Karakterizacija profila genske ekspresije za različite vrste mastocita pomiješanih s mišem želuca subregija s metodom RNA amplifikacije

Karakterizacija Gene Expression profila za različite vrste mastocita pomiješanih s mišem želuca subregija s metodom RNA amplifikacije pregled apstraktne pregled pozadine
mastocita (MCS) imaju ključne uloge u alergije i urođene imunosti i sastoji se od heterogene podklase , Međutim, molekularna osnova određivanja različite karakteristike tih višestrukih MC podrazreda ostaje nejasno. Pregled Rezultati
približiti, razvili smo metodu ekstrakcije RNA /pojačanja za nedirnute in vivo
MC-udružuje sa sekcijama smrznutog tkiva , što nam je omogućilo da dobije ekspresija gena uzorak udružuje MC-a koji pripadaju istoj podrazreda. MC-ovi su izolirani iz submukozu (sMCs) i sluznice (MMCS) sekcija mišjeg želucu, odnosno 15 stanice su skupljene, a njihova je ekstrahirana RNA, pojačavaju i podvrgnuti analize mikropolja. Poznati marker geni specifični za MMCS i sMCs pokazala očekuje izraz trendove, što ukazuje na točnost analize. Pregled, identificirali smo 1,272 gena koji pokazuju značajno različite razine ekspresije između sMCs i MMCS, i klasificiraju ih u klastere na temelju sličnosti njihovih ekspresije profila u usporedbi s MC-a dobiveni iz koštane srži, koje su kultivirani MC s takozvanim 'nezrela' svojstva. Među njima, otkrili smo da je nekoliko ključnih gena, kao što su Notch4 pregled imali SMC-pristran izražavanje i Ptgr1 pregled imala MMC-pristran izraz. Nadalje, postoji razlika u ekspresiji nekoliko gena, uključujući protein komponente ekstracelularnog matriksa, adhezijske molekule i proteine ​​staničnog skeleta između dva MC podklase, koji mogu odražavati funkcionalne prilagodbu svakog MC na sluznice ili submukozne okoline u želucu.
Zaključak
upotrebom postupka iz RNA pojačanja od skupljenih intaktnih MC-, naznačen time što je različita profila genske ekspresije sMCs i MMCS u miša želucu. Naši rezultati pružaju uvid u mogući neidentificirane svojstvima za svaki MC podrazreda. Pregled Pozadina pregled mastocita (MCS) su izvedeni iz krvotvornih matičnih stanica i igra važnu ulogu u alergijskim reakcijama, urođene imunosti i obranu od parazita infekcije. Za razliku od ostalih krvnih stanica, MC migriraju u perifernim tkivima što nezrelih matičnih stanica i diferencijaciju u zrele mastocita. Jedna od jedinstvenih značajki MC-a je u tome što oni pokazuju razne fenotipova, ovisno o različitim mikro okolinu tkiva njihovog sazrijevanja [1]. U MC-, razni MC-specifične proteaze serina se pohranjuju u izvodnih granulama, a njihovi gena i proteina izrazi dramatično se promijenila kada je izmijenjen njihov mobilni okoliša. Na primjer, Reynolds i sur. Pregled pokazali su da je najmanje šest zasebnih članova miša MC-specifičnih serinskih proteaza izraženi u različitim kombinacijama u različitim populacijama mastocita [2]. Osim toga, nedavna istraživanja su pokazala da zreli MC razlikuju u pogledu toga što površina receptora i lipidnih medijatora izražavaju [3, 4]. Budući da svaki mastocita populacija in vivo pregled moraju igrati određenu ulogu u organizmu, to je važno odrediti karakter svakog stanovnika MC-a.
Sveobuhvatna analiza ekspresije gena je moćan pristup razumjeti karakterizaciju različitih MC subpopulacije. Do sada, nekoliko studija o microarray analize MC-a su provedena [5-7], ali većina njih bavila MC-a uzgajaju se in vitro pregled. Alternativno, profila genske ekspresije MC-izolirani od kože i pluća su analizirani [3, 8-10]. Međutim, broj MC-a analizira kao jedan uzorak su relativno visoki, a oni su bili izloženi fizičkim silama, enzima i anti-Kit antitijela za pročišćavanje, tijekom kojih je možda utjecalo na izvorni svojstva MC-a.
