Caracterização da expressão do gene perfis para diferentes tipos de mastócitos agrupados de sub-regiões do estômago de rato por um método de amplificação de ARN

A caracterização dos perfis de expressão gênica para diferentes tipos de mastócitos agrupados de sub-regiões do estômago do rato por um método de amplificação de ARN da arte abstracta
Fundo
Os mastócitos (MCs) desempenham papéis fundamentais em alergia e imunidade inata e consistem em subclasses heterogéneas . No entanto, a base molecular que determina as diferentes características destes vários subclasses MC permanece obscuro.
Resultados
Para abordar esta questão, foi desenvolvido um método de extração de RNA /amplificação para intacto in vivo
MCs reunidos a partir de cortes de tecidos congelados , o que nos permitiu obter o padrão de expressão gênica global de MCs agrupados pertencentes à mesma subclasse. MCs foram isolados a partir da submucosa (SMCs) e mucosas (MMCs) de secções de estômago de rato, respectivamente, 15 as células foram reunidas, e o RNA foi extraído, amplificado e submetido a análise de micro-arranjo. genes marcadores conhecidos específicas para MMCs e PMEs mostraram tendências esperadas de expressão, indicando precisão da análise.
Foram identificados 1.272 genes que mostram significativamente diferentes níveis de expressão entre PMEs e MMCS, e classificou-os em grupos com base na similaridade de seus perfis de expressão em comparação com o MCS derivadas de medula óssea, que são os MCs cultivadas com os chamados propriedades "imaturas". Entre eles, descobrimos que vários genes-chave, como Notch4
tiveram expressão SMC-tendenciosa e Ptgr1
teve expressão MMC-tendenciosa. Além disso, há uma diferença na expressão de vários genes, incluindo os componentes da matriz extracelular de proteínas, moléculas de adesão, e as proteínas do citoesqueleto entre as duas subclasses MC, o que pode reflectir a adaptação funcional de cada MC para o ambiente da mucosa ou submucosa no estômago.
Conclusão
ao utilizar o método de amplificação de ARN do MCS intactas reunidas, foram caracterizados os perfis de expressão de genes distintos de SMC e MMCs no estômago do rato. Nossos resultados oferecem uma visão sobre possíveis propriedades não identificados específicos para cada subclasse MC.
Fundo
Os mastócitos (MCs) são derivadas de células-tronco hematopoiéticas e desempenham um papel importante nas respostas alérgicas, imunidade inata e de defesa contra a infecção pelo parasita. Ao contrário de outras células sanguíneas, MCs migram para os tecidos periféricos como progenitoras imaturas e diferenciam-se em mastócitos maduros. Uma das características únicas dos MCs é que eles mostram uma variedade de fenótipos diferentes dependendo do microambiente do tecido da sua maturação [1]. Em MCs, várias proteases de serina-MC específicos são armazenados nos grânulos de secreção, e as expressões de genes e de proteínas são drasticamente alteradas quando o seu ambiente celular está alterada. Por exemplo, Reynolds et al.
Têm mostrado que, pelo menos, seis membros distintos de proteases de serina do rato MC-específicas são expressas em diferentes combinações em diferentes populações de células mastro [2]. Além disso, estudos recentes têm mostrado que MCs maduras variam em termos do que a superfície receptores e mediadores lipídicos eles expressam [3, 4]. Porque cada população de mastócitos in vivo
devem desempenhar um papel específico no corpo, é importante para determinar o caráter de cada população de MCs.
Análise de expressão gênica global é uma abordagem poderosa para entender a caracterização de vários MC subpopulações. Até à data, diversos estudos sobre a análise de micro-arranjo de MCs foram conduzidos [5-7], mas a maioria deles tratados com o MCS cultivadas in vitro
. Alternativamente, perfis de expressão gênica de MCs isoladas de pele e de pulmão foram analisados ​​[3, 8-10]. No entanto, os números de MCs analisada como uma amostra eram relativamente elevados e que foram expostos a forças físicas, as enzimas e o anticorpo anti-kit de purificação, durante os quais podem ter sido afectadas as propriedades originais do mcs.
