Karakterizacija genske ekspresije profilov za različne vrste mastocitov zbranih z miško na želodcu podobmočij, ki RNA ojačanje method

karakterizacija genske ekspresije profilov za različne vrste mastocitov zbranih z miško na želodcu podobmočij z metodo RNA ojačanja
Abstract
Ozadje za
mastociti MCS () Play osrednjo vlogo pri alergiji in naravne imunosti in so sestavljeni iz heterogenih podrazrede. Vendar pa molekularne osnove določanja različne značilnosti teh različnih podrazredov MC ostaja nejasna.
Rezultati
Za ta pristop smo razvili metodo za ekstrakcijo RNA /ojačanje za neokrnjeno in vivo
DZU združenih iz zaledenelih rezinah tkiva , kar nam je omogočilo pridobitev globalne izražanje genov vzorec zbranih DZU, ki pripadajo isti podrazred. MC smo izolirali iz submucosa (SMC) in sluznici (MMC) odsekov miš želodca, v tem zaporedju, je bilo zbranih 15 celice in njihove RNA smo ekstrahirali, pomnožili in podvržemo analize mikromrež. Znane marker geni, specifični za MMC in SMC pokazala pričakovano izražanja trende, kar kaže natančnost analize.
Identificirali smo 1.272 genov, ki kažejo precej različne ravni izražanja med SMC in MMC, in jih razvrstili v skupine na podlagi podobnosti njihovih izraznih profilov v primerjavi z DZU mozga izvira iz kosti, ki so kultivirani MC s tako imenovanimi "nezrele" lastnosti. Med njimi smo ugotovili, da nekaj ključnih genov kot Notch4
imeli SMC-pristranski izražanja in Ptgr1
imeli MMC-pristranski izraz. Poleg tega je razlika v izražanju številnih genov, vključno zunajcelični matriks proteinskih komponent, adhezijskih molekul in citoskeletne proteine ​​med obema MC podrazredov, ki se lahko izražajo funkcionalen prilagajanje vsake MC na sluznico ali Submukozno okolja v želodcu.
Zaključek
z uporabo metode RNA pomnoževanju pred združenih intaktnih MCs smo označen s tem tudi različne genske ekspresije profile SMC in MMC v želodcu miško. Naše ugotovitve nudijo vpogled v možne neznanih lastnosti specifičnih za vsako MC podrazred.
Ozadje
mastocitov (MCS) so pridobljeni iz hemopoetičnih matičnih celic in igra pomembno vlogo pri alergijskih odzivov, naravne imunosti in obrambe pred okužbo parazitov. Za razliko od drugih krvnih celic, MC selijo v perifernih tkivih kot nezrelih prednikov in diferencirajo v zrele mastocitov. Ena od edinstvenih značilnosti MCs je, da kažejo različne fenotipe odvisno od različnih tkiv mikrookolju njihovega zorenja [1]. V MCs so različni MC-specifične serinske proteaze shranjeni v sekretorne granule in njihovi genski in proteinski izrazi se drastično spremenijo, ko se spremenijo njihova celica okolje. Na primer, Reynolds s sod.
So pokazale, da so vsaj šest ločenih članov miš MC-specifičnih serinskih proteaz, izražena v različnih kombinacijah v različnih populacijah mastocitov [2]. Poleg tega so nedavne študije pokazale, da je zrel MC razlikujejo glede na to, kaj površinske receptorje in lipidnih mediatorjev izražajo [3, 4]. Ker ima vsaka mast celična populacija in vivo
mora imeti posebno vlogo v telesu, je pomembno, da se ugotovi značaj vsakega prebivalstva DZU.
Celovito analizo izražanja genov, je močan pristop razumeti opredelitev različnih MC Podskupine. Do sedaj so bile izvedene številne študije o analizi mikromrež za DZU [7/5], vendar je večina od njih obravnava DZU kultivirani in vitro
. Druga možnost je, gen izražanje profilov DZU izoliranih iz kože in pljuč so bili analizirani [3, 8-10]. Vendar pa je število DZU analizirali, kot je bilo en vzorec relativno visoka in so bili izpostavljeni fizične sile, encimov in protiteles anti-Kit za čiščenje, v katerem so vplivale prvotne lastnosti DZU.