U gastrointestinalnom trakta, postoje MC koji se uglavnom klasificiraju u dvije podklase; za sluznicu MC (MMCS) i submukozno MC (sMCs) na temelju svog položaja, morfologije (veličina i oblik), te sadržaja granula [11, 12]. MMCS se uglavnom nalaze u mukozi gastrointestinalnog sustava, koji ima granule kondroitin sulfata koji sadrže, koje su obojene s toluidin plavom, ali ne safranina, a njihova aktivacija događa tijekom parazit infekcije [13], a sMCs lokalizirani u submukozi gastrointestinalnog trakta i njihove granule bogate su heparin i obojeni i toluidina plava i safranina [1, 11]. Međutim, molekularna osnova određivanja razlike u biokemijskim svojstvima ovih dviju MC podklase ostaje neizvjesna, dijelom i zbog poteškoća u njihovoj izoliranosti.
Za prevladavanje tih problema, tu smo uspostavili metodu RNA pojačanje iz netaknutih MC-a izoliran od smrznuto Rezovi tkiva, koji nam omogućuje povoljno za dobivanje ekspresija gena uzorak MC-a u različitim tkivima. Da bi potvrdili ovu metodu, najprije određuje broj minimalna stanica potrebnih za postizanje ponovljiv pojačanje RNK. Zatim smo u odnosu profila genske ekspresije dobivene od malog broja MMCS i sMCs u miša želucu, i pronašao nekoliko ključnih gena koji se posebno izražava u jednoj podskupini MC-a, što može biti i odraz nekih aspekata različitih svojstava dvaju MC podklase u gastrointestinalnog trakta. pregled Rezultati i rasprava
razvoj RNA amplifikacije protokol za dobivanje profila genske ekspresije s malom količinom RNA pregled da se dobije uvid u funkcionalne razlike između različitih podgrupa MC-, zaposleni smo tri kruga metodom RNA amplifikacije T7 bazi. Na temelju preliminarnih eksperimenata pomoću peritonealnih MC i MCS dobiveni iz koštane srži (BMMCs), procjenjuje se da je jedan MC daje 2 pg RNA. Prije nego što smo obavili komparativnu analizu MC-a iz različitih tkiva, prvo smo ocijenili točnosti i ponovljivosti tri kruga metodom RNA amplifikacije T7-based, počevši s količinom RNA koje se mogu dobiti iz jednog MC. Da procjene, prvo u odnosu na rezultate microarray iz 5 ug BMMC RNA pripremljen standardnom protokolu s onima koji su dobiveni iz iste RNA razrijeđenog 10 5- ili 10 6-struko (30 pg, 10 pg i 2 ug) i podvrgnuto tri kruga T7-temeljen pojačanja (Slika 1a-c). Iako je tri kruga pojačanja dala dovoljno količina RNA za analize mikropolja (> 20 ug), čak iu slučaju 2 str RNA, raspršuju zemljište analiza pokazala je da su svojstva dobivenih rezultata su vrlo različiti između uzoraka iz 5 ug i 2 pg RNA. Geni sudila kao 'prisutnost' iu 30 pg i 5 ug RNA bila 8,149 geni, što odgovara 72% gena ocijenjena kao »prisutnost« u 5 ug RNA (11,344 geni Slika 1a), dok je samo 4.116 gena bili suđeni kao 'prisutnost' u oba 2 pg i 5 ug RNA, što odgovara 36% gena ocijenjena kao »prisutnost« u 5 ug RNA (Slika 1c). Smanjenje broja gena ocijenjena kao »prisutnost« u razrijeđenih uzoraka (30 str, 10 str i 2 pg) može biti zbog gubitka niska primjerak vrste broj RNA tijekom pojačanja. Slika 1 usporedbe tri okrugla uvećan proizvoda počevši s vrlo malim količinama RNA. (A-c) amplifikacije predrasuda u proizvodima počevši od male količine RNA. Raspršeni nacrtano intenziteta signala iz 5 ug BMMC RNA pripremljen standardnom protokolu i od 30 pg (a
), 10 ug (b
) i 2 ug (c
