rapportert at konstitutivt aktiv Notch4 fremmer ekspansjon av stamceller og hemmer myeloid differensiering [32]. Siden Notch ligander er blitt vist å eksistere i bindevev som hud dermis [33], vil det være interessant å undersøke hvorvidt Notch4 spiller en rolle i differensieringen av SMC og vedlikehold av SMC funksjoner. Figur 6 Immunhistokjemisk analyse av Notch4 og Ptgr1 i SMCS og MMCs i magen vev. (A) Magen submucosa (SMCS; venstre paneler
), mageslimhinnen (MMCs; middel paneler
) og huden (hud MCs, høyre panel
) snitt ble farget med et anti-Notch4 antistoff (nedre paneler
) og med toluidinblått (øverste panelene
). SMCS farget med anti-Notch4 antistoff i mage submucosa og hud dermis er indikert med piler. Ingen farging ble observert i MMCs (pilspisser
) lokalisert i mageslimhinnen. SMCS og MMCs ble metachromatically farget med toluidin blå. (B) Magen submucosa (SMCS; venstre paneler
) og mageslimhinnen (MMCs, høyre panel
) snitt ble farget med et anti-Ptgr1 antistoff (nedre paneler
) og med toluidinblått (øverste panelene
). Ingen farging med anti-Ptgr1 antistoff ble funnet i SMC (pil
). Små signaler ble observert i MMCs (pilspisser
). SMCS og MMCs ble metachromatically farget med toluidin blå. Barer
, 25 um (a, b).
Ptgr1
produkt, 15-oxo-prostaglandin 13-reduktase /leukotrien (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase er et essensielt enzym for inaktive av eikosanoider som prostaglandin E 2 (PGE 2) og LTB 4 [34]. Selv om det har blitt rapportert at de samme veiene som eicosanoid syntese varierer blant de ulike MC klasser [1, 4], våre resultater tyder på at inaktivering system av eikosanoider varierer også blant MC subklasser. Ptgr1
uttrykk ble funnet å være betydelig høyere i de separat sammenslåtte MMCs ved real-time RT-PCR (data ikke vist). Vi har også undersøkt Ptgr1 uttrykk i magen deler av immunfarging. Signaler for Ptgr1 proteinet ble funnet i granule-lignende strukturer av MMCs i mageslimhinnene, men ikke i SMC (figur 6b), noe som tyder på at den Ptgr1 enzymet kan frigjøres fra MMCer ved degranulering. Siden PGE 2 spiller viktige roller i vedlikehold av tarmen homeostase gjennom slimhinnene beskyttelse og syresekresjonshemming, er det mulig at når aktivert, MMCs negativt regulere cellebeskyttende handlingene til PGE 2 gjennom raske inaktivering av Ptgr1.
genuttrykksmønstrene av ekstracellulære matrix komponenter, adhesjonsmolekyler og cytoskeletal proteiner i SMCS og MMCs
MC fenotyper har vist seg å være avhengig av deres samhandling med de omkringliggende ekstracellulære matriser (ECM) og nabocellene [1]. En av de mest bemerkelsesverdige funn i denne studien er forskjellen i gen-ekspresjon av ECM proteinkomponenter, adhesjonsmolekyler, og cytoskeletal proteiner, noe som kan gjenspeile funksjonelle tilpasning av hver type MC til den mukosale eller submucosal miljø i magesekken (figur 5b) . MMCs uttrykke gener for slimhinner spesifikke ECM proteiner som Muc1 plakater (mucin) og Tff1 plakater (Trefoil faktor), mens SMCS uttrykke gener for konvensjonelle ECM proteiner som Col4a plakater (prokollagen) og Lama2
(laminin). Videre SMCS uttrykke gener for adhesjonsmolekyler som Alcam Hotell og Vcam1
, og gener for vanlige cytoskeletal proteiner som Acta2 plakater (aktin), mens MMCs uttrykke desmosom-komponent gener som dsc2
( desmocollin) og Dsg2 plakater (desmoglein), og gener for keratin intermediate filamenter som Krt8 Hotell og Krt19
. Desmosomer ble rapportert til å være til stede i magen epitel [35], og det ble funnet at desmosom-lignende strukturer blir detektert i en bestemt type MC [36]. Det er således mulig at MMCer kommuniserer med tilstøtende epitel gjennom desmosomal adhesjon i magen. I kontrast SMCS ser ut til å samhandle med naboceller via adhesjonsmolekyler som VCAM-1, Alcam og VE-cadherin (Vcam1
, Alcam1 Hotell og Cdh5
). Siden disse adhesjonsmolekyler er blitt vist å være involvert i dynamisk regulering av aktin cytoskjelettet [37, 38], kan slike molekyl-formidlede interaksjoner med submukosale celler være kritisk for å opprettholde de funksjonelle og morfologiske egenskaper av SMC. Faktisk bør det bemerkes at de fleste SMCS er variabel i form, og er ofte strekkes og svingete sammenlignet med MMCer [1].
Konklusjon
Vi har etablert en fremgangsmåte for RNA-amplifikasjon fra sammenslåtte intakte MC isolert fra frosset vev seksjoner, noe som gjør oss i stand til å enkelt få tak i den globale genuttrykk mønster av MCs fra ulike vev, organer, og arter, inkludert mennesker. Ved å bruke denne metoden, vi demonstrert for første gang den distinkte genuttrykk profiler av submucosal og slimhinne MCs i musen magen. . Våre funn tilby innsikt i mulige uidentifiserte egenskaper spesifikke for hver MC underklasse
Metoder
Materialer
Følgende materialer ble hentet fra kildene angitt: HPLC renset T7- (dT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] fra GE Healthcare UK Ltd (Buckinghamshire, England), RNase-fritt vann, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli product: (E. coli
) RNase H, E . coli
DNA-polymerase I, E. coli
DNA-ligase, T4 DNA-polymerase og tilfeldige heksamerer fra Invitrogen (San Diego, CA), RNase-inhibitor, glykogen, og MEGAscript T7 kit fra Ambion (Austin, TX). Balb /c-mus ble oppnådd fra JapanClea (Hamamatsu, Japan). Denne studien ble godkjent av komiteen for forsøksdyr av Kyoto Universitetet Graduate School of Pharmaceutical Sciences.
RNA forsterkning og oligonukleotid microarray
Muse BMMCs interleukin-3-avhengige ble fremstilt som beskrevet tidligere [39]. Total RNA av BMMCs ble hentet ved hjelp RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA).
Munnvann påvirker effekten av trening
Forskere har lenge visst at blodtrykket synker etter trening, men mekanismen er ikke helt klarlagt. En ny studie viser at bakterier i munnen, som produserer nitritt, er nøkkelen til hele prosessen. Br
Hydrogenpust er ikke fra bikinitoll
I disse dager med all dum snakk om atomkrig, når du ser ordet hydrogen, kan du umiddelbart tenke på den stakkars lille øya i Stillehavet, Bikini Atoll, der de testet alle disse atombombene, inkludert
Forskere manipulerer bakteriearter i tarmen ved å bruke diett
Forskere fra Stanford University School of Medicine har vist at ved å manipulere kosthold i en musemodell, det er mulig å favorisere engraftment av en bestemt bakteriestamme fremfor andre.