V prebavilih trakta, obstajajo MC, da se v glavnem razporejene v dva podrazreda; sluznice MC (MMC) in Submukozno MC (SMC) na podlagi njihove lokacije, morfologijo (velikost in oblika) in zrnc vsebine [11, 12]. MMC so v glavnem nahajajo v sluznici prebavnega sistema, ki ima hondroitin granule, ki vsebuje sulfat, ki se obarvajo s toluidin modro, vendar ne safranina in njihovo aktiviranje pojavi med infekcijo parazitsko [13], pri čemer so SMC lokalizirana v submucosa na prebavilih prebavil in njihove zrnca so bogata z heparin in obarvajo z obema toluidinska modro in safraninom [1, 11]. Vendar pa molekularne osnove ugotavljanje razlike v biokemičnih lastnosti teh dveh MC podrazreda ostaja negotova, delno zaradi težav pri izolaciji.
Za odpravo teh težav, tukaj smo vzpostavili metodo RNA ojačanje od nedotaknjeno DZU izoliran od zamrznjeni odseki tkiva, ki nam omogoča, da enostavno dobiti globalno izražanje genov vzorec DZU v različnih tkivih. Za potrditev te metode smo najprej določili minimalno število celic, ki je potrebna za doseganje ponovljivega RNA ojačanja. Nato smo primerjali izražanje genov profilov, pridobljenih iz majhnega števila MMC in SMC v želodcu miške, in ugotovila nekaj ključnih genov, ki jih je treba posebej izražena v eni podvrsti DZU, ki se lahko odraža nekatere vidike različnih lastnosti med obema MC podrazrede v prebavnem traktu.
Rezultati in razprava
razvoj RNA ojačanja je protokol za pridobitev gen profile izražanja iz majhne količine RNA
da bi pridobili vpogled v funkcionalne razlike med različnimi podrazredov DZU, smo uporabili tri krogov metode RNA pomnoževanja, ki temelji T7. Na podlagi predhodnih poskusih, ki uporabljajo peritonealno MCS in MCS izvirajo iz kostnega mozga (BMMCs), smo ocenili, da en sam MC dobimo 2 str RNA. Preden smo izvedli primerjalno analizo DZU iz različnih tkiv, smo najprej ocenili natančnost in ponovljivost treh krogih metode RNA pomnoževanja, ki temelji na T7, začenši s količino RNA, ki jih je mogoče dobiti iz enega MC. Za to oceno, smo najprej primerjali rezultate mikromrež pridobljeni iz 5 ig BMMC RNA s standardnim protokolom pripravljene z rezultati iz istega RNA razredčenega 10 5- ali 10 6-kratno (30 pg, 10 str in 2 pg) in podvržemo treh krogih pomnoževanja temelji T7 (Slika 1a-c). Čeprav treh krogih pomnoževanja smo dobili zadostne količine RNA za analizo mikromrež (> 20 mikrogramov), tudi v primeru 2 pg RNA, analiza graf raztrosa je pokazala, da so bile lastnosti dobljenih rezultatov precej razlikujejo vzorcih 5 ug in 2 pg RNA. Geni selekcionirani "prisotnosti" v obeh 30 pg in 5 mikrogramov RNA je bila 8,149 geni, kar ustreza 72% genov, ki se zdijo kot "prisotnosti" v 5 ug RNA (11,344 geni; slika 1a), medtem ko je samo 4116 genov so bili ocenjeni kot "prisotnosti" v obeh 2 pg in 5 mikrogramov RNA, kar je ustrezalo le 36% genov, ki se zdijo kot "Prisotnost" v 5 mikrogramov RNA (slika 1c). Zmanjšanje števila genov, ki se zdijo kot "Prisotnost" v razredčenih vzorcih (30 pg, 10 pg in 2 pg), lahko pride zaradi izgube nizko število kopij RNA vrst med pomnoževanjem. Slika 1 Primerjave treh okroglih-ojačan izdelkov, ki se začnejo z zelo majhnimi količinami RNA. (A-c) Amplification pristranskosti v izdelkih, ki se začnejo majhne količine RNA. Graf raztrosa intenzivnosti signala dobimo iz 5 ig BMMC RNA po standardnem protokolu in od 30 pg (A
), 10 pg (b
) in 2 pg (c
) z BMMC RNK, ki jih je pripravil pripravil tri krogih pomnoževanja so prikazani. (D, e) Obnovljivost treh krogu pomnoževanje majhne količine RNA. Graf raztrosa intenzivnosti signala med dvema neodvisnima izdelkov od 30 pg od BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 in BMMC 30 pg-2) (d
) ali 2 pg od BMMC RNA (BMMC 2 pg-1 in BMMC 2 pg-2) (e
), so prikazani. Rdeče pike kažejo sklopov sonda ocenjena kot "Prisotnost", in rumene pike predstavljajo nizov sonda ocenjena kot "odsotnost" v obeh polj. Modre pike kažejo sklopov sonda ocenjena kot "Prisotnost", samo v obeh nizov. Korelacijski koeficienti (r) so predstavljeni. Isti, štiri-krat indukcijske in zatiranja pragovi so označeni kot diagonalnih linij. Geni selekcionirani "Prisotnost", so postavljeni v skupine, ki ustrezajo parna prekriva prikazana v priloženih Vennov diagram.