) u BMMC RNA pripremljen prikazane su tri kruga pojačanja. (D, e) reproduktivnost tri okruglog amplifikacije maloj količini RNA u. Scatter zemljište od intenziteta signala između dva neovisna proizvoda od 30 pg BMMC RNA (BMMC 30 pg-1 i BMMC 30 pg-2) (d pregled) ili od 2 pg BMMC RNA (BMMC 2 pg-1 i BMMC 2 PG-2) (e pregled), pokazalo se. Crvene točkice pokazuju sonde seta ocijenjena kao "prisutnost", i žute točkice predstavljaju sonde seta ocijenjena kao "odsutnost" u oba polja. Plave točkice pokazuju sonde seta ocijenjena kao "prisutnost" samo u oba polja. Koeficijenti korelacije (R) prikazana. Isti, četverostruka indukcijske i suzbijanje pragovi su označeni kao dijagonalnih linija. Geni su ocijenjene kao "prisutnost" su smješteni u skupine koje odgovaraju parovima preklapa prikazano na priloženim Vennov dijagrama. Pregled Potom smo ispitali ponovljivost rezultata microarray dobivenih od dva seta od 30 pg BMMC RNK uzoraka (30 pg-1 i 30 PG-2) ili dva seta uzoraka 2 pg (2 pg-1 i 2 pg-2) (Slika 1d i 1e). U 30 pg uzorcima RNA, 7537 (30 pg-1) i 8777 (30 pg-2) geni su ocijenjena kao »prisutnost«. Međutim, samo 4324 (2 pg-1) i 4460 (2 pg-2) geni su ocijenjena kao "Presence 'u svakom uzorku 2 str RNA ponovo upućuje na gubitak niskog broja kopija RNA tijekom amplifikacije s malom količinom RNA. Što se tiče obnovljivosti, 86% od 'prisutnost' gena u 30 pg-1 i 74% 'prisutnost' gena u PG-2 uzorka 30 su ocijenjena kao »prisutnost« u oba 30 pg RNA uzoraka, dok je samo 57 % od 'prisutnost' gena u 2 pg-1 i 55% 'prisutnost' gena u pg-2 uzorku od 2 su ocijenjena kao »prisutnost« u oba 2 uzorka pg RNA. Ovi rezultati sugeriraju da je povećani proizvodi iz RNA iz jednog MC (oko 2 ug) do postojeće metode mogu uključivati ​​značajne pojačanje artefakti uzrokuju probleme u točnosti i ponovljivosti. S druge strane, zbog visoke ponovljivosti (> 74%), došli smo do zaključka da je pojačanje od 30 pg RNA prikupljenih iz 15 MC-a će biti pogodan za praktičnu analizu tkiva MC-a. Na temelju tih rezultata, postavili smo naš cilj u ovoj studiji za stjecanje profila genske ekspresije MC-udružuje iz različitih regija. Da bi se smanjio utjecaj stanice do stanice varijacije unutar iste klase i potencijalna pojačanja artefakata, pripremili smo tri seta 15 MC-a za svaku regiju i usporedbi gena sa značajno različitim izrazom između MC-a iz različitih područja (slika 2b). Odabrali smo želuca kao izvorni organ, jer možemo izolirati dvije vrste MC-a iz sluznice (MMC) i submukoza (SMC) regijama iste dijelove i MMCS i sMCs su sumnja da se razlikuje u nekoliko MC svojstva, kao što su proteaze izraz profil i osjetljivost na safranina bojenje [1, 11]. Slika 2 Gene Expression profili sMCs i MMCS iz želuca tkiva. (A) Izolacija toluidina plavo-obojanih MC-u u sluznicu (SMC, gornje tribine
) i sluznica (MMC, donje tribine pregled) sekcija želuca. SMC (strelica pregled) i MMC (strelica pregled) koji je metachromatically obojeni toluidinskim plavom prije mikrodisekcijom (lijeve snimke
) nestala nakon mikrodisekcijom sa patch pipetom (desni prikaz pregled). Barovi
, 10 um. (B) Nacrt pokusne strategije. (C) Označeno i usitnjeni antisense RNA triju pojedinačnih uzoraka SMC, tri pojedinačna uzorka MMC i 'nema stanica "uzoraka hibridizirana mišjem Array. Scatter parcele za 'no stanici' (x-os) i sMC1 (y os) (gornji lijevi
), 'no stanici' (x-os) i mMC1 (y-os) (donji lijevi
), sMC1 (x os) i sMC2 (y-os) (gornji središnji pregled), mMC1 (x-os) i mMC2 (y-os) (niži centar pregled), sMC1 (x-os) i mMC1 (y-os) (gornji desni
) prikazana su. Koeficijenti korelacije (r) za usporedbe unutar sMC1-3, unutar mMC1-3 i između sMCs i MMCS su prikazani kao srednje vrijednosti ± S.D. Crvene točkice pokazuju sonde seta ocijenjena kao "prisutnost", i žute točkice predstavljaju sonde seta ocijenjena kao "odsutnost" u oba polja. Plave točkice pokazuju sonde seta ocijenjena kao "prisutnost" samo u oba polja. Isti, dvostrukih indukcijske i suzbijanje pragovi su označeni kao dijagonalnih linija.