No gastrintestinal trato, há MCs que são classificados principalmente em duas subclasses; mucosa MCs (MMC) e MCs submucosos (PMEs), com base em sua localização, morfologia (tamanho e forma) e conteúdo dos grânulos [11, 12]. MMCs são encontradas principalmente na mucosa do sistema gastrointestinal, tendo condroitina grânulos contendo sulfato, que são coradas com azul de toluidina, mas não safranina, e a sua activação ocorre durante a infecção pelo parasita [13], enquanto que as SMC são localizadas na submucosa do tracto gastrointestinal trato e seus grânulos são ricos em heparina e coradas tanto com azul de toluidina e safranina [1, 11]. No entanto, a base molecular determinar as diferenças nas propriedades bioquímicas destas duas subclasses MC permanece incerto, parcialmente devido à dificuldade do seu isolamento.
Para superar estes problemas, aqui foi estabelecido um método de amplificação de ARN do MCS intacto isolado a partir de congelado cortes de tecido, o que nos permite obter convenientemente o padrão de expressão gênica global de MCs em vários tecidos. Para validar este método, primeiro determinar o número de células mínimo necessário para atingir a amplificação RNA reprodutível. Em seguida, compararam os perfis de expressão de genes obtidos a partir de um pequeno número de MMCs e as SMC no estômago do rato, e a vários genes-chave para ser expresso especificamente em uma subclasse de MCs, o que pode reflectir alguns aspectos das propriedades distintas entre as duas subclasses MC em o trato gastrointestinal.
resultados e discussão
Desenvolvimento de um protocolo de amplificação de ARN para se obter perfis de expressão de gene a partir de uma pequena quantidade de ARN
para obter conhecimento sobre as diferenças funcionais entre os diferentes subclasses de MCs, foram empregados três rondas do método de amplificação de ARN baseado em T7. Com base nas experiências preliminares usando MCs peritoneais e MCs derivadas da medula óssea (BMMCs), estimou-se que um único MC origina 2 pg de ARN. Antes foi realizada uma análise comparativa dos MCs a partir de diferentes tecidos, que numa primeira fase, a precisão e a reprodutibilidade dos três rondas do método de amplificação de ARN baseado em T7, começando com a quantidade de RNA que pode ser obtido a partir de um único MC. Para avaliar isto, primeiro em comparação os resultados de microarray obtido a partir de 5 ug de ARN MCMO preparado pelo protocolo padrão com os obtidos a partir do mesmo RNA diluída 10 5- ou 10 6 vezes (30 pg, 10 pg e 2 pg) e submetidos a três ciclos de amplificação à base de T7 (Figura 1A-C). Embora três rondas de amplificação originou quantidade suficiente do RNA para análise de micro-arranjo (> 20 ug), mesmo no caso de duas ARN pg, análise de gráfico de dispersão revelou que as qualidades dos resultados obtidos foram muito diferentes entre as amostras a partir de 5 ug e 2 pg de ARN. Os genes julgado como 'Presença' em ambos os 30 pg e 5 ug de RNA foram 8.149 genes, o que correspondeu a 72% dos genes julgado como 'Presença' na 5 ug de RNA (11.344 genes; Figura 1A), enquanto apenas 4.116 genes foram julgados como 'Presença' em ambos 2 pg e 5 ug de ARN, o que corresponde a apenas 36% dos genes considerados como 'Presença' na 5 ug de ARN (Figura 1C). A diminuição do número de genes considerados como 'a presença nas amostras diluídas (30 pg, 10 pg e 2 pg) pode ser devido à perda de baixo número de cópias de ARN espécies número durante a amplificação. Figura 1 Comparações de três produtos amplificou-redondas começando com quantidades muito pequenas de RNA. (A-c) enviesamentos de amplificação nos produtos a partir de uma pequena quantidade de ARN. gráficos de dispersão de intensidade do sinal obtido a partir de 5 ug de CMMO RNA preparado pelo protocolo padrão e de 30 pg (a
), 10 pg (b
) e 2 pg (c
) de RNA CMMO preparado por três rodadas de amplificação são mostrados. (D, e) A reprodutibilidade da amplificação três rodada de uma pequena quantidade de ARN. gráficos de dispersão de intensidade de sinal entre dois produtos independentes de 30 pg de CMMO RNA (CMMO 30 pg-1 e CMMO 30 pg-2) (d
) ou de 2 pg de CMMO RNA (CMMO 2 pg-1 e CMMO 2 pg-2) (e
), são mostrados. pontos vermelhos mostram conjuntos de sondas julgados como "Presença", e pontos amarelos representam conjuntos de sondas julgados como "Ausência" em ambas as matrizes. Os pontos azuis mostram conjuntos de sondas julgados como "Presença" apenas em um ou outro array. Os coeficientes de correlação (r) são apresentados. Os mesmos, limiares de indução e de supressão de quatro vezes são indicados como linhas diagonais. Os genes considerados como "Presença" são colocados em grupos de pares correspondentes a sobreposições mostrado nos diagramas de Venn anexas.