Smo poleg preučila ponovljivost rezultatov mikromrež, pridobljenih iz dveh sklopov 30 pg BMMC RNA vzorcev (30 pg-1 in 30 pg-2) ali dve seriji vzorcev 2 pg (2 pg-1 in 2 pg-2) (slika 1d in 1e). V 30 pg vzorcih RNA, 7537 (30 pg-1) in 8777 (30 pg-2) geni so bili ocenjeni kot "prisotnost". Vendar pa je le 4324 (2 pg-1) in 4460 (2 pg-2) geni so bili ocenjeni kot "prisotnosti" v vsaki 2 pg RNA vzorca, spet kaže izgubo nizko število kopij RNA med pomnoževanjem z majhno količino RNA. Kot je na ponovljivost, je bilo 86% genov v 'Navzočnost' v 30 pg-1 in 74% genov 'Navzočnost' v pg-2 vzorca 30. ocenjuje kot "prisotnosti" v obeh 30 pg vzorcih RNA, medtem ko le 57 % genov "prisotnosti" v 2 pg-1 in 55% genov 'Navzočnost' v pg-2 vzorca 2 so bili ocenjeni kot "prisotnosti" v obeh 2 pg RNA vzorcev. Ti rezultati kažejo, da lahko dopolnjena izdelki iz RNK iz enega MC (okoli 2 pg) s sedanje metode vključujejo pomembne ozvočenje artefakte, ki povzročajo težave pri natančnosti in ponovljivosti. Po drugi strani pa zaradi višjega ponovljivosti (> 74%), smo ugotovili, da bi pomnoževanje od 30 pg RNA zbranih od 15 MCs primerni za praktično analizo tkiva MCs. Na podlagi teh rezultatov smo postavili naš cilj v tej študiji za pridobitev genske ekspresije profile DZU združijo iz različnih regij. Da bi zmanjšali vpliv sprememb celic v celici istega razreda in potencial za ojačevanje artefaktov, smo pripravili tri sklope 15 DZU za vsako regijo in v primerjavi genov z bistveno drugačnim izrazom med DZU iz različnih regij (slika 2b). Izbrali smo želodec kot vir organ, saj lahko izolirati dve vrsti DZU iz sluznice (MMC) in submucosa (SMC) regijah istih odsekih, in so se sumi, da je drugačen v več lastnostih MC kot MMC in SMC proteaza izraz profila in občutljivost za safranina barvanjem [1, 11]. Slika 2 izražanje genov profili SMC in MMC iz želodca tkiva. (A) Izolacija toluidinska modro obarvanih DZU v submucosa (SMC; zgornje plošče
) in sluznice (MMC, spodnje plošče
) odsekov želodcu. SMC (puščica
) in MMC (arrowhead
), ki je bil metachromatically obarvali s toluidin modro pred mikrodisekcijo (levo plošče
) izgine mikrodisekcijo s pipete (desno plošče
). Palice
, 10 mikrometrov. (B) Oris eksperimentalnega strategije. (C) Označene in razdrobljene protismiselno RNA treh posameznih SMC vzorcev, treh posameznih vzorcev MMC in vzorcev "ni celic" hibridiziramo v mišje Array. Graf raztrosa za "ne cell" (x os) in sMC1 (y os) (zgornji levi
), "brez cell" (x os) in mMC1 (y os) (spodaj levo
), sMC1 (x os) in sMC2 (y os) (zgornja center
), mMC1 (x os) in mMC2 (y os) (nižji center
), sMC1 (x os) in mMC1 (y os) (zgoraj desno
) so prikazani. Korelacijski koeficienti (r) za primerjave znotraj sMC1-3, v mMC1-3 in med SMC in MMC so prikazani kot sredstva ± SD Rdeče pike kažejo sklopov sonda ocenjena kot "Prisotnost", in rumene pike predstavljajo nizov sonda ocenjena kot "odsotnost" v obeh polj. Modre pike kažejo sklopov sonda ocenjena kot "Prisotnost", samo v obeh nizov. Isti, dva-krat indukcijske in zatiranja pragovi so označeni kot diagonalah.