Gene Expression profili submukozalnim i sluznice MC-a iz želuca Netlogu Za prikaz dvije vrste MC-a u želucu ne uzrokuje degradaciju RNA, rezovi su fiksirao Carnoy je fiksaciju i metachromatically obojeni toluidinskim plave za nekoliko sekundi. sMCs i MMCS su microdissected pomoću Patch pipeta (slika 2a i 2b). Pripremili smo tri seta 15 MC-a za svaku regiju, ekstrahirana svoju RNA i pojedinačno ih pojačavaju (SMC 1, SMC 2, SMC 3 i MMC 1, MMC 2, MMC 3). Za poboljšanje oporavka ekstrakciju samo 30 ug RNA, koristili smo 'poli G' kao nosač, koji ne interferira s sljedećim RNA amplifikacijom ili hibridizacijom umnoženog proizvoda u niz (podaci nisu prikazani). Ispitati učinke nespecifično pojačanih artefakta proizvoda, proveli smo postupak ekstrakcije RNA /pojačanja bez dodavanja microdissected stanice ( "ne stanicu") kao negativne kontrole (opisan u "Materijali i metode
"). U umnoženi RNA iz sMCs, MMCS i "nema stanica" kontrolu odvojeno su hibridizirana mišji microarray. Signalni vrijednosti u "nema stanica" uzorka bile su niske u cjelini i slično razinama pozadina (slika 2c). Scatter zemljište od uzoraka samostalno pripremaju u istoj skupini (npr SMC 1 vs SMC 2) pokazuju sličnu izraz uzorak; prosječni koeficijent korelacije svih proba skupova bila 0,945 ± 0,004 i 0,893 ± 0,019 u sMCs i MMCS, odnosno (n pregled = 3). Za razliku od toga, prosječni koeficijent korelacije između sMCs i MMCS je 0.752 ± 0.034 (n pregled = 3), što je znatno niže od onih u istoj skupini, što upućuje da je njihova ekspresija gena obrasci su različiti.
Smo dodatno vrednovati točnost i ponovljivost naše metode druge sveobuhvatne analize (hijerarhijska analiza povezanosti i metodom glavnih komponenata [PCA]), koristeći sve skupove sonde. Mikropolja Podaci iz sMCs, MMCS, kože izveden iz MC-, peritonealni MC-, BMMCs i ne-MC-(makrofaga i fibroblasti) dodane su u ovim analizama. Prvo smo provjeriti je li postupak pojačanje u našem načinu utječe na globalnu profil ekspresije zbog nelinearne pojačanja. Rezultati iz uzoraka BMMC koriste RNK pripremio standardni protokol (BMMC-STD) ili metodu pojačanje (BMMC-amp) su podvrgnuti ovim analizama. Oba hijerarhijska grupiranje analiza i PCA otkrio da microarray podaci iz BMMC-STD i BMMC-amp su grupirani u istoj skupini (slika 3a i 3b), što ukazuje da je globalna sličnost u Gene Expression profila održava tijekom postupka umnožavanja. Potom smo ispitali sličnost izraz uzoraka u tri nezavisne SMC ili MMC uzoraka. Po klastera analize i PCA, SMC 1-3 i MMC 1-3 su grupirani u istoj grupi. PCA također pokazuju da izraz profili sMCs, MMCS i BMMCs međusobno različite (Slika 3b). Slika 3 Global ekspresije gena analiza SMC 1-3 i MMC 1-3. (A) Hijerarhijski skupina od globalnog ekspresije gena različitih pripravaka MC-a i ne-MC-a. Analizirani su tri cijele umnoženi proizvodi sMC1-3, mMC1-3, kože MC-a i BMMCs i standardnih proizvoda BMMCs peritonealne MCs, makrofagi i fibroblaste. (B) Metodom glavnih komponenata (PCA) otkriva različite profila genske ekspresije sMC1-3, mMC1-3 i dva preparata BMMCs. Plava točkasta kvadrat označava MMCS, crvena