A seguir examinada a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir de microarray dois conjuntos de amostras de 30 pg de ARN MCMO (30 pg-1 e 30 pg-2) ou dois conjuntos de amostras de 2 pg (2 a pG-1 e 2 pg-2) (Figura 1d e 1e). Nas amostras de ARN de 30 pg, 7537 (30 pg-1) e 8777 (30 pg-2) genes foram julgados como 'Presença'. No entanto, apenas 4324 (2 pg-1) e 4460 (2 pg-2) genes foram julgados como 'Presença' em cada amostra de RNA 2 pg, novamente sugerindo que a perda de baixo número de cópias de RNAs durante a amplificação a partir de uma pequena quantidade de ARN. Quanto à reprodutibilidade, 86% dos genes da "presença" no 30 pg-1 e 74% dos genes "presença" na pg-2 amostra de 30 foram julgados como 'Presença' em ambas as amostras de RNA de 30 pg, enquanto que apenas 57 % de genes 'presença na 2 a pG-1 e 55% de genes' presença na amostra de 2 pg-2 foram julgados como "Presença" em ambas as amostras de RNA 2 pg. Estes resultados sugeriram que os produtos amplificados a partir de ARN a partir de um único MC (cerca de 2 pg) pelo método actual pode incluir artefactos de amplificação consideráveis ​​que causam problemas na precisão e reprodutibilidade. Por outro lado, devido à reprodutibilidade mais elevada (> 74%), concluiu-se que a amplificação a partir de ARN de 30 pg recolhidas a partir de 15 MCs seria adequado para a prática da análise de tecido MCs. Com base nesses resultados, vamos definir o nosso objetivo neste estudo para adquirir perfis de expressão gênica de MCs agrupados de diferentes regiões. Para minimizar a influência de variações célula-a-célula dentro da mesma classe e de amplificação artefactos potencial, foram preparadas três conjuntos de 15 MCs para cada região e genes em comparação com a expressão significativamente diferente entre os MCs diferentes a partir de regiões (Figura 2b). Nós escolhemos o estômago como o órgão de origem, uma vez que pode isolar dois tipos de MCs da submucosa regiões (SMC) das mesmas seções mucosa (MMC) e, e MMCs e PMEs têm sido suspeito de ser diferente em várias propriedades MC como protease perfil de expressão e sensibilidade da coloração safranina [1, 11]. Figura 2 perfis de expressão gênica de PMEs e MMCS de tecido do estômago. (A) Isolamento de toluidina MCs azul-manchado na submucosa (SMC; painéis superiores
) e da mucosa (MMC; painéis inferiores
) de secções de estômago. A SMC (seta
) e MMC (ponta de seta
) que foi metachromatically corados com azul de toluidina antes microdissection (painéis esquerdos
) desapareceu após microdissecção com uma pipeta patch (painéis da direita
). Barras
, 10 uM. (B) Esboço da estratégia experimental. (C) marcado e RNAs antisense fragmentadas de três amostras SMC individuais, três amostras MMC individuais e as amostras dos nenhuma célula 'foram hibridadas com uma matriz de murino. gráficos de dispersão para 'nenhuma célula' (eixo x) e SMC1 (eixo y) (superior
esquerda), "nenhuma célula '(eixo x) e MMC1 (eixo y) (inferior
esquerda), SMC1 (x eixo) e SMC2 (eixo y) (centro superior
), MMC1 (eixo x) e MMC2 (eixo y) (centro inferior
), SMC1 (eixo x) e MMC1 (eixo y) (superior direito
) são mostrados. Os coeficientes de correlação (r) para comparação dentro sMC1-3, dentro mMC1-3 e entre PMEs e MMCs são apresentados como médias ± S.D. pontos vermelhos mostram conjuntos de sondas julgados como "Presença", e pontos amarelos representam conjuntos de sondas julgados como "Ausência" em ambas as matrizes. Os pontos azuis mostram conjuntos de sondas julgados como "Presença" apenas em um ou outro array. As mesmas, limiares de indução e de supressão de duas vezes são indicados como linhas diagonais.