Izražanja genov profili Submukozno in sluznicah DZU iz želodca
Za vizualizacijo dve vrsti DZU v želodcu ne povzroča degradacije RNA, so odseki fiksna fiksativa Carnoy in metachromatically obarvali s toluidin modro za nekaj sekund. SMC in MMC bile microdissected pomočjo pipete (slika 2a in 2b). Pripravili smo tri sklope 15 DZU za vsako regijo, pridobljeni svojo RNK in jih posamično dopolnjena (SMC 1 SMC 2 SMC 3 in MMC 1, MMC 2, MMC 3). Izboljšanje vračilo pridobivanja čim manj kot 30 pg RNA, smo uporabili "poli G 'kot nosilec, ki ne posega v naslednjem RNA pomnoževanje ali hibridizacije pomnoženega produkta v matriki (podatki niso prikazani). Da bi preučili učinke nespecifično pomnoženih artefakt izdelkov, smo izvedli postopek ekstrakcije RNA /ojačevanja brez dodajanja microdissected celicam ( "no celico") kot negativno kontrolo (opisano v "Materiali in metode
"). Pomnoženih RNA iz SMC, MMC in "ne celice" nadzor so ločeno hibridizirali miši mikromrež. Vrednosti signalov v "no celice" vzorec, so bile nizke na splošno in podobni ravni naravnega ozadja (slika 2c). V graf raztrosa iz vzorcev samostojno pripravili v isti skupini (npr SMC 1 vs SMC 2) pokazala podoben izraz vzorec; povprečni koeficient korelacije za vse sonde-sprejemnikov je bila 0,945 ± 0,004 in 0,893 ± 0,019 v SMC in MMC, oziroma (n
= 3). V nasprotju s tem je bila povprečna koeficient korelacije med SMC in MMC 0,752 ± 0,034 (n
= 3), kar je precej nižje od tistih, ki spada v isto skupino, kar pomeni, da so njihove genske ekspresije vzorci drugačni.
Smo dodatno ocenili točnost in ponovljivost naše metode drugih obsežnih analiz (hierarhično analizo povezovanje in analizo glavnih komponent [PCA]) z uporabo vseh sklopov sonda. podatkov mikromrež pridobljeni iz SMC, MMC, DZU-kožnih izhaja, peritonealno DZU, BMMCs in prepovedi DZU (makrofagov in fibroblastov), ​​so bile uporabljene na teh analiz. Najprej smo preverili, ali je postopek pomnoževanje v našem načinu vpliva na globalno izraz profil zaradi nelinearne ojačanja. Rezultati vzorcev BMMC pomočjo RNK, ki jih standardni protokol (BMMC-STD), pripravljena ali metode ojačevanja (BMMC-amp) so bili izpostavljeni teh analiz. Oba hierarhično analizo grozdenje in PCA je pokazala, da so bili mikromrež podatki BMMC-STD in BMMC-amp zbrani v isti skupini (slika 3a in 3b), kar kaže, da je globalna podobnost v izražanju genov profilih vzdržuje med postopkom pomnoževanja. Mi poleg preučilo podobnost vzorcev izražanja v treh neodvisnih SMC ali MMC vzorcev. Ob analizi grozdenja in SPS SMC 1-3 in MMC 3/1 so bili zbrani v isti skupini, v tem zaporedju. PCA je tudi pokazala, da MMCs in BMMCs so izraz profili SMC med seboj razlikujejo (slika 3b). Slika 3 Globalna genske analize izraz SMC 1-3 in MMC 1-3. (A) Hierarhična povezovanje globalnega genskega izražanja različnih pripravkov DZU in niso DZU. Tri-round pomnoženi izdelki sMC1-3, mMC1-3, kožni DZU in BMMCs in standardnih izdelkov BMMCs, smo analizirali s peritonealno MCs, makrofagov in fibroblastov. (B) Analiza glavnih komponent (PCA) razkriva različne genske ekspresije profilov sMC1-3, mMC1-3 in dva priprave BMMCs. Modra pikčasto kvadrat označuje MMC, rdeče pikčasta kvadrat označuje SMC, in črna črtkana kvadrat označuje BMMCs.