točkasta kvadrat označava sMCs, a crni točkasta kvadrat označava BMMCs. Pregled Mi smo tada u odnosu na MC-u želucu-izvedeni (sMCs i MMCS) s kožnim-izvedeni MC-a, peritonealni MC-a, BMMCs i ne -MCs (makrofagi i fibroblasti) po klastera analizu. MCS tkiva-izvedeni (želudac MCs i kože MCS) su grupirani odvojeno od peritonealnom MC-a i BMMCs. Ovi rezultati odražavaju različita svojstva između tkiva dobivena iz MC-a s tvrtkom prianjanje na susjedne stanice i plutajuće MC-a bez uskoj kontakt. Što se tiče sličnosti MC-a s fibroblasta i makrofaga, razumno je da fibroblasti su najudaljeniji od MC-a i makrofagi su bliže MC-kao leukocita obitelj. Pregled Validacija rezultata microarray po realnom vremenu RT-PCR analize pregled smo sljedeći istražuju da li su hibridizacije signali poznatih marker gena specifičnih za sMCs i MMCS pokazao očekivane izraz trendove [12, 14]. Geni MMC-specifičan, proteaze masnih stanica 1 (Mcpt1
) i 2 (Mcpt2
) veće vrijednosti dobivene u MMCS, dok je SMC-specifični marker geni, proteaze mastocita 4 (Mcpt4 Netlogu) i himaza 2 (Cma2 pregled), pokazale su više vrijednosti signala u sMCs (Tablica 1 i Slika 4a) [15-29]. S druge strane, MC-uobičajene markere kao što su pribor za onkogena (Kit
) i Fcε receptora (Fcer1a
) pokazala je značajne vrijednosti signala bez predrasuda među MMCS i sMCs. Kako bi se dodatno procijeniti rezultate, mjerili smo razine ekspresije ovih marker-genima u realnom vremenu RT-PCR upotrebom RNA iz izoliranih neovisno MC-(slika 4b). Osim toga, mi slučajno odabranih tri gena koji pokazuju 'MMC-pristran' izričaj i još tri gena koji pokazuju "SMC-pristran 'izraz; Ekspresija ovih gena u MC-nije prethodno objavljen (slika 4a). Nije bilo značajne razlike u razinama ekspresije Kit Netlogu i Fcer1a Netlogu između MMCS i sMCs. Nasuprot tome, MMC specifičnih markera Mcpt1
i Mcpt2
i 'MMC-pristran' geni, Anxa10, Ctse
i Fos pregled je pokazao veću izraz u MMCS, a SMC-specifične markere Mcpt4 pregled i Cma2 pregled i 'SMC-pristrana' geni, Cnn1, Ces3 pregled i CPE pregled je pokazao veću izraz u sMCs. Ovi rezultati pokazuju da su rezultati microarray su pouzdani i odražavaju profila genske ekspresije netaknutim sMCs i MMCS u želucu. Slika 4 Validacija u različito izraženim genima između sMCs i MMCS. (A) SMC-specifične (Cma2 pregled, Mcpt4 pregled), MMC-specifične (Mcpt1 pregled, Mcpt2 pregled) i MC-zajedničke markera (Fcer1a
i Kit
) (lijeva ploča pregled) i šest slučajno odabranih gena (Ces3 pregled, Cnn1 pregled, CPE pregled, Anxa10 pregled, Ctse pregled i Fos pregled) (donji pregled) označeni su u predstavničkom rasuli povezanosti grafova između sMC1 i mMC1. Isti, dvostrukih indukcijske i suzbijanje pragovi su označeni kao žuta, plava i crvena linija, respektivno. (B) Ekspresija razine genima u (a) potvrđeni su pomoću real-time PCR. Vrijednosti predstavljaju omjer relativne razine ekspresije MMCS do sMCs te su prikazani kao srednja vrijednost ± S.D. (N = 3). Specifičnost PCR produkta potvrđena je elektroforezom na gelu i analize temperature taljenja. Razina ekspresije svakog gena je normaliziran 28S ribosomskc RNA.