Perfis de submucosa e MCs mucosas do estômago
expressão génica Para visualizar dois tipos de MCs no estômago sem causar degradação de ARN, as secções foram fixadas com fixador de Carnoy e metachromatically corados com azul de toluidina por alguns segundos. SMCs e MMCs foram microdissecadas usando uma pipeta patch (figura 2a e 2b). Nós preparados três conjuntos de 15 MCs para cada região, extraída seu RNA e amplificados-los individualmente (SMC 1, SMC 2, SMC 3, e MMC 1, MMC 2, MMC 3). Para melhorar a recuperação da extracção de tão pouco como 30 pg de RNA, utilizou-se 'poli G' como um veículo, o qual não interfere com a sequência de amplificação de ARN ou a hibridação do produto amplificado para a matriz (dados não mostrados). Para examinar os efeitos dos produtos amplificados de forma não específica artefato, foi realizado o procedimento de extracção de ARN /amplificação sem a adição de células microdissecadas ( "nenhuma célula") como um controlo negativo (descrito em "Materiais e métodos
"). Os ARNs amplificados de SMCs, MMCs e o controlo de "nenhuma célula" foram hibridadas separadamente para uma micromatriz de murino. Os valores de sinal na amostra "nenhuma célula" eram baixos e, em geral, semelhante aos níveis de fundo (Figura 2C). Os gráficos de dispersão das amostras preparadas de forma independente dentro do mesmo grupo (por exemplo SMC 1 vs SMC 2) mostrou um padrão de expressão similar; o coeficiente de correlação média para todas as sondas-sets foi 0,945 ± 0,004 e 0,893 ± 0,019 em SMC e MMCS, respectivamente (n
= 3). Em contraste, o coeficiente de correlação médio entre as SMC e MMCs era 0,752 ± 0,034 (n = 3
), que foi muito mais baixa do que aqueles dentro do mesmo grupo, o que sugere que os seus padrões de expressão de genes são diferentes.
Ainda avaliada a precisão e reprodutibilidade do nosso método por outras análises abrangentes (análise de agrupamento hierárquico e análise de componentes principais [PCA]), utilizando todos os conjuntos de sonda. dados de microarranjos obtidos a partir de PMEs, MMCS, MCs derivadas de pele, MCs peritoneal, BMMCs e não MCs (macrófagos e fibroblastos) foram aplicadas a estas análises. O primeiro verificado se o processo de amplificação no nosso método afecta o perfil de expressão global devido a uma amplificação não linear. Os resultados das amostras de BMMC utilizando ARN preparado pelo protocolo padrão (MCMO-STD) ou o método de amplificação (MCMO-AMP) foram submetidas a estas análises. Tanto a análise de agrupamento hierárquico e PCA revelou que os dados de microarray de MCMO-STD e MCMO-amp foram agrupadas no mesmo grupo (Figura 3a e 3b), sugerindo que a semelhança global em perfis de expressão de gene é mantida durante o processo de amplificação. A seguir, examinou a semelhança dos padrões de expressão em três amostras SMC ou MMC independentes. Após a análise de agrupamento e PCA, SMC 1-3 e MMC 1-3 foram agrupados no mesmo grupo, respectivamente. APC também mostraram que os perfis de expressão SMCs, MMCs e BMMCs são mutuamente diferente (Figura 3b). Figura análise de expressão gênica global 3 da SMC 1-3 e MMC 1-3. (A) de agrupamento hierárquico de expressão gênica global de várias preparações de MCs e não MCs. Três-round produtos amplificados de sMC1-3, mMC1-3, pele MCs e BMMCs, e os produtos padrão de BMMCs, foram analisados ​​MCs peritoneal, macrófagos e fibroblastos. (B) A análise de componentes principais (PCA) revela diferentes perfis de expressão gênica de sMC1-3, mMC1-3, e duas preparações de BMMCs. A praça pontilhada azul indica MMCS, a praça pontilhada vermelha indica PMEs, ea praça preta pontilhada indica BMMCs.