Smo nato primerjali MCS-želodčne izvira (SMC in MMC) s-kožo izvira DZU, peritonealno DZU, BMMCs in ne -MCs (makrofagov in fibroblastov) s povezovanjem analizo. MC se tkiv izvira (želodec MCs in kože MCs) so bili zbrani ločeno od peritonealno DZU in BMMCs. Ti rezultati se odražajo različne lastnosti med DZU tkiv pridobljeni s trdno oprijema na sosednje celice in plavajočih DZU brez tesen stik. Glede podobnosti DZU s fibroblasti in makrofagi, je smiselno, da se fibroblasti najbolj oddaljena od DZU in makrofagi so bližje DZU kot družina levkocitov.
Validacija rezultatov mikromrež, z analizo v realnem času RT-PCR
smo Naslednja raziskati, ali hibridizacije signali znanih označevalnih genov, specifičnih za SMC in MMC pokazala pričakovane izražanja trende [12, 14]. MMC-specifičnih genov, mast cell proteaza 1 (Mcpt1
) in 2 (Mcpt2
) so pokazale višje vrednosti v MMC, medtem ko SMC-specifične označevalne gene, mast cell proteaze 4 (Mcpt4
) in kimaze 2 (CMA2
), so pokazale višje vrednosti signala v SMC (Tabela 1 in Slika 4a) [15-29]. Po drugi strani, MC-skupna označevalci, kot komplet za onkogena (Kit
) in Fcε receptor (Fcer1a
) je pokazala statistično pomembnih vrednosti signala brez pristranskosti med MMC in SMC. Da bi še dodatno ovrednotiti rezultate, smo merili raven izražanja teh označevalnih genov, ki jih v realnem času RT-PCR z uporabo RNA iz neodvisno izoliranih DZU (slika 4b). Poleg tega smo naključno izbrali tri gene, ki prikazujejo "-MMC pristranski" izraz in še tri gene, ki prikazujejo "SMC-pristranski" izraz; izražanje teh genov v DZU ni bil že opisan (slika 4a). Ni bilo pomembne razlike v stopnjah izražanja Kit
in Fcer1a
med MMC in SMC. V nasprotju s tem, MMC specifične označevalce Mcpt1
in Mcpt2
in "MMC-pristranski" geni, ANXA10, CTSE
in FOS
pokazala višjo izraz v MMC in SMC specifične markerje Mcpt4
in CMA2
in "SMC-pristranski" geni, cnn1, Ces3
in CPE
pokazala višjo izraz v SMC. Ti rezultati kažejo, da so rezultati mikromrež zanesljivi in ​​odražajo genske ekspresije profile iz intaktnih SMC in MMC v želodcu. Slika 4 Potrditev različno izraženih genov med SMC in MMC. (A) SMC-specifične (CMA2
, Mcpt4
), MMC specifične (Mcpt1
, Mcpt2
) in MC-skupna markerji (Fcer1a
in Kit
) (levo plošča
) in šest naključno izbranih genov (Ces3
, cnn1
, CPE
, ANXA10
, CTSE
in Fos
) (desna plošča
), označuje v reprezentativnem razpršenem povezanost grafov med sMC1 in mMC1. Isti, dva-krat indukcijske in zatiranja pragovi so označeni kot rumeno, modro in rdečo črto, oz. (B) ekspresijski nivoji genov iz (a), so bili preverjeni z realnem času RT-PCR. Vrednosti predstavljajo razmerje relativnih izražanjem MMC v SMC, in so prikazani kot povprečje ± SD (N = 3). Specifičnost produkta PCR smo potrdili z gelsko elektroforezo in analizo tališča. Raven izražanja vsakega gena preračuna 28S ribosomske RNA.