Tablica 1. Sažetak gena ispitanih u realnom vremenu PCR analizom. Pregled Gene Symbol pregled
Genea Name
RefSeq transkript ID
referentni
Kit
kit onkogena pregled NM_021099 pregled 15 pregled Fcer1a pregled pregled, Fc fragment IgE, visokim afinitetom I, receptor za alfa polipeptida pregled NM_010184 pregled 16 pregled Mcpt1
jarbol proteaze stanica 1 pregled NM_008570 pregled 17, 18
Mcpt2
mastocita proteaze 2 pregled NM_008571 pregled 19 pregled Mcpt4
jarbol proteaze stanica 4 pregled NM_010779 pregled 2, 20 pregled Cma2
pregled himaza 2, mastocita (mastocita proteaze stanica 10) pregled NM_001024714
14 * pregled Anxa10
aneksin A10 pregled NM_011922 pregled 21 pregled Ctse
pregled katepsin E pregled NM_007799 pregled 22 pregled Fos
FBJ osteosarkom onkogena pregled NM_010234 pregled 23 pregled Ptgr1
prostaglandin reduktaze 1 (leukotriena B4 12-hydroxydehydrogenase) pregled NM_025968 pregled 24 (svinjski) pregled Cnn1
calponin 1 pregled NM_009922 pregled 25 pregled Ces3
karboksilesteraza 3
NM_053200 pregled, 26 pregled, CPE
karboksipeptidaze E pregled NM_013494 pregled, 27 (goveda) pregled Notch4
usjek gena homologa 4 pregled NM_010929 pregled 28 pregled 28S rRNA
28S ribosomna RNA pregled NR_003279 pregled 29 pregled *, Kodna sekvenca prikazana u ovom radu je N-kraj skraćen-oblik Cma2 Netlogu, a RefSeq " NM_001024714 "je potpuni slijed Cma2 Netlogu. pregled Grupiranje analiza profila genske ekspresije i aktivne kategorizacije između sMCs i MMCS pregled od ~ 12.000 gena zastupljenih na oligonukleotidne polje, odabrali smo 1,272 gene čija razinama ekspresije između SMC 1-3 i MMC 1-3 bile značajno različite (p izvoznici < 0.05, Limma t pregled test). Razina ekspresije svakog gena se normalizira njegovu razinu u BMMCs, koji su kulturan MC s takozvanim "nezrelih" svojstava, a odabrani geni su razvrstane u sedam klastera koristeći k pregled -means clustering algoritam (CL1-7 Slika 5a i dodatno file 1). Mi smo također klasificirani gene u funkcionalne kategorije, a reprezentativni geni su navedeni (Slika 5b). Među njima, 666 gena (52,4%), pokazalo je SMC-pristran izraza (CL1-3 pregled); u 78% (519) gena SMC bogate gena, ekspresijske razine su se relativno malo BMMCs i proširena u SMC (CL1 i 2 pregled). Na primjer, razina ekspresije Mcpt4
bio je relativno nizak u BMMCs, a ako ekspresija profil BMMCs odražava nezrelih svojstva MC progenitora, Mcpt4 pregled može se zaključiti da se inducira tijekom završnog sazrijevanja u sMCs. Zanimljivo je da je SMC marker geni Mcpt5 pregled i Mcpt6 pregled su svrstane u CL2 /3 Netlogu, upućuje na to da su ti geni izražena u određenoj mjeri u 'nezrele' BMMCs, ali njihova ekspresija je potisnut tijekom dozrijevanja u MMCS. S druge strane, 606 gena (47,6%) su pokazali MMC-pristran izraz (CL4-7
); u 51% (334 gena) u MMC-bogata gena, njihove razine ekspresije u BMMCs bile niske, ali su prošireni u MMCS (CL4 & 5 pregled). Na primjer, izraz Mcpt1 Netlogu bila je niska u 'nezrele' BMMCs, ali je drastično izazvana tijekom dozrijevanja u MMCS. Slika 5 Grupiranje analiza profila genske ekspresije između sMCs i MMCS. (A) Zastupljenost razinama ekspresije mRNA sMC1-3 i mMC1-3 usporedbi s BMMCs. Boja barova predstavlja omjer intenziteta signala između nezavisne uzorke i BMMCs, prema skali koja je prikazana na gornjem desnom Netlogu. Geni s bitno različitim izrazom između sMCs i MMCS (p Netlogu 0,05, Limma t pregled test) izabrani su (1,272 geni) i dijele se na 7 klastera koristeći k
-means algoritam (CL1-7