Em seguida, compararam os MCs derivado do estômago (PMEs e MMCs) com MCs derivadas de pele, MCs peritoneal, BMMCs e não -MCs (macrófagos e fibroblastos) por agrupamento análise. Os MCs derivadas de tecido (estômago MCs e pele MCs) foram agrupadas separadamente dos MCs peritoneal e BMMCs. Esses resultados podem refletir diferentes propriedades entre MCs derivadas de tecido com adesão firme para as células vizinhas e MCs flutuantes sem um contacto apertado. Quanto à semelhança dos MCs com fibroblastos e macrófagos, é razoável que os fibroblastos são mais distantes de MCs e os macrófagos são mais perto de MCs como uma família de leucócitos.
Validação dos resultados de microarranjos por análise em tempo real RT-PCR
próxima investigou se os sinais de hibridação de genes marcadores conhecidos específicos para PMEs e MMCS mostrou as tendências expressão esperada [12, 14]. Os genes específicos do MMC, protease de mastócitos 1 (Mcpt1
) e 2 (Mcpt2
) apresentaram valores mais elevados em MMCs, enquanto a genes marcadores SMC-específicas, protease de mastócitos 4 (Mcpt4
) e quimase 2 (Cma2
), mostraram valores de sinal mais elevadas em SMC (Tabela 1 e Figura 4a) [15-29]. Por outro lado, os marcadores de MC-comuns, tais como oncogene kit (Kit
) e do receptor Fc ^ (Fcer1a
) mostrou valores de sinal significativas com nenhuma polarização entre MMCs e CML. Para avaliar ainda mais os resultados, foram medidos os níveis de expressão destes genes marcadores de tempo real de RT-PCR utilizando ARN a partir dos MCs independentemente isolados (Figura 4b). Além disso, foram selecionados aleatoriamente três genes que mostram a expressão 'tendenciosa-MMC "e outros três genes que mostram' SMC-tendenciosa 'expressão; expressão destes genes em MCs não foi reportado anteriormente (Figura 4a). Não houve diferenças significativas nos níveis de Kit Comprar e Fcer1a
entre MMCS e PMEs de expressão. Em contraste, os marcadores específicos do MMC Mcpt1 Comprar e Mcpt2 Comprar e dos tendenciosa-MMC "genes, Anxa10, CTCE
e Fos
mostrou maior expressão em MMCs, eo específico do SMC marcadores Mcpt4 Comprar e Cma2
e os genes "SMC-tendenciosas ', cnn1, Ces3
, e CPE
apresentaram maior expressão em SMC. Estes resultados indicam que os resultados de microarray são fiáveis ​​e refletir os perfis de SMCs intactas e MMCs no estômago de expressão de genes. Figura 4 Validação dos genes diferencialmente expressos entre PMEs e MMCS. marcadores (a) específicos do SMC (Cma2
, Mcpt4
), específico do MMC (Mcpt1
, Mcpt2
) e MC-comuns (Fcer1a Comprar e Kit
) (esquerda painel
) e seis genes selecionados aleatoriamente (Ces3
, cnn1
, CPE
, Anxa10
, CTCE Comprar e Fos
) (painel direito
) são indicados na correlação de dispersão representante gráficos entre SMC1 e MMC1. Os mesmos, limiares de indução e de supressão de duplas são indicadas como uma linha amarela, azul e vermelho, respectivamente. (B) Os níveis dos genes em (a) foram verificadas por em tempo real de RT-PCR de expressão. Os valores representam a relação entre os níveis de expressão relativos de MMCs para SMCs, e estão apresentados como média ± S.D. (N = 3). A especificidade do produto de PCR foi confirmada por electroforese em gel e análise da temperatura de fusão. O nível de cada gene expressão foi normalizada para 28S RNA ribossomal.
Tabela 1 Resumo dos genes analisados ​​por análise de PCR em tempo real.
Gene Símbolo

Gene Nome
RefSeq Transcrição ID
Referência
kit
kit oncogene
NM_021099
15
Fcer1a
fragmento
Fc de IgE, de alta afinidade I, receptor de polipeptídeo α
NM_010184
16
Mcpt1
mastro protease celular 1

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