Tabela 1 Povzetek genov, ki jih v realnem času analize PCR pregledanih.
Gene Simbol

Gene ime
RefSeq prepis ID
Reference
Kit
kit onkogena
NM_021099
15
Fcer1a

Fc fragment IgE, veliko afiniteto I, receptor za alfa polipeptid
NM_010184
16
Mcpt1
mast cell proteaze 1
NM_008570
17, 18
Mcpt2
mast cell proteaze 2
NM_008571
19
Mcpt4
mast cell proteaze 4
NM_010779
2, 20
CMA2

kimaze 2, mast cell (mast cell proteaze 10)
NM_001024714
14 *
ANXA10
aneksin A10
NM_011922
21
CTSE

katepsina E
NM_007799
22
Fos
FBJ osteosarkom onkogena
NM_010234
23
Ptgr1
prostaglandinov reduktaze 1 (levkotrienov B4 12-hydroxydehydrogenase)
NM_025968
24 (prašičja)
cnn1
calponin 1
NM_009922
25
Ces3
karboksilesterazo 3
NM_053200
26
CPE
karboksipeptidaza E
NM_013494
27 (govedo)
Notch4
Notch gene homolog 4
NM_010929
28
28S rRNA
28S ribosomske RNA
NR_003279
29
*, kodiranje zaporedja predstavljene v tem prispevku je N-terminalni prisekanega oblika CMA2
, medtem ko RefSeq " NM_001024714 "je celotno zaporedje CMA2
.
analiza Povezovanje profilov izražanja genov in funkcionalne kategorizacije med SMC in MMC
od ~ 12.000 genov, zastopanih v oligonukleotidov paleto, smo izbrali 1.272 genov, katerih stopnjah izražanja med SMC 1-3 in MMC 3/1 bili pomembno različni (p
< 0,05, Limma je t
test). Raven izražanja vsakega gena je normaliziralo po svoji ravni BMMCs, ki so kultivirani MC s tako imenovanimi "nezrelih" lastnosti, izbrane gene so bile razvrščene v sedem skupin s pomočjo K
• sredstva za povezovanje algoritem (CL1-7; Slika 5a in dodatna datoteka 1). Prav tako razvrščeni gene v funkcionalne kategorije, in reprezentativne geni so navedene (slika 5b). Med njimi je 666 genov (52,4%) je pokazala, SMC-pristranski izraz (CL1-3
); v 78% (519 genov) SMC bogate genov, so bile ravni izraz razmeroma nizko BMMCs in razširjen v SMC (TS1 & 2
). Na primer, je bila stopnja izraz Mcpt4
v BMMCs relativno nizka, in če je izraz profil BMMCs odraža nezrela lastnosti MC prednikov, lahko Mcpt4
sklene, da se inducira v zadnji zorenja v SMC. Zanimivo je, da SMC označevalne gene Mcpt5
in Mcpt6
so bile razvrščene v TS2 /3
, kar kaže, da so bili ti geni izražena v določeni meri "nezrelo" BMMCs, vendar je njihov izraz je bil ukinjen med zorenjem v MMC. Po drugi strani pa 606 geni (47,6%) je pokazala MMC-pristransko ekspresije (CL4-7
); v 51% (334 genov) MMC bogate genov, so njihova raven izražanja v BMMCs nizka, vendar so se utrdili v MMC (TS4 & 5
). Na primer, izraz Mcpt1
v "nerazvitem" BMMCs nizka, vendar se je drastično povzročena med zorenjem v MMC. Slika 5 Povezovanje analiza profilov izražanja genov med SMC in MMC. (A) Zastopanje ravni mRNA izraženosti sMC1-3 in mMC1-3 primerjavi z BMMCs. Barva palice predstavlja razmerje jakosti signala med neodvisnimi vzorci in BMMCs, po lestvici je prikazano v zgornjem desnem
. Geni z bistveno drugačno izražanje med SMC in MMC (p
< 0,05, test t
Limma je) so bili izbrani (1,272 geni) in razdeljeni v 7 skupin z uporabo K
• sredstva algoritem (CL1-7
). (B) Funkcijska kategorizacija reprezentativnih genov iz (a). Izraz
Protein iz Notch4 v SMC in Ptgr1 v MMC v želodcu tkiva
Med geni, ki kažejo diferencialni izraz (slika 5b), bomo še naprej osredotočena na izražanje Notch4
in SMC in Ptgr1
in MMC, ki sta bili nikoli prej označena s DZU. V Notch4