). (B) Funkcionalna kategorizacija reprezentativnih gena iz (a). Izražavanja pregled protein iz Notch4 u sMCs i Ptgr1 u MMCS u tkivu želuca pregled Među gena pokazuju diferencijalnu ekspresiju (Slika 5b), mi i dalje fokusirani na ekspresiju Notch4 pregled u sMCs i Ptgr1 pregled u MMCS, oba od kojih nikada nisu bili prethodno naznačen time MC-a. U Notch4 pregled genski produkt je član obitelji Notch, koji se sastoji od transmembranskih receptora koji su aktivirani na površini stanice ligandima na susjednim stanicama. Nedavna istraživanja su pokazala da signaliziranje Notch je uključen u limfocita i mastocita diferencijacije [30, 31]. Mi smo prvi put potvrdio da Notch4 pregled, izraz je znatno viša u odvojeno skupljenim sMCs nego MMCS u realnom vremenu RT-PCR (podaci nisu prikazani). Potom smo istraživali da li je Notch4 protein isključivo prisutan u sMCs od imunološko želučane tkiva (slika 6a). Notch4 signali su nađeni u nucleus nalik strukture sMCs ali ne i u onima MMCS. Nadalje, Notch4 signali su također naći u koži MC-a, koji su bili u blizini, skupljeno s sMCs (Slika 3a). Ovi rezultati pokazuju da Notch4 prisutan u sMCs, ali ne u MMCS, i sugeriraju da Notch4 sudjeluje u SMC-specifične transkripcije Notch ciljnih gena, koji mogu biti potrebni za neke SMC funkcije. U hematopoetskih stanica, objavljeno je da konstitutivno aktivni Notch4 potiče ekspanziju prekurzorskih stanica i inhibira diferencijaciju mijeloičnu [32]. Od Notch ligandi su pokazala da postoji u vezivnom tkivu, kao što su kože dermisa [33], bit će zanimljivo istražiti da li Notch4 igra važnu ulogu u diferencijaciji sMCs i održavanje SMC funkcija. Slika 6 Imunohistokemijska analiza Notch4 i Ptgr1 u sMCs i MMCS u tkivu želuca. (A) Želudac submukoza (sMCs; lijevi paneli
), sluznicu želuca (MMCS, srednji paneli
) i kože (koža MC, desni prikaz pregled) sekcije su obojene s anti-Notch4 antitijela (donje tribine pregled) i toluidinskim plava (gornje tribine
). sMCs obojene s anti-Notch4 protutijela u želučanim submukozu i kože dermisa su označene sa strelicama. Ne ostavlja mrlje zabilježen je u MMCS (strelica Netlogu) lokaliziran u želučanoj sluznici. sMCs i MMCS su metachromatically obojeni toluidinskim plave. (B) Želudac submukoza (sMCs, lijeva ploča pregled) i sluznicu želuca (MMCS, desni prikaz pregled) dijelovi su obojeni s anti-Ptgr1 antitijela (donje tribine pregled) i toluidinskim plava (gornje ploče
). Ne obojenje sa anti-Ptgr1 protutijela je pronađena u sMCs (strelica pregled). Male signale opažene u MMCS (strelice
). sMCs i MMCS su metachromatically obojeni toluidinskim plave. Barovi
, 25 um (a, b).
Ptgr1 pregled proizvoda, 15-okso-prostaglandin 13-reduktaze /leukotriena (LT) B 4 12-hydroxydehydrogenase je bitan enzim za inaktivaciju eicosanoids poput prostaglandina E 2 (PGE 2) i LTB 4 [34]. Iako je objavljeno da su putevi sinteze eikozanoida razlikuju među različitim MC podrazreda [1, 4], naši rezultati sugeriraju da inaktivacija sustav eikozanoida također varira među MC podrazreda. Ptgr1 pregled, izraz je utvrđeno da je značajno viša u odvojeno skupljenim MMCS u realnom vremenu RT-PCR (podaci nisu prikazani). Također smo ispitali Ptgr1 izraz u dijelovima želuca imunološkim. Signali za Ptgr1 proteina pronađeni su u granule poput strukture MMCS u sluznicu želuca, ali ne u sMCs (Slika 6b), što ukazuje da je Ptgr1 enzim može osloboditi MMCS nakon degranuliranja. Budući PGE 2 drame kritične uloge u održavanju crijeva homeostaze kroz zaštitu sluznice i inhibicija sekrecije kiseline, moguće je da kada je aktiviran, MMCS negativno regulira zaštite stanice djelovanje PGE 2 putem brze inaktivacije od Ptgr1.