genski produkt je član družine zareza, ki sestoji iz transmembranskih receptorjev, ki se aktivirajo z celičnih površinskih ligandi na sosednje celice. Nedavne študije so pokazale, da je Notch signalizacijo sodeluje pri limfocitov in jambora diferenciacije celic [30, 31]. Najprej smo potrdili, da je Notch4
izraz bistveno višja v ločeno zbranih SMC kot MMC, ki jih v realnem času RT-PCR (podatki niso prikazani). Bomo naslednjič raziskovali, ali je Notch4 protein izključno prisoten v SMC z imunskim barvanjem želodčne tkiva (slika 6a). Notch4 signali so odkrili v jedru kot struktur SMC ne pa v tistih, MMC. Poleg tega so bili Notch4 signali najdemo tudi v kožnih MCs, ki so sosednje nakopičenih s SMC (slika 3a). Ti rezultati kažejo, da je Notch4 prisotna v SMC, vendar ne v MMC, in kažejo, da Notch4 sodeluje v SMC-specifične transkripcije Notch-ciljnih genov, ki se lahko zahteva za nekatere funkcije SMC. V hematopoetske celice, so poročali, da konstitutivno aktivna Notch4 spodbuja širitev matičnih celic in zavira mieloične diferenciacijo [32]. Ker je bilo dokazano, zarezo ligande, da obstajajo v veznih tkiv, kot so kože dermis [33], bo zanimivo raziskati, ali Notch4 igra pomembno vlogo pri diferenciaciji SMC in vzdrževanje funkcij SMC. Slika 6 Imunohistokemično analiza Notch4 in Ptgr1 v SMC in MMC v želodcu tkiva. (A) v želodcu submucosa (SMC; levo plošče
), želodčne sluznice (MMC, srednji plošče
) in kože (kožne MC; prave plošče
) odseki so obarvali z anti-Notch4 protitelesa (nižji plošče
) in toluidin modro (zgornje plošče
). SMC obarvajo z anti-Notch4 protiteles v želodcu submucosa in kožnih usnjico so označeni s puščicami. Ne obarvanje opazili v MMC (puščice
) lokalizirana v želodčni sluznici. SMC in MMC so metachromatically obarvali z toluidinska modro. (B) želodca submucosa (SMC; levo plošče
) in želodčne sluznice (MMC, desno plošče
) odseki smo obarvali s protitelesom proti Ptgr1 (spodnje plošče
) in toluidinska modro (zgornje plošče
). No obarvanje s protitelesom proti Ptgr1 je bila najdena v SMC (puščica
). Mala signali so v MMC (osti
) opazili. SMC in MMC so metachromatically obarvali z toluidinska modro. Palice
, 25 mikrometrov (a, b).
Ptgr1
izdelek, 15-okso-prostaglandina 13-reduktaze /levkotrienskega (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase je bistvena encim za inaktivacijo eikozanoidov kot prostaglandina E 2 (PGE 2) in LTB 4 [34]. Čeprav so poročali, da so poti sinteze eikozanoid razlikujejo med različnimi podrazrede MC [1, 4], naši rezultati kažejo, da inaktivacijo sistem eikozanoidov razlikuje tudi med podrazrede MC. Ptgr1
izraz je bilo ugotovljeno, da se je znatno višje v ločeno zbranih MMC, ki ga v realnem času RT-PCR (podatki niso prikazani). Pregledali smo tudi Ptgr1 izraz v oddelkih želodcu z imunskim barvanjem. Signali za Ptgr1 beljakovine so našli v zrnc podobnih struktur MMC v želodčni sluznici, vendar ne v SMC (slika 6b), kar kaže, da se Ptgr1 encim lahko sprosti iz MMC po degranulacijo. Ker PGE 2 igra ključne vloge pri vzdrževanju črevesne homeostaze z zaščito sluznice in zaviranje izločanja želodčne kisline, je možno, da se ob aktiviranju, MMC negativno urejajo zaščito celice dejanja PGE 2 s pomočjo hitrega inaktivacijo s Ptgr1.
izražanje genov vzorec zunajcelični matriks komponent, adhezijskih molekul in citoskeletne proteine ​​v SMC in MMC
MC fenotipe so pokazale, da so odvisne od njihove interakcije z okoliškimi zunajcelični matric (ECMS) in sosednjih celic [1]. Ena od najpomembnejših ugotovitev v tej raziskavi, je razlika v genske ekspresije ECM proteinskih komponent, adhezijskih molekul in citoskeletne proteine, ki se odražajo funkcionalno prilagajanje vsakega tipa MC na sluznico ali Submukozno okolja v želodcu (slika 5b) . MMC izražanje genov za sluznici specifične ECM proteinov, kot so MUC1
(mucin) in Tff1
(Trefoil faktor), medtem ko je SMC izražanje genov za konvencionalne ECM beljakovin kot Col4a
(prokolagena) in Lama2
(laminin). Poleg tega, SMC izražanje genov za adhezijskih molekul, kot so Alcam
in Vcam1
in gene za navadne citoskeletnim beljakovin kot Acta2
(aktina), medtem ko MMC izražajo dezmosom-sestavne gene kot Dsc2
( desmocollin) in Dsg2
(desmoglein) in geni za keratinskega vmesne vlaken, kot so Krt8
in Krt19
. Dezmosom so poročali, da je prisotna v želodcu epitela [35], in ugotovljeno je bilo, da so dezmosom podobne strukture zazna določeno vrsto MC [36]. Zato je možno, da MMCs interakcijo s sosednjim epitelij preko desmosomal oprijema v želodcu. V nasprotju s tem, SMC zdi, da interakcijo s sosednjimi celicami preko adhezijskih molekul, kot so VCAM-1, Alcam in VE-kadherina (Vcam1
, Alcam1
in Cdh5
). Ker je bilo dokazano, ti adhezijske molekule, da se vključijo v dinamičnem regulacijo aktina citoskeleta [37, 38], lahko take-molekula posredovane interakcije z Submukozno celicah ključnega pomena za ohranjanje funkcionalne in morfološke lastnosti SMC. Dejansko je treba poudariti, da je večina SMC spremenljivka v formi, in so pogosto raztegne in navijanje v primerjavi z MMC [1].
Zaključek
smo vzpostavili metodo RNA ojačanje iz zbranih nedotaknjeno DZU izoliranih iz zamrznjenega tkiva profili, ki nam omogoča, da enostavno dobiti globalno izražanje genov vzorec DZU iz različnih tkiv, organov, in vrst, vključno s človekom. S to metodo smo pokazali prvič tudi različne genske ekspresije profile Submukozno in sluznice MCS v želodcu miške. . Naše ugotovitve ponujajo vpogled v možne neznanih lastnosti specifičnih za vsako MC podrazred
metod
materiali
so bili naslednji materiali, pridobljeni iz virov, je navedeno: HPLC očistimo T7- (dT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Anglija), RNase brez vode, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli
(E. coli
) RNase H, E . coli
DNA polimeraza I, E. coli
DNA ligaza, T4 DNA polimerazo in naključne heksamerov od Invitrogen (San Diego, CA), RNase inhibitorja, glikogena in MEGAscript T7 komplet iz Ambion (Austin, TX). Balb /c miši so bile pridobljene iz JapanClea (Hamamatsu, Japonska). Ta študija je odobril odbor za raziskave živali Kjotskega University Graduate School of Pharmaceutical Sciences.
RNA pomnoževanje in oligonukleotid mikromrež
Mouse BMMCs interlevkin-3-vzdrževani smo pripravili kot je opisano prej [39].

• Bolnik z rakom želodca s peritonealno karcinomatozo se zdravijo z intraperitonealno kemoterapijo, ki je preživel več kot 5 let prejemali ponavljajoče laparoskopsko preglede: prikaz primera
• Imunizacija z imunodominantnim Helicobacter suis ureaze podenote B povzroči delno zaščito pred okužbo s H. suis v mišjem modelu