Gene ekspresije komponente ekstracelularnog matriksa, adhezijske molekule i proteine ​​staničnog skeleta u sMCs i MMCS
MC fenotipova su pokazala da ovisi o njihovoj interakciji s okolnim izvanstaničnog matriksa (ECM-ove) i susjednih stanica [1]. Jedan od najznačajnijih nalaza iz ovog istraživanja je razlika u ekspresiji gena proteinske komponente ECM, adhezijske molekule i proteine ​​staničnog skeleta, što može odražavati funkcionalne prilagodbe svakog tipa MC u sluznice ili submukozne okruženju u želucu (Slika 5b) , MMCS izražavaju gene za sluznice specifične ECM proteina, kao što su Muc1 pregled (mucina) i Tff1 pregled (trolista faktor), dok sMCs izražavaju gene za konvencionalne ECM proteinima kao što su Col4a pregled (kolagena) i Lama2 Netlogu (laminin). Štoviše, sMCs eksprimiraju gene za adhezijskih molekula kao što Alcam
i Vcam1
, i gene za obične citoskeletnih proteina kao što je Acta2 pregled (aktin), dok MMCS izraziti desmosome dvokomponentne gene kao Dsc2
( desmocollin) i Dsg2 pregled (dezmogline) i geni za keratin intermedijarnih filamenata, kao što su Krt8 pregled i Krt19 pregled. Desmosoma su prijavili da budu prisutni u želučanom sluznicom [35], a utvrđeno je da su desmosome strukture nalik otkriti u određenoj vrsti MC [36]. Stoga je moguće da MMCS interakciju sa susjednim epitela adhezijom desmosomal u želucu. Nasuprot tome, sMCs pojavljuju u interakciji sa susjednim stanicama pomoću adhezijskih molekula kao što VCAM-1, ALCAM i VE-kadherin (Vcam1
, Alcam1
i Cdh5
). Budući da su ti adhezijske molekule je pokazano da su uključeni u dinamičkom regulaciju aktinskog citoskeleta [37, 38], takve molekule posredovane interakcije s submukozalnim stanica bi mogli biti kritični za održavanje funkcionalne i morfološka svojstva sMCs. Doista, valja napomenuti da je većina sMCs su promjenjive u formi, a često su rastegnut i navijanje, u usporedbi s MMCS [1]. Pregled Zaključak pregled osnovali smo metodu RNA pojačanje od skupljenih netaknutih MC-a koji su izdvojeni iz smrznutog tkiva sekcije, što nam omogućuje da jednostavno dobiti ekspresija gena uzorak MC-a iz različitih tkiva, organa, te vrsta, uključujući i ljude. Koristeći ovu metodu, pokazali smo po prvi puta na različita profila genske ekspresije submukozalnim i sluznice MC-u mišjem želudac. . Naša otkrića nude uvid u mogući neidentificirane svojstvima za svaki MC podrazreda pregled metoda
Materijali pregled Sljedeći materijali su dobiveni iz izvora navedeno: HPLC očisti T7- (dT) 24 primer [5 ' -GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGC GG (T) 24] iz GE Healthcare UK Ltd. (Buckinghamshire, Engleska), RNaza bez vode, dNTP, SusperScript II, Escherichia coli pregled (E. coli pregled) 'RNA-H, E . coli pregled DNA polimeraza i, E.coli
DNA ligaza, T4 DNA polimeraza, a slučajnih heksamera od Invitrogen (San Diego, CA), inhibitora RNaze, glikogena i MEGAscript T7 kit iz Ambion (Austin, TX). Balb /c miševi dobiveni su iz JapanClea (Hamamatsu, Japan). Ova studija je odobren od strane Odbora za istraživanje životinja Kyoto University Graduate School of Pharmaceutical Sciences. Pregled RNK amplifikacijom i oligonukleotida Microarray pregled Miš interleukin-3-ovisni BMMCs su pripremljeni kao što je prethodno opisano [39]. Ukupna RNA je ekstrahirana BMMCs koristeći RNeasy Mini Kita (Qiagen, Valencia, CA).

• Pacijent s rakom želuca s peritonejskom karcinomatoza tretirana s intraperitonealnim kemoterapije koja je preživjela više od 5 godina primio ponovljene laparoskopske preglede: slučaj report
• Imunizacija s imunodominantan Helicobacter suis ureazu B uzrokuje djelomičnu zaštitu protiv H. suis infekcije miša model